雞樅菌不同溶劑提取物成分分析及抗氧化作用研究

栗銘鴻 - 李官浩 - 樸守煥 - 崔福順 -

(1. 延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133002；2. 延邊百草藥材有限公司，吉林 琿春 133300)

雞樅菌[Termitomycesalbuminosus(Berk.)Heim]，又名蟻樅、雞絲菇、傘把菇等，屬擔子菌綱，傘菌目，口蘑科，蟻巢傘屬[1]。雞樅菌肉厚肥碩，質細絲白，味道鮮甜香脆；含有蛋白37.8%、脂肪5.1%[2-3]，是一種高蛋白、低脂肪、低纖維的食用菌[4-5]，并含有氨基酸、維生素和鈣、磷、核黃酸等物質[6-7]。目前國內外對雞樅菌的研究主要集中在多糖的提取[8-10]；多糖的抗氧化[11-13]、降血脂[14]、免疫功能[15]、抗腫瘤[16]及其他生物活性[17-19]。而對雞樅菌中其他生物活性物質含量、功能等研究較少。食用菌中常見的活性成分主要包括多糖、酚類、萜類等。近代研究發(fā)現(xiàn)食用菌中麥角甾醇、腺苷也具有很好的生物活性。Kang等[20]、高虹等[21]發(fā)現(xiàn)麥角甾醇具有很好的抑制腫瘤作用；Ye等[22]研究表明腺苷具有抗氧化作用。因此，本研究通過8種不同極性溶劑提取雞樅菌，分析雞樅菌提取物中4種活性物質及抗氧化作用，探討其成分、含量與生物活性的關聯(lián)性，為雞樅菌進一步開發(fā)利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞樅菌：2017年2月采集于延邊大學農(nóng)學院實驗基地；

沒食子酸標準品：97.5%，美國Sigma公司；

腺苷標準品：99.7%，中國食品藥品檢定研究院；

蘆丁標準品：98%，上海源葉生物科技有限公司；

DPPH、ABTS、福林酚試劑、過硫酸鉀等：≥98%，美國Sigma公司；

乙腈：色譜級，美國Mreda公司；

其他試劑為分析純。

1.2 儀器與設備

紫外可見分光光度計：UV-1800型，上海美譜達儀器有限公司；

高效液相色譜儀：LC-2010型，日本島津儀器有限公司；

大容量速凍離心機：Z400K型，德國哈默有限公司；

電熱恒溫鼓風干燥箱：DHG-90731型，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；

冷凍干燥機：FD-1A型，北京博醫(yī)康試驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取物制備及得率計算 將采集的雞樅菌去根土、干燥、粉碎、過20目篩。稱重后以料液比1∶12 (g/mL)分別加入8種不同極性溶劑(蒸餾水、甲醇、無水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷、正丁醇和石油醚)，混勻，搖床振蕩提取(搖床轉速110 r/min，溫度50 ℃)6 h，于4 000 r/min離心20 min，過濾；濾渣中加入溶劑再提取1次；合并濾液，用相應溶劑定容制得提取液。一部分用于含量測定及抗氧化試驗；另稱取3份等體積各自恒溫(50 ℃)干燥至恒重，稱量質量，按式(1)計算提取物得率。

(1)

式中：

w——提取物得率，%；

m1——濃縮干燥樣品和平皿的質量，g；

m2——平皿的質量，g；

m3——折算的原料質量，g。

1.3.2 功效成分含量的測定

(1) 總黃酮：參照文獻[23]的方法，以蘆丁為標準品，繪制標準曲線，并測定樣品中總黃酮含量。得到的標準曲線方程為：y=0.002 9x+0.005 2，R2=0.998 3?？傸S酮含量以mg RTE/g 表示。

(2) 總酚：參照文獻[24]的方法，以沒食子酸為標準品，繪制標準曲線，并測定樣品中總酚含量。得標準曲線方程為：y=0.015x-0.074 1，R2=0.997 6?？偡雍恳詍g GAE/g 表示。

