綠原酸抑制豬肉肌原纖維蛋白氧化及NDEA生成的作用研究

李 玲,季 慧,段家玉

(臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東臨沂 276000)

肉類食品在貯藏過程中,蛋白質(zhì)容易受到自由基的攻擊而發(fā)生氧化,隨后發(fā)生一系列的物理化學(xué)變化,引起品質(zhì)劣變[1-2]。羥自由基是眾多自由基中氧化能力最強的自由基,也是引起蛋白質(zhì)和脂肪發(fā)生氧化的主要貢獻者,蛋白質(zhì)多肽鏈的主鏈及側(cè)鏈受到自由基的攻擊而引起結(jié)構(gòu)的變化,影響其表面疏水性及羰基和巰基的含量,進而影響蛋白質(zhì)的凝膠保水性,破壞肉制品的質(zhì)地、口感和滋味等[3-4]。天然植物多酚作為抗氧化劑,近年來廣泛應(yīng)用于肉類食品的加工過程中,在蛋白質(zhì)氧化體系中,多酚和蛋白質(zhì)以共價鍵或者非共價鍵結(jié)合,從而影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能[5-7]。目前,人們對蛋白質(zhì)氧化的研究有限,對自由基氧化和多酚抗氧化對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響研究較少。亞硝胺是一類具有致癌作用的化合物,在體內(nèi)外都可以生成,在肉品加工的高溫環(huán)境中更有利于亞硝胺的產(chǎn)生[8-9],因此合理控制亞硝胺的生成是近年來的研究熱點,特別是在蛋白質(zhì)氧化體系中研究多酚對亞硝胺生成的影響。本實驗選用綠原酸作為抗氧化劑,利用Fenton氧化體系產(chǎn)生的羥自由基,探討自由基誘導(dǎo)的肌原纖維蛋白氧化后其理化性質(zhì)的變化,以及氧化蛋白體系中亞硝胺形成的規(guī)律,以期為多酚的應(yīng)用提供更多理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬背最長肌 冷鮮肉購自臨沂東方購物中心;N-亞硝基二乙胺標準品(NDEA) 美國Sigma公司;色譜純甲醇、二氯甲烷 美國Tedia公司;哌嗪-N,N′-二(2-乙磺酸)(PIPES)、溴酚藍、鹽酸胍、綠原酸(98%) solarbio 公司;二乙胺、鹽酸二乙胺、二甲亞砜、DNPH(2,4-二硝基苯肼)、DTNB(5,5′二硫代雙(2-硝基苯甲酸))、三羥甲基氨基甲烷(Tris)水溶性維生素E(trolox) 購自阿拉丁試劑;亞硝酸鈉、磷酸鹽、對氨基苯磺酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、雙氧水、三氯乙酸(TCA)等 均為分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

Agilent 1260液相色譜系統(tǒng)配紫外檢測器、ZORBAX SB-C18反相柱(4.6×250 mm,5 μm) 美國Agilent公司;Allegra 25R高速冷凍離心機 美國Beckman公司;F-4600熒光分光光度計 日本日立公司；H-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠;優(yōu)普UPW系列超純水器 成都超純科技有限公司;SANYO SIM-F124制冰機 日本三洋公司;Spectrum紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;BS223S電子太平 北京塞多利斯儀器;有機系一次性微孔濾膜(0.22 μm) 天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預(yù)處理 取宰后24 h的豬背最長肌,去除筋膜和可見脂肪組織,沿垂直肌纖維方向切成100 g左右的肉塊,用聚乙烯袋包裝后于-18 ℃凍藏。臨用前將冷凍的豬肉置4 ℃解凍4 h備用。

1.2.2 肌原纖維蛋白(MP)的制備 參考Park[3]、Feng[6]的方法,并做一定修改。稱取50 g肉樣,加4 倍體積的pH7.0緩沖液勻漿(10000 r/mim,30 s),4 ℃離心(3000 r/min,10 min),棄上清液,重復(fù)3遍。再加入4倍體積的0.1 mol/L NaCl洗液,勻漿(10000 r/mim,30 s)4 ℃離心(3000 r/min,10 min),棄上清液,重復(fù)2次。第3次加洗液勻漿后,用兩層紗布過濾以除去結(jié)締組織等,最后用0.1 mol/L HCl調(diào)pH為6.25后離心去上清液,所得膏狀物為肌原纖維蛋白。

將制備好的MP,冰浴保存,48 h之內(nèi)使用。采用雙縮脲法測定蛋白的含量,以牛血清白蛋白(BSA)為標準蛋白制作標準曲線,y=0.027x+0.08,R2=0.995。

