陳皮總黃酮提取及抑菌活性初探

王慧芳,邵圣娟,王 曼,孟戎茜,郭月艷,鄭佳楠,衛(wèi)靜莉

(太原工業(yè)學(xué)院化學(xué)與化工系,山西太原 030008)

陳皮又名橘皮,分布于長(zhǎng)江以南各地區(qū),藥材分“陳皮”和“廣陳皮”,含有揮發(fā)油、橙皮甙、維生素B、C、E等營(yíng)養(yǎng)成分[1-2]。陳皮中的黃酮類(lèi)化合物主要有橙皮苷、新橙皮苷、川陳皮素和桔皮素等[3],具有抑菌、抗氧化、抗腫瘤等作用,不但可用于降低膽固醇、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等,還可作為保健因子添加到飼料和食品中,因此,從陳皮中提取黃酮類(lèi)物質(zhì)已成為人們研究的熱點(diǎn)[4-6]。目前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者提取陳皮黃酮方法主要有溶劑熱法、酶法、超聲、微波輔助法[7-8]等,其中,微波提取法因速度快、能耗低、溶劑用量少、選擇性高、污染小等優(yōu)點(diǎn)而成為生物提取的有效方法之一[9]。陳皮的提取對(duì)象主要集中在橙皮苷、川陳皮素、多甲氧基黃酮等,都存在溶劑用量大、提取溫度高等問(wèn)題,如:黃智等[10]比較了超聲法和微波輔助法提取陳皮中橙皮苷的工藝條件,兩種最佳工藝中的料液比均為1∶50 g/mL,逄顯娟等[11]采用溶劑熱法提取陳皮中橙皮苷的料液比為1∶70 g/mL,提取溫度為120 ℃。另外,科研工作者們還對(duì)陳皮黃酮的抗氧化性活性進(jìn)行了較為全面、深入的研究[12],而其抑菌性能方面的研究則相對(duì)較少。

響應(yīng)面法是目前常用的一種數(shù)據(jù)處理、分析方法,廣泛應(yīng)用于生物、化工、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[13-15]。本實(shí)驗(yàn)采用BBD法優(yōu)化了陳皮黃酮的微波提取工藝,從5種大孔樹(shù)脂中篩選出適宜的樹(shù)脂對(duì)陳皮粗提液中的總黃酮進(jìn)行分離提純,并對(duì)純化后的黃酮進(jìn)行抑菌活性研究,系統(tǒng)考查陳皮總黃酮的提取與抑菌活性,以期為深入研究陳皮黃酮產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 材料與儀器

陳皮 安徽省豪州市購(gòu)于太原萬(wàn)民藥房;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98% 上海金穗生物科技有限公司;茶多酚，純度≥98% 今品化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司;無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、氯化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、濃鹽酸等，均為分析純 天津化學(xué)試劑廠(chǎng);HP-20、HPD-100、AB-8、X-5、NKA-Ⅱ型大孔樹(shù)脂 鄭州華溢有限公司;大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC 25922、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Tpb55菌株 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心;金黃色葡萄球菌株(Staphylococcusaureus)ATCC26112 中國(guó)醫(yī)學(xué)菌種保藏中心。

XH-100A型微波催化合成/萃取儀 北京祥鵠科技;FA-2104型電子天平 上海舜宇恒平;722S型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海棱光;HHW-4-數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州丹瑞;THZ-82恒溫振蕩儀 國(guó)華企業(yè);DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海雷韻儀器;LDZX-30KBS型高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 陳皮黃酮的提取 將陳皮干燥、粉碎、過(guò)篩(50目)后,秤取0.5 g陳皮粉加入到一定體積濃度的乙醇溶液中,室溫下靜置30 min,在一定溫度下微波輔助提取一定時(shí)間后,抽濾,得黃酮粗提液。提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于50 ℃下蒸出溶劑后,在30 ℃的恒溫干燥箱中干燥1 d得干品。

