蜂膠復方產(chǎn)品對心肌肥厚改善機制的轉(zhuǎn)錄組學研究

孫燕如 - 韓鳴鳳 - 沈圳煌 - 吳珍紅2, -2, 繆曉青2, -2,

(1. 福建農(nóng)林大學生命科學學院，福建 福州 350002；2. 福建農(nóng)林大學蜂學學院，福建 福州 350002；3. 天然生物毒素國家與地方聯(lián)合工程實驗室，福建 福州 350002)

高血壓是世界范圍內(nèi)致死率最高的單因素疾病，會累及心臟、大腦、腎臟等靶器官[1]。由高血壓引起的左心室重構(gòu)是導致心臟衰竭、猝死和心肌梗死的一個獨立原因[2]。當心肌負荷增高時，心肌代償性改變，出現(xiàn)左心室的肥大，最終心肌的不適應(yīng)性變化發(fā)生，導致心肌重構(gòu)從而引發(fā)心臟衰竭。高血壓心肌肥厚與重構(gòu)過程中，心肌細胞壞死、凋亡、自噬，同時，纖維細胞的增殖和細胞外基質(zhì)的重組會引起心肌纖維化[3]。左心室重構(gòu)通常表現(xiàn)為心室壁增厚、心肌重量增加和心肌重塑[4]。目前，病理性心肌肥厚的分子機制尚未完全闡明，普遍認為當心臟受到機械牽張、壓力負荷、缺血缺氧等刺激時，多個信號通路共同參與到心肌肥厚中，其中胰島素信號通路是介導病理性心肌肥厚的主要通路[5]，在胰島素與胰島素受體結(jié)合后，活化的胰島素受體基質(zhì)與多個信號轉(zhuǎn)導蛋白相互影響，繼而激活了PI3K-Akt信號通路和MAPK信號通路。研究顯示，胰島素受體通路上的基因ERK[6-7]、PI3K、GSK3β[8-9]等都可能是改善心肌肥厚的作用靶點。

用蜂膠、蜂王漿、蜂巢提取液等藥食兩用的蜂產(chǎn)品與蜂毒按照中藥“君臣佐使”的配伍原則可復配制成一種蜂膠復方產(chǎn)品。前期試驗[10]證明，在離體蛙心上，該蜂膠復方產(chǎn)品可以增加蛙心收縮力從而改善心臟功能，其正性肌力類似于腎上腺素、可被鹽酸普萘洛爾抑制。在慢性心衰大鼠模型上，這一產(chǎn)品可以阻止慢性心衰進程且效果優(yōu)于臨床藥物右雷佐生[11]。此外，筆者在臨床使用中也發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)品有降壓的功效，但其機制尚不明確。自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)常用于高血壓的病理、藥理研究，其發(fā)病進程類似于人類的原發(fā)性高血壓[12-13]。因此，考慮選用SHR為高血壓大鼠模型，探究該產(chǎn)品對高血壓引起的心肌肥厚的改善效果及可能的機制。

本研究擬采用轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)，考察蜂膠復方產(chǎn)品對SHR大鼠心肌基因轉(zhuǎn)錄組水平上的差異變化，結(jié)合GO分析和KEGG通路分析，找到差異基因富集的主要代謝通路，為該蜂膠復方產(chǎn)品對SHR心肌肥厚的改善作用找到相應(yīng)機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

蜂毒：意大利蜜蜂蜂毒，福建省神蜂科技開發(fā)有限公司；

蜂膠：意大利蜜蜂采集自楊樹的蜂膠，福建省神蜂科技開發(fā)有限公司；

蜂王漿：油菜漿，福建省神蜂科技開發(fā)有限公司；

吐溫-80：分析純，國藥化學試劑有限公司；

乙醇、羧甲基纖維素鈉：化學純，國藥化學試劑有限公司；

RNA提取試劑盒：TransZol?Up型，北京全式金生物技術(shù)有限公司；

反轉(zhuǎn)錄試劑盒：TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser Kit型，寶生物工程(大連)有限公司；

熒光定量試劑盒：SYBR?Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)Kit型，寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