(3) 麥角甾醇：采用HPLC法。色譜條件：色譜柱：InerSustain?C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流速：0.8 mL/min，檢測波長：283 nm，進樣量10 μL，柱溫：30 ℃，流動相：甲醇，等濃度洗脫[20]。

標準曲線的制作：精密稱取0.175 mg標準品，用甲醇溶解并定容至10 mL，吸取1 mL過0.45 μm濾膜，備用。分別設定進樣量為5，10，15，20 μL，在上述色譜條件下測定麥角甾醇峰面積；并且以標準品溶液進樣量(x)為橫坐標，得到的峰面積積分值(y)為縱坐標繪制標準曲線，得到的標準曲線方程為：y=303 142x+2 232.3，R2=0.999 9。

(4) 腺苷含量：采用HPLC法。色譜條件：色譜柱：InerSustain?C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流速：0.8 mL/min，檢測波長：260 nm，進樣量10 μL，柱溫：30 ℃，流動相：A：15%甲醇；B：85%水，等濃度洗脫[25]。

標準曲線的制作：精密稱取0.19 mg腺苷標準品，用流動相溶解，并定容于10 mL容量瓶中。吸取1 mL過0.45 μm 濾膜，備用。分別設定進樣量為2，4，6，8，10 μL，在上述色譜條件下測定峰面積，以標準品溶液進樣量(x)為橫坐標，得到的峰面積積分值(y)為縱坐標繪制標準曲線，得到標準曲線方程為：y=200 039x-27 756，R2=0.997 2。

1.3.3 抗氧化活性的測定

(1) 總抗氧化能力：參照文獻[11]。

(2) DPPH·清除能力：參照文獻[23]。

(3) ABTS+·清除能力：參照文獻[13]。

(4) 羥自由基清除能力：采用水楊酸法[12]。

(5) 總還原力：參照文獻[11]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行方差分析并進行LSD多重比較，所有測定進行3次重復。

2 結果與分析

2.1 提取物得率及活性成分含量

提取物得率及成份含量結果見表1。由表1可知，極性溶劑中蒸餾水的提取物得率、總酚及腺苷含量最高；正己烷提取物中總黃酮含量最高；甲醇提取物中麥角甾醇含量最高。

不同極性溶劑提取物中總酚呈現(xiàn)出溶劑極性越大，含量越高的趨勢?？偡雍看笮∫来螢檎麴s水>甲醇>乙醇>丙酮>正丁醇>乙酸乙酯>正己烷=石油醚?？梢酝茢嚯u樅菌中酚類主要以極性酚為主。這與涂宗財?shù)萚23]研究紅薯葉不同極性溶劑與提取物總酚含量的結論一致。盧彩會等[26]研究黑皮雞樅菌時也得出水提物多酚含量(5.50 mg/g)大于醇提物，且含量高于本研究結果，可能是品種、產(chǎn)地等差異造成的。

表1 不同極性溶劑提取物得率及成分含量?Table 1 The yield and content of different solvent extracts

? 同列不同字母表示差異顯著P<0.05。

不同極性溶劑提取物中總黃酮含量大小依次為正己烷>石油醚>甲醇>蒸餾水=乙醇=丙酮=乙酸乙酯>正丁醇。極性最弱的正已烷和石油醚提取物中總黃酮含量最高；中等極性的正丁醇提取物中總黃酮含量最低。說明雞樅菌中總黃酮主要以弱極性為主。盧彩會等[26]研究得出70%醇提物中黃酮含量為23.1 mg/g，而水提物中為0 mg/g，與本研究結果不一致。