1.2.2 黃酮含量的測(cè)定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 按姜昭等[16]的方法:繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),回歸曲線(xiàn)方程為:y=8.517x+0.0062,R2=0.9992。

1.2.2.2 黃酮含量的測(cè)定 按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的方法測(cè)提取液的吸光度,并計(jì)算其含量。黃酮得率的計(jì)算見(jiàn)式1:

式(1)

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 以黃酮得率為標(biāo)準(zhǔn),考查微波功率、乙醇體積濃度、料液比、微波時(shí)間、提取溫度等五個(gè)因素對(duì)陳皮總黃酮得率的影響,每組實(shí)驗(yàn)平行三次,取其平均值。

1.2.3.1 微波功率的篩選 取0.5 g陳皮粉于60%的乙醇溶液中,料液比(g/mL)1∶10,靜置30 min后,水浴加熱至50 ℃后,微波功率分別為:300、400、500、600、700、800 W,微波提取3 min,考察微波功率對(duì)陳皮黃酮得率的影響。

1.2.3.2 乙醇濃度的篩選 取0.5 g陳皮粉于不同乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%、90%)溶液中,料液比(g/mL)1∶10,水浴加熱至50 ℃后,微波功率600 W,微波時(shí)間3 min,考察乙醇濃度對(duì)陳皮黃酮得率的影響。

1.2.3.3 料液比的篩選 取0.5 g陳皮粉于60%的乙醇溶液中,不同料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30) g/mL,靜置30 min后,水浴加熱至50 ℃后,微波功率600 W,微波提取3 min,考察料液比對(duì)陳皮黃酮得率的影響。

1.2.3.4 微波時(shí)間的篩選 取0.5 g陳皮粉于60%的乙醇溶液中,料液比(g/mL)1∶10,靜置30 min后,水浴加熱至50 ℃后,微波功率600 W,微波提取1、2、3、4、5、6 min,考察微波時(shí)間對(duì)陳皮黃酮得率的影響。

1.2.3.5 提取溫度的篩選 取0.5 g陳皮粉于60%的乙醇溶液中,料液比(g/mL)1∶10,靜置30 min后,水浴加熱至不同溫度(30、40、50、60、70 ℃)后,微波功率600 W,微波時(shí)間3 min,考察提取溫度對(duì)陳皮黃酮得率的影響。

1.2.4 BBD實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取對(duì)陳皮黃酮得率影響較顯著的微波功率(A)、微波時(shí)間(B)、提取溫度(C)、液料比(D)四個(gè)單因素變量,進(jìn)行四因素三水平BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),設(shè)計(jì)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 1 Factors and levels of BBD experiments

1.2.5 陳皮黃酮的純化 將HP-20型樹(shù)脂按崔蕊靜等[17]的方法預(yù)處理操作后,在上樣液pH=3.5、上樣液流速為2 mL/min、上樣液濃度為0.4 mg/mL、洗脫流速 2 mL/min、洗脫液乙醇體積濃度60%的條件下,對(duì)陳皮黃酮提取液進(jìn)行吸附、解吸實(shí)驗(yàn),重復(fù)三次,計(jì)算純化后的陳皮黃酮干品。并按朱孔岳等[13]的方法,將純化后的陳皮黃酮干品與粗提物干品均配成1 mg/mL的溶液,在λ=510 nm處測(cè)定其吸光度,對(duì)照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)確定其純度。相關(guān)計(jì)算公式見(jiàn)式2:

式(2)

1.2.6 抑菌活性測(cè)試

1.2.6.1 菌種的擴(kuò)培 用移液槍分別移取1 mL大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌種原液,注入50 mL BPDA培養(yǎng)基中,于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后冷藏備用。

1.2.6.2 抑菌活性實(shí)驗(yàn) 純化后的陳皮黃酮干品與茶多酚均以95%乙醇為溶劑配制成不同濃度的溶液,采用濾紙片法[19]測(cè)試其抑菌活性,并設(shè)置無(wú)藥空白對(duì)照,以消除溶劑對(duì)測(cè)試結(jié)果的干擾,每組平行做3組,取平均值。在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后取出,用游標(biāo)卡尺十字交叉測(cè)兩次抑菌圈直徑,取其平均值。抑菌圈直徑的測(cè)量方法見(jiàn)式3:

抑菌圈直徑=抑菌圈外徑-濾紙片直徑

式(3)

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 7.0和SAS 9.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 陳皮黃酮提取的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 微波功率的篩選 由圖1可知,隨著微波功率的增大,微波的離子傳導(dǎo)作用增強(qiáng),分子熱運(yùn)動(dòng)逐漸加強(qiáng),陳皮的細(xì)胞膜被逐步破壞,黃酮浸出率增大,黃酮得率隨之增大,在微波功率600 W時(shí)達(dá)到最大。當(dāng)功率再增大時(shí),強(qiáng)烈的熱效應(yīng)會(huì)造成黃酮的分解[20],從而導(dǎo)致黃酮得率下降,故選擇微波功率為600 W。

圖1 微波功率對(duì)黃酮得率的影響Fig.1 Effect of microwave power on the yield of flavonoids

2.1.2 乙醇濃度的篩選 由圖2可知,陳皮中總黃酮得率隨乙醇濃度的增加而先增大后減小。原因在于:乙醇的極性與黃酮接近,隨著乙醇體積濃度的增大,陳皮黃酮逐漸被溶出,到乙醇濃度為60%時(shí)達(dá)到溶解平衡,黃酮得率最大1.21%。而當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增大時(shí),溶液滲透壓也隨之增大,其它雜質(zhì)也會(huì)相繼溶出,導(dǎo)致黃酮得率迅速下降,故選擇乙醇體積濃度為60%。

圖2 乙醇濃度對(duì)黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ethanol volume on yield of flavonoids

2.1.3 料液比的篩選 由圖3可知,陳皮中總黃酮的提取得率隨料液比的變化規(guī)律也是先增大后減小。原因在于:隨著乙醇用量的增加,溶劑的傳質(zhì)動(dòng)力也隨之增加,有利于黃酮類(lèi)化合物的溶出,當(dāng)料液比為1∶20 g/mL時(shí)達(dá)到溶解平衡,黃酮得率最大。而當(dāng)乙醇的量繼續(xù)增大時(shí),其它雜質(zhì)也會(huì)相繼溶出,導(dǎo)致黃酮得率迅速下降,且溶劑量過(guò)大也會(huì)給后處理帶來(lái)負(fù)擔(dān),故選擇料液比為1∶20 g/mL。

圖3 料液比對(duì)黃酮得率的影響Fig.3 Effect of material liquid ratio on yield of flavonoids

2.1.4 微波時(shí)間的篩選 由圖4可知,隨著微波提取時(shí)間的增加,微波的離子傳導(dǎo)作用以及分子熱運(yùn)動(dòng)逐漸加強(qiáng),陳皮的細(xì)胞膜被逐步破壞,黃酮浸出率增大,在微波時(shí)間為3 min時(shí)達(dá)到最大,說(shuō)明此時(shí)的陳皮黃酮已溶出完全。當(dāng)微波時(shí)間再增加時(shí),過(guò)量的分子熱運(yùn)動(dòng)和離子傳導(dǎo)作用會(huì)導(dǎo)致黃酮的分解,得率下降,故選擇微波提取時(shí)間為3 min。

圖4 微波時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響Fig.4 Effect of microwave time on yield of flavonoids

2.1.5 提取溫度的篩選 由圖5可知,適當(dāng)?shù)纳邷囟扔欣谄茐年惼さ募?xì)胞膜,提高陳皮中黃酮的浸出率,因此,總黃酮得率隨著提取溫度的升高而逐漸升高,在溫度為60 ℃時(shí)達(dá)到最高值,而當(dāng)溫度過(guò)高(即超過(guò)60 ℃)時(shí),會(huì)使溶出的黃酮結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,從而導(dǎo)致黃酮得率下降,故選擇提取溫度為60 ℃。