PCR儀：720 Thermal Cycler型，美國Thermo Fisher公司；

熒光定量PCR檢測系統(tǒng)：CFX384型，美國BioRad公司；

測序平臺：Hiseq 2500型，美國Illumina公司。

1.2 方法

1.2.1 蜂膠復方產(chǎn)品的配制

(1) 蜂膠醇提物制備：使用80%乙醇按料液比1∶4 (g/mL)對意大利蜜蜂采集的楊樹蜂膠浸提，浸提程序為：40 kHz 超聲預(yù)處理20 min，60 ℃浸提5 h，室溫浸提2 d；對浸提液真空抽濾后，濾液在50 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，除蠟操作后55 ℃下真空干燥至恒重，測定總黃酮含量為(302.16±2.33) mg/g。

(2) 蜂王漿醇提物制備：在40 ℃下使用95%乙醇按料液比1∶4 (g/mL)對油菜漿提取3 h，4 000×g離心20 min后，獲得上清、對沉淀物繼續(xù)按上述方法提取2次，最后合并濾液，65 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到蜂王漿醇提物后冷凍干燥備用，測得蜂王漿醇提物中10-羥基-2-癸烯酸(10-HDA)含量為(21.06±0.32)%。

(3) 蜂巢水提物制備：取意大利蜜蜂陳舊巢脾(使用3年)磨碎，按照料液比1∶5 (g/mL)加水煮沸1 h，過濾后濾渣繼續(xù)按上述方法處理2次，最終合并3次濾液，除蠟、濃縮、干燥至恒重。

(4) 蜂毒肽的制備：粗蜂毒溶于水后5 000 r/min離心15 min，取上清、冷凍干燥。采用葡聚糖凝膠柱層析法分離蜂毒，以0.1 mol/L 甲酸和甲酸銨緩沖液進行G25柱層析，對其中溶血活性較強的組分再進行G50柱層析，接著以0.02 mol/L 甲酸和甲酸銨緩沖液對分離產(chǎn)物進行G75柱層析，獲得電泳純級的終產(chǎn)物。

(5) 蜂膠復方產(chǎn)品的制備：蜂膠醇提物與蜂巢水提物按1∶1質(zhì)量比混合，加入2%吐溫-80后，添加蜂毒肽使得最終的產(chǎn)品中蜂毒肽含量為0.12%，接著加入與蜂膠醇提物質(zhì)量相等的蜂王漿醇提物。

1.2.2 動物分組與給藥 40只自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)，體重180～220 g，雄性，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXK(京)2011-0011。將40只大鼠隨機分為模型對照組(MC)、蜂膠復方產(chǎn)品低、中、高劑量組(分別為BYL-L、BYL-M、BYL-H)。按照“人與大鼠體表面積比”換算給藥劑量，見式(1)。蜂膠復方產(chǎn)品低、中、高劑量分別是臨床使用劑量的1，2，4倍，換算成大鼠給藥量分別約為0.5，1.0，2.0 g/kg。

(1)

式中：

c——大鼠給藥量，g/kg；

m——人給藥量，g/kg。

1.2.3 心臟樣本處理 各組大鼠給予相應(yīng)藥物5周，于末次給藥后斷食不斷水繼續(xù)飼養(yǎng)24 h，處死后剖取心臟，稱得心臟和左心室質(zhì)量后投入液氮，-80 ℃保存。通過SPSS v19.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，從蜂膠復方產(chǎn)品灌胃組中篩選出與MC組差異最大的試驗組，進入下一步試驗。

1.2.4 心肌轉(zhuǎn)錄組測序與結(jié)果分析

(1) RNA樣品制備與測序：待測組分別選取3只大鼠心臟樣本進行RNA提取，富集mRNA，加入fragmentation buffer使其成為短片段，再以片斷后的mRNA為模板，用六堿基隨機引物(random hexamers)合成cDNA第一鏈，并加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成cDNA第二鏈，經(jīng)過QiaQuick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫經(jīng)末端修復、加堿基A，加測序接頭，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段，并進行PCR擴增，從而完成整個文庫制備工作。構(gòu)建好的文庫用HiSeqTM2500型測序平臺進行測序。

(2) 差異基因的篩選：在信息分析前對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控，通過數(shù)據(jù)過濾來減少數(shù)據(jù)噪音。將組裝的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)與參考文件基因組進行比對分析，基因表達量的計算使用FPKM(Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads)法利用FDR與log2FC來篩選組間差異基因，篩選條件為FDR<0.05且|log2FC|>1。接著對差異基因進行功能富集分析與KEGG代謝通路分析。