不同極性溶劑提取物中麥角甾醇含量大小依次為甲醇>乙酸乙酯=丙酮=乙醇=石油醚>正己烷=正丁醇。在甲醇提取物中含量最高，蒸餾水提取物中沒有檢出。這與麥角甾醇易溶于甲醇，不溶于水相符。可以得出雞樅菌不同極性溶劑提取物中麥角甾醇含量與極性大小沒有相關性。不同極性溶劑提取物中腺苷含量最高的為極性較大的蒸餾水和甲醇；弱極性石油醚和正已烷中沒有檢出；其他溶劑提取物中含量較少，差異不顯著。這與腺苷易溶于極性溶劑相符。高賞[27]在雞樅菌代謝產(chǎn)物中分離鑒定了麥角甾醇和腺苷，并證明麥角甾醇具有較好的抑菌活性。

2.2 抗氧化作用

2.2.1 總抗氧化能力 在酸性條件下，抗氧化活性物質可以將Mo6+還原為Mo5+，隨即Mo5+與磷酸形成磷酸-Mo5+的綠色復合物；體系顏色越深，吸光度會越大，說明抗氧化活性就越高。由圖1可知，隨著溶劑極性的減弱，吸光度值也呈下降趨勢，雞樅菌總抗氧化能力越來越弱。蒸餾水和甲醇提取物的抗氧化活性較高；蒸餾水提取物的總抗氧化能力與濃度0.25 mg/mL的 VC和0.40 mg/mL的 BHA相當。

圖1 不同極性溶劑提取物的總抗氧化能力Figure 1 The antioxidant capacity of extracts from different polar solvents

2.2.2 DPPH·清除能力 DPPH作為一種穩(wěn)定的自由基，其醇溶液呈紫色，并在波長517 nm處有強吸收。當反應體系中有自由基清除劑存在時與DPPH單電子配對而使其顏色變淺，以此可用分光光度法進行定量分析。雞樅菌不同極性溶劑提取物對DPPH·清除效果見圖2。由圖2可知，隨著溶劑極性變小，清除率也隨著下降；乙酸乙酯提取物清除率最低；隨后弱極性溶劑石油醚和正己烷提取物的清除率又呈現(xiàn)上升的趨勢。蒸餾水提取物對 DPPH·的清除率最好，與濃度為0.10 mg/mL VC的清除效果相當，高于濃度為0.10 mg/mL 的BHA；甲醇提取物也表現(xiàn)出較好的清除效果。對DPPH·清除率大小依次為蒸餾水=0.10 mg/mL VC>0.10 mg/mL BHA>甲醇>0.01 mg/mL VC>乙醇>0.01 mg/mL BHA>正己烷>石油醚=丙酮=正丁醇>乙酸乙酯。這個順序與不同極性溶劑中總酚含量的順序基本一致；但不同于總黃酮含量排序。由此可以推測，DPPH·的清除效果可能與總黃酮含量無關，而與總酚含量有關；還有可能是提取物中酚類物質不同，或還有多糖類等其他成分在起作用。

圖2 不同極性溶劑提取物對DPPH自由基清除作用Figure 2 Scavenging effect on DPPH of different polar solvent extracts

2.2.3 ABTS+·清除能力 ABTS在氧化劑作用下會氧化成綠色的ABTS+·，當有抗氧化劑存在時，ABTS+·的產(chǎn)生會被抑制，顏色發(fā)生變化。雞樅菌不同極性溶劑提取物對ABTS+·清除作用見圖3。由圖3可知，不同極性提取物對ABTS+·清除率大小依次為0.10 mg/mL VC=蒸餾水=0.10 mg/mL BHA=甲醇>0.03 mg/mL VC>0.03 mg/mL BHA>乙醇>正丁醇>丙酮>石油醚=乙酸乙酯>正己烷。結果按極性可分為三部分，極性大的蒸餾水和甲醇提取物清除效果最好，與0.10 mg/mL VC效果相當；中等極性溶劑清除效果一般；極性小的石油醚等清除效果最差?？傮w上呈現(xiàn)出溶劑極性越大，提取物清除能力越強。這與雞樅菌中總酚含量的順序也基本一致。

圖3 不同極性溶劑提取物對ABTS+·清除作用Figure 3 Scavenging effect on ABTS+· of different polar solvent extracts