圖5 提取溫度對(duì)黃酮得率的影響Fig.5 Effect of temperature on yield of flavonoids

2.2 BBD實(shí)驗(yàn)

2.2.1 BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 基于表1響應(yīng)面設(shè)計(jì)進(jìn)行的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。通過(guò)Design expert 8.0.5軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析后得到以黃酮得率為響應(yīng)值的回歸方程:

表2 BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 The design and results of BBD experiments

Y黃酮得率(%)=1.34+0.016A+0.012B+0.023C+0.043D+0.031AB+0.049AC+0.039AD+0.016BC+0.022BD+0.024CD-0.21A2-0.10B2-0.098C2-0.095D2

表3 回歸方程各項(xiàng)的方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

兩因素交互作用響應(yīng)面圖見(jiàn)圖6。由圖6的等高線(xiàn)圖可以看出,微波功率與微波時(shí)間、微波功率與提取溫度以及微波功率與料液比之間的交互作用圖均為橢圓形,說(shuō)明此三組交互項(xiàng)的交互作用顯著[12],且微波功率與提取溫度的交互作用比另兩組的交互作用更明顯,與表3中的模型顯著性結(jié)果一致。另外,響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖均在所選范圍內(nèi)存在最高點(diǎn),即極限值。

圖6 兩因素交互作用的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖Fig.6 Response surface and contour plots of four factors interaction

2.2.3 最優(yōu)條件驗(yàn)證 經(jīng)BBD實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)的最優(yōu)條件為:微波功率619.30 W、提取時(shí)間3.12 min、提取溫度61.84 ℃、料液比1∶21.42 g/mL,此條件下陳皮黃酮得率最高為1.3575%。根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)水平，將反應(yīng)條件修正為功率619 W、提取時(shí)間3 min、提取溫度62 ℃、料液比1∶21 g/mL,乙醇體積濃度60%,重復(fù)3次,取其平均值,黃酮得率為1.3468%±0.0142%,與預(yù)測(cè)值的偏差僅為0.0107%,進(jìn)一步證實(shí)該模型方程與實(shí)際擬合良好。

2.3 抑菌活性測(cè)試結(jié)果

由表4可知,純化后的陳皮黃酮在濃度為1和0.5 mg/mL時(shí)對(duì)三種被測(cè)菌株均有不同程度的抑制作用,尤其是對(duì)大腸桿菌的抑菌效果最佳,其抑菌圈直徑明顯大于對(duì)照茶多酚,而對(duì)金黃色葡萄球桿菌的抑菌效果則相對(duì)差一些,但仍?xún)?yōu)于茶多酚,對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌效果則較茶多酚差。當(dāng)濃度為0.25 mg/mL時(shí),因濃度太低陳皮黃酮和茶多酚均檢測(cè)不到抑菌活性,由此可初步確定陳皮黃酮的最低抑菌濃度為0.5 mg/mL。

表4 純化后的陳皮黃酮與茶多酚的抑菌活性比較Table 4 Comparison of antimicrobial activity of purified citrus flavonoids with tea polyphenols

3 結(jié)論

本文采用BBD實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)陳皮黃酮的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化,得到其最佳提取條件為:當(dāng)提取劑乙醇體積濃度60%,微波功率619 W、微波時(shí)間為3 min、溫度62 ℃、料液比1∶21 g/mL時(shí),陳皮黃酮得率最高1.3468%±0.0142%,與預(yù)測(cè)值的偏差僅為0.0107%,說(shuō)明模型與實(shí)際契合度高。

抑菌活性實(shí)驗(yàn)表明:純化后的陳皮黃酮對(duì)三種被測(cè)菌株均有不同程度的抑菌效果,其中,對(duì)大腸桿菌的抑菌效果最佳,對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球桿菌的抑菌效果均優(yōu)于對(duì)照茶多酚,可應(yīng)用于食品防腐劑、水果保鮮等領(lǐng)域。

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