(3) 功能富集及KEGG代謝通路分析：將差異表達基因向Gene Ontology(GO)數(shù)據(jù)庫(http://www.geneontology.org/)的各term映射，并計算每個term的基因數(shù)，然后用超幾何檢驗，找出與整個基因組背景相比、在差異表達基因中顯著富集的GO條目。將DEGs注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫中，根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫信息對DEGs進行KEGG通路注釋。

(4) qPCR對轉(zhuǎn)錄組結(jié)果的驗證：從DEGs中隨機挑選9個基因，通過qPCR結(jié)果來驗證RNA-Seq結(jié)果的可靠性。基因引物由廣州基迪奧生物技術(shù)有限公司設(shè)計并合成。RNA提取方法如前所述，接著，根據(jù)說明書操作，使用PrimeScript RT reagent Kit將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。接著，用SYBR染料法在Step One Plus Real-Time PCR System 上完成qPCR操作。以GADPH為內(nèi)參基因，使用2-△△ct法計算基因的相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂膠復方對SHR左心室指數(shù)的影響

給藥5周后，各組大鼠的心臟指數(shù)與左心室指數(shù)見表1，與MC組相比，BYL-H組的左心室指數(shù)有顯著差異(P<0.05)，而其他幾個給藥組雖然在左心室指數(shù)和心臟指數(shù)上有不同程度的減輕，但均無顯著差異(P>0.05)。因此，分別從MC組和BYL-H組中隨機選取3只大鼠的心臟進行轉(zhuǎn)錄組測序。

2.2 Illumina測序數(shù)據(jù)質(zhì)控與評估

對MC組和BYL-H組樣本Illumina測序，過濾后獲得的有效讀段均在95.82%以上，兩端Q30在89.5%以上，過濾后的數(shù)據(jù)有88.42%以上能比對到參考基因組上(表2)，表明測序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高。

2.3 DEGs的GO分析

與MC組相比，從BYL-H組篩選出1 297個DEGs，其中91個DEGs上調(diào)、1 206個DEGs下調(diào)。對所有DEGs進行GO注釋，包括分子功能、細胞組分、生物過程三類。在生物過程中，注釋到發(fā)育進程(developmental process)、生物黏附(biologicaladhesion)、運動(locomotion)、細胞成分組織或生物發(fā)生(cellular component organization or biogenesis)、定位(localization)、代謝進程(metabolicprocess)、單一機體進程(single-organismprocess)、生物調(diào)節(jié)(biological regulation)、細胞進程(cellular process)、生長(growth)、免疫進程(immune system process)、應(yīng)激反應(yīng)(response to stimulus)、信號傳遞(signaling)、生殖(reproduction)、多種機體進程(multi-organism process)、行為(behavior)、多細胞生物過程(multicellularorganismalprocess)的DEGs數(shù)目分別為410，116，138，351，346，593，720，444，886，69，147，469，403，84，34，1，152(圖1)。

表1蜂膠復方產(chǎn)品對SHR心臟指數(shù)與

左心室指數(shù)的影響?

Table 1 Effect of the propolis product on heeart index and left ventricular index in SHRs (n=10)

組別左心室指數(shù)組別左心室指數(shù)MC0.280±0.015BYL-M0.276±0.014BYL-L0.280±0.010BYL-H0.267±0.013*

? *表示與模型組相比，P<0.05。

表2 測序數(shù)據(jù)分析Table 2 Analysis of transcriptome sequencing data

1. 行為 2. 生物黏附 3. 生物調(diào)節(jié) 4. 細胞成分組織或生物起源 5. 細胞進程 7. 生長 8. 免疫進程 9. 定位 10. 運動 11. 代謝過程 12. 多種機體進程 13. 多細胞生物過程 14. 生殖 15. 應(yīng)激反應(yīng) 16. 信號傳遞 17. 單一機體進程 18. 細胞 19. 細胞連接 20. 細胞組件 21. 細胞外基質(zhì) 22. 細胞外基質(zhì)成分 23. 胞外區(qū) 24. 細胞外區(qū)域部分 25. 離子配合物 26. 細胞膜 27. 細胞膜零件 28. 細胞膜內(nèi)腔 29. 細胞器 30. 細胞器零件 31. 突觸 32. 突觸零件 33. 結(jié)合 34. 催化活性 35. 分子傳感器活性 36. 分子功能調(diào)節(jié)器 37. 核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性 38. 信號傳感器活性 39. 結(jié)構(gòu)分子活性 40. 轉(zhuǎn)錄因子活性，蛋白質(zhì)結(jié)合 41. 轉(zhuǎn)運活性