1.2.3 綠原酸的添加及氧化處理 綠原酸用DMSO配制10 mmol/L的溶液。用15 mmol/L PIPES緩沖液(含0.6 mol/L NaCl,pH6.25)將MP蛋白膏稀釋為40 mg/mL,試管中先加入蛋白溶液,再加入不同量的綠原酸溶液,攪拌均勻后加入fenton氧化體系(終濃度0.01 mmol/L FeCl3,0.1 mmol/L抗壞血酸,10 mmol/L H2O2)4 ℃氧化12 h。MP的終濃度是20 mg/mL,綠原酸的終濃度分別是0、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、2.0 mmol/L。以未加綠原酸和氧化劑但有trolox的蛋白溶液作為對照組。氧化反應(yīng)通過添加trolox終止反應(yīng)(終濃度1 mmol/L)。

1.2.4 肌原纖維蛋白物理化學(xué)變化的測定 羰基含量的測定采用DNPH法,參照Oliver[10]的方法進行;游離巰基和總巰基含量按照Xia X等[11]的方法進行測定;疏水性測定采用溴酚藍(BPB)結(jié)合法進行,參照曹云剛[12]描述的方法進行測定;內(nèi)源色氨酸熒光的變化通過F-4600熒光分光光度儀檢測,用15 mmol/L PIPES緩沖液(含0.6 mol/L NaCl,pH6.25)將樣品稀釋為蛋白濃度0.1 mg/mL,吸取0.1 mL置于石英比色皿中,室溫條件下于283 nm激發(fā),記錄下300～400 nm的發(fā)射光譜供后續(xù)分析。激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均設(shè)置為 5 nm,電壓700 V。

1.2.5 二乙基亞硝胺(NDEA)的測定 采用Agilent1260液相色譜系統(tǒng),ZORBAX SB-C18反相柱(4.6×150 mm,5 μm),流速1 mL/min,進樣量20 μL,流動相甲醇/水=35/65,柱溫30 ℃,檢測波長230 nm。用蒸餾水分別配制0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 μg/mL的NDEA標準溶液。利用最優(yōu)檢測條件,從低濃度依次進樣分析測定,繪制NDEA標準工作曲線,y=59.69x+0.59,R2=0.991。

吸取1 mL氧化處理好的MP溶液,置于5 mL塑料離心管中,再加入0.1 mL 100 mmol/L的NaNO2溶液(用上述0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液配制),0.1 mL 1 mol/L的二乙胺溶液(用上述0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液配制),0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液0.8 mL,渦旋混合調(diào)節(jié)pH至3.0,分別采用37 ℃水浴反應(yīng)4 h和80 ℃水浴反應(yīng)1 h,反應(yīng)結(jié)束后迅速冷卻,加入0.1 mL 100 mmol/L的對氨基苯磺酸混勻終止反應(yīng),離心(3000 r/mim,5 min)。上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾后,在上述液相色譜條件下進行測定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均用Excel建立工作表,用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠原酸濃度對于MP蛋白羰基含量的影響

蛋白質(zhì)的側(cè)鏈氨基酸在某些特定條件下極易發(fā)生氧化,羰基含量是判斷蛋白質(zhì)氧化程度的重要指標。一般羰基含量越高,蛋白質(zhì)氧化程度越高。如圖1可見,未氧化的對照組MP羰基含量為2.98 nmol/mg蛋白,羥自由基氧化12 h未添加綠原酸組羰基升高到5.75 nmol/mg蛋白,升高了1.93倍。而綠原酸的添加抑制了羰基的生成,在0.1～0.5 mmol/L的綠原酸添加組與未添加綠原酸組相比差異顯著(p<0.05),而0.8和1 mmol/L的綠原酸組與未添加綠原酸組相比差異不顯著(p>0.05)。這可能是因為綠原酸中羥基含量較高,具有一定的清除自由基和螯合金屬離子的作用[13]。有關(guān)酚類物質(zhì)抑制蛋白質(zhì)羰基形成的作用,前人研究發(fā)現(xiàn)0.1%質(zhì)量分數(shù)的鞣酸和沒食子酸具有抑制豬肉肌原纖維蛋白羰基形成的作用[7]。Estévez[13]研究發(fā)現(xiàn)沒食子酸在低劑量時可以抑制豬肉糜蛋白羰基的產(chǎn)生,而高劑量會促進蛋白質(zhì)的氧化。酚類物質(zhì)(綠原酸和沒食子酸)既能促進也能抑制肌原纖維蛋白羰基的生成,可能是與酚類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、濃度和氧化條件有密切關(guān)系[12]。

圖1 綠原酸對肌原纖維蛋白羰基含量的影響Fig.1 Effect of Chlorogenic acid on the carbonyl content of MP after oxidation