2.2.4 羥自由基清除能力 水楊酸法是利用亞鐵離子與過氧化氫混合后產(chǎn)生羥自由基，而加入到反應體系中的水楊酸可以捕捉羥自由基，并且會產(chǎn)生有色的產(chǎn)物。若加入到反應體中的樣品具有可以清除羥自由基的作用時，會與體系中水楊酸爭奪羥自由基，降低有色產(chǎn)物的生成量，顏色變淺。不同極性溶劑提取物對羥自由基清除作用見圖4。由圖4可知，不同溶劑對羥自由基清除大小依次為0.4 mg/mL VC=蒸餾水>0.2 mg/mL VC>甲醇>石油醚=乙酸乙酯=8.0 mg/mL BHA>3.0 mg/mL BHA=正己烷>丙酮>正丁醇>乙醇。溶劑中極性最大的蒸餾水具有最好的清除羥自由基的能力，與0.4 mg/mL VC效果相當；極性小的石油醚等清除效果次之；而中等極性的溶劑清除效果最差。

圖4 不同極性溶劑提取物對羥自由基清除作用Figure 4 Scavenging effect on hydroxyl radicals of different polar solvent extracts

2.2.5 總還原能力 鐵氰化鉀法是利用當反應體系中有抗氧化劑時，會使復合物中的Fe3+變成為Fe2+，而Fe2+復合物在波長700 nm處有最大吸收。因此，吸光度值越大，說明還原能力越強。由圖5可知，隨著溶劑極性的減弱，吸光度值也呈下降的趨勢，雞樅菌總還原能力越來越弱。不同極性溶劑中總還原能力大小依次為0.10 mg/mL VC=蒸餾水>0.25 mg/mL BHA>甲醇>乙醇>丙酮>石油醚正丁醇>正己烷=乙酸乙酯。蒸餾水提取物的吸光度大，總還原能力強，與0.10 mg/mL VC相當。這與雞樅菌中總酚含量的順序也基本一致。

綜合以上結果可以得出，雞樅菌不同溶劑提取物抗氧化作用溶劑極性越大，提取物清除能力越強；溶劑極性越小，提取物清除能力越弱。抗氧化能力與總酚含量呈正相關；麥角甾醇和腺苷在極性較大的甲醇提取物中含量很高?？梢灶A測，雞樅菌中主要活性成分為極性大的物質。Fedia等[28]、肖星凝等[29]研究發(fā)現(xiàn)，食用菌中麥角甾醇和酚類含量較高時表現(xiàn)出更好的抗氧化活性。這與本研究結果相一致。

圖5 不同極性溶劑提取物總還原能力Figure 5 The reducing power of different polar solvent extracts

3 結論

通過對雞樅菌8種不同極性溶劑提取物中生物活性成分及其抗氧化活性進行分析，得出雞樅菌不同極性溶劑提取物中得率最高的為蒸餾水提取物(36.150%)；不同極性溶劑提取物中總黃酮、總酚、麥角甾醇、腺苷含量最高的分別為正己烷提取物(7.500%)、蒸餾水提取物(2.410%)、甲醇提取物(0.207%)及蒸餾水提取物(0.499%)。說明雞樅菌中生物活性成分總酚、麥角甾醇及腺苷等更易溶于極性大的溶劑中；同時溶劑極性不同，抗氧化能力也不同；溶劑極性越大，抗氧化能力越強。因此，可以選擇極性大的溶劑對雞樅菌中的抗氧化成分進行提取及開發(fā)利用。

目前對雞樅菌抗氧化作用的研究主要集中在多糖，而其他活性成分與抗氧化性間的相互關系還少見報道。本試驗得出不同極性溶劑提取物的綜合抗氧化能力與總酚含量呈正相關；極性大的提取物中還含有較高的麥角甾醇、腺苷等活性成分；總黃酮含量與溶劑極性及抗氧化能力無關。說明雞縱菌抗氧化作用不能只用單一物質含量進行衡量，值得進一步研究。

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