圖1 GO term分類結(jié)果

Figure 1 Results of GO term classification

2.4 DEGs的KEGG富集分析

不同基因之間相互協(xié)調(diào)，方得以行使生物學功能，基于pathway的分析有助于更進一步了解基因的生物學功能。對所有DEGs進行KEGG富集，共有410個DEGs(24個上調(diào)、386個下調(diào))可富集到KEGG數(shù)據(jù)庫，說明給予蜂膠復方產(chǎn)品后引起了多個代謝通路的變化，圖2列出了差異最顯著的前20個pathway。在前10個pathway中，富集到黏著斑、胰島素信號通路、長壽調(diào)節(jié)通路-多個物種、長壽調(diào)節(jié)通路-哺乳動物、細胞外基質(zhì)受體相互作用、PI3K-Akt信號通路、肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)、唾液分泌、背腹軸形成、MAPK信號通路的DEGs數(shù)目分別為36，24，15，18，17，39，28，14，8，31，提示該蜂膠復方產(chǎn)品可能在炎癥反應(yīng)、能量代謝、信號轉(zhuǎn)導等方面對SHR心肌產(chǎn)生影響。有趣的是，DEGs富集較多的3個代謝通路——PI3K-Akt信號通路、胰島素信號通路、MAPK信號通路是介導病理性心肌肥厚的主要通路[5]。PI3K-Akt信號通路和MAPK通路是胰島素和胰島素受體結(jié)合后，經(jīng)不同信號蛋白轉(zhuǎn)導而激活的兩個主要通路，與胰島素信號通路密切相關(guān)，提示蜂膠復方產(chǎn)品可能通過影響胰島素相關(guān)信號通路而改善SHR心肌肥厚。

圖2 差異基因富集顯著的前20個KEGG富集圖Figure 2 Top 20 KEGG enriched graph with significant DEGs

2.5 胰島素信號通路相關(guān)基因的篩選

圖3是胰島素信號通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路重疊基因的韋恩圖。3個通路共同的DEGs是mitogen activated protein kinase 1 (MAPK1)；胰島素信號通路與PI3K-Akt通路共同的DEGs為：phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1(Pik3r1)、protein kinase AMP-activated catalytic subunit alpha 2 (Prkaa2)、insulin receptor substrate 1 (Irs1)、glycogen synthase kinase 3 beta (Gsk3b)、3-phosphoinositide dependent protein kinase-1 (Pdpk1)、tuberous sclerosis 1(Tsc1)；胰島素信號通路與MAPK通路共同的DEGs為：crk-like protein-like、CRK proto-oncogene, adaptor protein (Crk)、protein kinase cAMP-activated catalytic subunit beta (Prkacb)。與MC組相比，以上各差異基因在BYL-H組中均為下調(diào)(表3)。

胰島素信號通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK通路共同的DEG為MAPK1，即ERK2。心肌肥厚的過程中，心臟的機械負荷增加，局部和系統(tǒng)的神經(jīng)體液因子、細胞因子和生長因子增加，機械和神經(jīng)內(nèi)分泌的效應(yīng)器通過伸展、G蛋白偶聯(lián)受體和酪氨酸激酶來誘導多種細胞內(nèi)信號包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)路的激活[14]。由于大多數(shù)刺激引起心肌肥厚的刺激，也會在ERK1和ERK2激酶激活環(huán)內(nèi)引發(fā)一種急性磷酸化作用，導致它們的激活，因此ERKs長期以來被認為是心臟肥大的促進劑[14]。在本試驗中，BYL-H心肌的ERK2的表達量與MC組的相比，顯著降低，與異鉤藤堿[6]、法舒地爾[15]等降低ERK2mRNA表達量、改善心臟功能的結(jié)果一致。