2.2 綠原酸濃度對于MP巰基含量的影響

綠原酸對氧化MP巰基含量的影響見圖2。從圖中可見,與對照組相比,不加綠原酸的氧化組游離巰基含量增加了11.7%,差異顯著(p<0.05),說明氧化使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開,巰基暴露,導(dǎo)致檢測到更多的游離巰基。隨著綠原酸含量的增加,游離巰基含量進一步升高,可能是綠原酸保護了氧化過程中展開的游離巰基,導(dǎo)致其含量繼續(xù)增加。在20種氨基酸中,半胱氨酸和甲硫氨酸含有硫原子,最易受自由基引起的氧化修飾。與對照組相比,氧化后總巰基含量增加了21.3%,差異顯著(p<0.05)。添加綠原酸后,總巰基含量進一步升高,其中0.1、0.2、0.8 mmol/L的綠原酸與未添加組差異顯著(p<0.05),而0.5、1.0、2.0 mmol/L的綠原酸與未添加組差異不顯著(p>0.05),本研究認為高濃度的綠原酸抑制了體系中的總巰基含量。前人在研究羥自由基誘導(dǎo)豬肉肌原纖維蛋白氧化的過程中發(fā)現(xiàn),氧化處理及添加綠原酸后減少了體系中的總巰基含量[12]。Xiong G等[14]在研究草魚肌原纖維蛋白凍藏過程中的變化時,發(fā)現(xiàn)隨冷凍時間的延長,總巰基和游離巰基含量逐漸降低。而本研究中,巰基含量增加,其原因可能與氧化劑與抗氧化劑(綠原酸)的濃度比例不同有關(guān),有待于對其進一步探討。

圖2 綠原酸對肌原纖維蛋白巰基含量的影響Fig.2 Effect of Chlorogenic acid on the sulfhydral content of MP after oxidation

2.3 綠原酸濃度對于MP表面疏水性的影響

在肌原纖維蛋白氧化過程中,自由基攻擊蛋白質(zhì)的多肽鏈,使原本位于內(nèi)部的疏水性肽段暴露,導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性氨基酸含量的變化。蛋白質(zhì)表面疏水性可以通過測定BPB結(jié)合量來表示,BPB分子可以結(jié)合在蛋白質(zhì)分子表面的疏水性結(jié)合位點,疏水性增加是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)展開的一個重要指標。如圖3所見,與對照組相比,氧化后的MP疏水性達到3.74 ng,差異顯著(p<0.05),說明MP結(jié)構(gòu)展開,其疏水性顯著升高。胡忠良等[1]的研究發(fā)現(xiàn),隨著氧化劑濃度的增加,表明疏水性顯著增大,更多的疏水氨基酸暴露在分子表面。當(dāng)添加綠原酸后,0.1 mmol/L組與未添加綠原酸組相比,差異不顯著。但是0.2～2.0 mmol/L的綠原酸組,與未添加綠原酸組相比,差異顯著(p<0.05)。高濃度的綠原酸促進了氧化誘導(dǎo)的MP結(jié)構(gòu)的進一步展開,疏水性升高。Li等[15]的研究表明,在羥自由基氧化體系中,隨氧化劑濃度和時間的增加,MP的表面疏水性增加。有研究表明,在肌原纖維蛋白中添加不同濃度的沒食子酸,表明疏水性持續(xù)增加,高濃度沒食子酸作用效果更明顯,與本實驗的結(jié)果一致,說明其促進了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開[16]。

圖3 綠原酸對肌原纖維蛋白疏水性的影響Fig.3 Effect of Chlorogenic acid on the surface hydrophobicity of MP after oxidation

2.4 綠原酸濃度對MP內(nèi)源色氨酸熒光的影響

由圖4綠原酸對MP內(nèi)源色氨酸熒光強度的變化可見,對照組中,發(fā)射波長334 nm時,最大熒光強度為8649。與對照組相比,氧化處理后,色氨酸熒光強度明顯降低。隨著綠原酸添加量的增加,熒光強度逐漸降低,0.8 mmol/L的綠原酸組,最大熒光強度紅移到337 nm。而2.0 mmol/L的綠原酸組,出現(xiàn)大范圍的熒光猝滅,最大熒光強度紅移到367 nm。其原因可能是蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基色氨酸對其周圍微環(huán)境的極性非常敏感,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于折疊狀態(tài)時,色氨酸殘基主要位于蛋白質(zhì)內(nèi)核的疏水環(huán)境中,此時被激發(fā)的色氨酸具有相對較高的熒光強度和較低的發(fā)射波長;而當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)部分或全部展開后,色氨酸殘基會有更多的暴露在蛋白質(zhì)分子表面的極性環(huán)境中,此時被激發(fā)的色氨酸熒光強度降低,發(fā)射波長較長(紅移)。與此類似,Cao等[5]也報道了綠原酸會導(dǎo)致MP色氨酸熒光強度降低,與本研究結(jié)果一致。Wu等[17]研究發(fā)現(xiàn),表沒食子酸兒茶素(EGC)和β-乳球蛋白結(jié)合過程中,EGC覆蓋在β-乳球蛋白表面,引起蛋白結(jié)構(gòu)變化,a-螺旋含量略有升高,色氨酸熒光強度降低。