胰島素和胰島素受體結(jié)合會導致胰島素受體底物(IRS)的酪氨酸磷酸化，激活的胰島素受體與IRS和其他蛋白相互作用，激活包括PI3K-Akt和MAPK通路在內(nèi)的多個通路。心臟中，IRS1和IRS2是表達量最高的IRS蛋白，對胰島素調(diào)控激活PI3K起重要作用[16]。PI3K由p110催化亞基和p85調(diào)控子單元組成，催化生成脂質(zhì)產(chǎn)物PIP3，進而導致PDK1調(diào)控的Akt的激活。Akt通過磷酸化蛋白來調(diào)節(jié)各種細胞過程，在心臟中表達最多的是Akt1和Akt2，前者主要調(diào)控體細胞生長，后者主要與代謝相關(guān)。由Akt介導的磷酸化作用抑制了GSK3β活性，從而促進了心臟肥大和糖原的合成；Akt介導調(diào)節(jié)的TSC1磷酸化可調(diào)控mTOR的激活，而mTOR激活后可促進蛋白質(zhì)的合成。胰島素信號通路中，與IRS相互作用的其他轉(zhuǎn)導蛋白包括GRB2，GRB2是導致MAPK激活的SOR、RAS、RAF和MEK串聯(lián)的一部分，MAPK通路在細胞增殖、分化、遷移中起著重要作用。在試驗中，BYL-H組心臟樣本中的IRS1、PI3Kγ、GSKβ等胰島素信號通路與PI3K-Akt信號通路的重要基因的表達量相較于MC組明顯下降。PI3K是一種細胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，調(diào)節(jié)細胞功能。PI3K有多個亞型，其中PI3K-α和γ在心臟中表達、且發(fā)揮重要作用，抑制PI3K-γ可保護心衰時β1-AR下調(diào)而改善心肌功能[17]。GSK3β是多種重要信號轉(zhuǎn)導過程中起關(guān)鍵作用的酶[18]。心肌肥大過程中，細胞外刺激信號激活了PI3K-Akt通路中的Akt，造成其下游GSK3β磷酸化、導致GSK3β的失活，進而導致心肌肥大的發(fā)生。GSK3β在Tyr216位點磷酸化時，GSK3β活性增加，而在Ser9位點磷酸化時，GSK3β活性受到抑制，活化的GSK3β可以阻止心肌肥厚的發(fā)展[19]。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明，當灌胃蜂膠復方產(chǎn)品后，GSK3β在SHR心肌中的表達量下降了，但GSK3β的活性是否改變、如何改變需要進一步研究。

3個KEGG通路分別是：Insulin，胰島素信號通路；PI3K-Akt，PI3K-Akt信號通路；MAPK，MAPK信號通路

圖3 DEGs富集數(shù)目最多的前3個KEGG通路中重疊的基因 Figure 3 Overlapping genes in the top 3 KEGG pathway表3 胰島素信號通路與PI3K-Akt信號通路和MAPK信號通路的重疊DEGsTable 3 Overlapping DEGs of insulin signaling pathway with PI3K-Akt signaling pathway and/or MAPK pathway

2.6 qPCR驗證結(jié)果

為證實RNA-Seq數(shù)據(jù)的可靠性，隨機挑選9個基因進行qPCR驗證。這9個基因分別是Gadd45g(Gene ID: 291005 )、MAPK1 (Gene ID: 116590)、Eif4g1 (Gent ID: 287986)、Otud1 (Gene ID: 498803 )、Clic4 (Gene ID: 83718)、Usmg5 (Gene ID: 103693430)、Mt-nd4 (Gene ID: 26201)、Mt-nd3 (Gene ID: 26199 )、Mt-atp6 (Gene ID:26197)。如圖4所示，經(jīng)qPCR驗證，這些被選基因的相對定量表達模式與RNA-Seq測序結(jié)果一致，表明測序結(jié)果是可靠的。

3 結(jié)論

本試驗以SHR為受試動物，通過左心室指數(shù)的計算確定蜂膠復方產(chǎn)品對心肌肥厚的干預(yù)效果，及藥效最佳劑量組(BYL-H組)。接著使用RNA-Seq技術(shù)對BYL-H組和MC組的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析，找出了1 297個DEGs，將這些DEGs進行KEGG代謝通路富集分析，發(fā)現(xiàn)富集到與胰島素代謝相關(guān)的幾個通路(即胰島素信號通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路)上的DEGs數(shù)目較多，提示蜂膠復方產(chǎn)品可能通過調(diào)節(jié)胰島素代謝通路改善SHR的心肌肥厚，而在胰島素信號通路上對ERK2、PI3K-γ等下調(diào)表達的效果可能是蜂膠復方產(chǎn)品作用到SHR心肌肥厚的靶點。

圖4 基因相對定量結(jié)果Figure 4 Relative gene expression levels of candidate genes. Data from qPCR and RNA-Seq both are means of three replicates

后續(xù)研究還可以從該蜂膠復方產(chǎn)品對ERK2、PI3K-γ等基因的磷酸化和非磷酸化蛋白的表達水平差異入手，對相關(guān)基因的激活或抑制情況作進一步探究。

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