2.5 綠原酸濃度對氧化蛋白體系中亞硝基二乙胺生成的影響

在肌原纖維蛋白氧化條件下,圖5分析了NDEA的變化趨勢。圖中分別表示了37 ℃保溫4 h和80 ℃保溫1 h的數(shù)據(jù)。從圖5可見,同一組處理在80 ℃保溫1 h后,NDEA的生成量要大于37 ℃保溫4 h的生成量,說明高溫能促進了亞硝胺的生成。這與前人對羥自由基氧化體系中亞硝基二甲胺(NDMA)和NDEA的研究結(jié)果一致[18-19]。與對照組相比,氧化后NDEA的含量有所升高。當(dāng)添加綠原酸后,NDEA的生成量增加,特別是0.8 mmol/L綠原酸組80 ℃保溫1 h,NDEA的含量達到3.72 μg/mL,此后,NDEA生成量下降。當(dāng)綠原酸濃度為2 mmol/L時，37 ℃保溫4 h檢測不到NDEA，80 ℃保溫1 h檢測的到。在一定濃度范圍內(nèi),0.1～0.8 mmol/L的綠原酸促進了亞硝胺的生成,而0.8～2 mmol/L的綠原酸抑制了亞硝胺的產(chǎn)生。作者前期研究表明,在模擬胃酸條件下,茶多酚和葡萄籽提取物具有抑制和促進亞硝胺生成的雙重作用效果,抑制程度與多酚物質(zhì)的量有關(guān)[20]。多酚類物質(zhì)和本研究的綠原酸都是含有多羥基的酚酸化合物,當(dāng)其在低濃度時,酚酸與亞硝根離子結(jié)合形成醌類化合物,醌類不穩(wěn)定,繼續(xù)結(jié)合亞硝根離子,形成亞硝-苯醌衍生物,可能促進了亞硝胺生成。但當(dāng)酚酸達到一定量時,無過量的亞硝根離子與醌類物質(zhì)反應(yīng),不能生成亞硝基苯醌衍生物,可能抑制了亞硝胺生成。

圖5 綠原酸對氧化蛋白體系中亞硝基二乙胺生成的影響Fig.5 Effect of Chlorogenic acid on the nitrosodiethylamine of MP after oxidation

2.6 亞硝胺與理化指標的相關(guān)性分析

相關(guān)理化指標與亞硝胺之間的相關(guān)性見表1。從表中可以看出,自由巰基與NDEA的生成顯著相關(guān)(p<0.05)。而理化指標之間,自由巰基與總巰基之間極顯著相關(guān),疏水性與巰基(自由巰基和總巰基)極顯著相關(guān)(p<0.01),37 ℃ 4 h處理組和80 ℃ 1 h處理組之間極顯著相關(guān)(p<0.01)。孫衛(wèi)青等采用相關(guān)性分析和主成分分析發(fā)現(xiàn),豬肉蛋白的氧化程度與NDEA的生成量高度相關(guān),羰基化合物促進了NDEA的生成[21]。

表1 羥自由基氧化體系中蛋白質(zhì)理化指標與亞硝胺生成之間的相關(guān)性Table 1 Correlation between physicochemical changes and nitrosodiethylamine in MP oxidation in the absence of Chlorogenic acid

3 結(jié)論

羥自由基氧化導(dǎo)致肌原纖維蛋白羰基含量,內(nèi)源色氨酸熒光強度降低,表明疏水性增強。添加綠原酸能在一定程度上抑制羰基含量的升高,但高濃度抑制效果不顯著。隨添加綠原酸濃度的增加,巰基含量和表明疏水性有升高趨勢,說明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進一步展開。低濃度的綠原酸促進了NDEA的生成,高濃度綠原酸抑制了NDEA的生成,具有劑量依賴性?？梢?綠原酸對羥自由基引起的蛋白質(zhì)氧化起到了一定的抑制作用。因此,通過向肉及肉制品中添加含有綠原酸的多酚類化合物,可防止蛋白質(zhì)氧化,提高蛋白質(zhì)的功能特性。

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