凍融胚胎移植在避免高雌二醇對子宮內(nèi)膜容受性的影響

鄒 姮，吳藝佳，張覘宇，陳慧佳，孫成光，胡麗娜（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，重慶400060）

在體外受精?胚胎移植（IVF?ET）輔助生殖助孕的過程中，為提高助孕效率，常常通過控制性超促排卵來募集較多的發(fā)育卵泡，能通過增加獲卵數(shù)提高妊娠概率[1]。同時，也使胚胎和內(nèi)膜暴露于超生理劑量的雌激素水平下。內(nèi)膜的容受性是目前制約體外受精（IVF）成功率的關(guān)鍵因素。有研究報道，人絨毛膜促性腺激素（HCG）扳機(jī)日的高雌激素水平被認(rèn)為是不僅可能對卵子和胚胎造成不良影響，并可降低子宮內(nèi)膜的容受性[2]。子宮內(nèi)膜容受性即子宮內(nèi)膜接受胚胎的能力，指子宮內(nèi)膜處于一種允許胚胎定位、黏附、侵入，并使內(nèi)膜腺體間質(zhì)發(fā)生改變從而導(dǎo)致胚胎著床狀態(tài)，該時間段又稱為“內(nèi)膜種植窗”。子宮內(nèi)膜容受性與胚胎能否在宮腔內(nèi)成功著床及其后胎兒能否正常發(fā)育關(guān)系密切，是輔助生殖技術(shù)成功的重要環(huán)節(jié)之一[3]。否則，即使足夠優(yōu)質(zhì)的胚胎也會造成著床失敗[4]。在IVF卵巢超促排期間，雌二醇/卵泡數(shù)值被認(rèn)為能準(zhǔn)確反映單個卵泡所代表的雌激素量，多個卵泡發(fā)育引起的體內(nèi)雌激素水平急劇升高和蛋白因子的改變，都有可能對子宮內(nèi)膜容受性造成一定的影響，進(jìn)而影響IVF妊娠結(jié)局[4]。近年來，隨著胚胎玻璃化冷凍技術(shù)水平的大幅提升，越來越多的可能造成子宮內(nèi)膜容受性降低或卵巢過度刺激高風(fēng)險的患者選擇全胚冷凍，并在冷凍胚胎復(fù)蘇周期中獲得理想的妊娠率[5?6]。

活產(chǎn)率代表IVF助孕的最終治療結(jié)局，然而，鮮有文獻(xiàn)研究雌二醇/卵泡數(shù)值對IVF妊娠結(jié)局的影響。此外，有研究比較了新鮮周期胚胎移植及凍融胚胎移植（FET）在不同患者的生育結(jié)局，本研究旨在探討在IVF助孕中使用促性腺激素釋放激素激動（GnRH?a）長方案的女性HCG扳機(jī)日雌二醇/卵泡數(shù)值對臨床妊娠率及活產(chǎn)率的影響。同時，還分析了在同等胚胎質(zhì)量下，胚胎移植（ET）失敗后再次行FET患者的臨床妊娠率、活產(chǎn)率與新鮮周期胚胎移植的差異。因此，本文更客觀地分析卵巢超促排后高雌二醇水平對子宮內(nèi)容受性的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月至2017年11月因重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心卵巢正常反應(yīng)于行GnRH?a長方案的755例不孕癥女性的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡 20～40 歲，平均（28.82±4.32）歲；不孕原因?yàn)檩斅压芤蛩亍⒍啻握煞蚓喝斯な诰ˋIH）失敗或男方因素；抗苗勒氏管激素（AMH）1.96～4.20 ng/mL；基礎(chǔ)卵泡刺激素（FSH）＜10 U/L，雙側(cè)卵巢健在，基礎(chǔ)竇卵泡8～15枚；第一個超促排周期為標(biāo)準(zhǔn)短效長方案；可供移植胚胎大于或等于3個，受精功能正常，HCG扳機(jī)日內(nèi)膜大于或等于8 mm。排除標(biāo)準(zhǔn)：基礎(chǔ)性激素異常、多囊卵巢綜合征、子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢低反應(yīng)、卵巢過度刺激、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、供精等。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 所有患者均采用短效長方案控制性超促排卵，于超促排卵周期的前1周黃體中期（排卵后7 d）查血性激素檢查示：孕酮（P）＞5.6 ng/mL，血 HCG＜1 mU/mL；陰道超聲示：子宮內(nèi)膜呈“C”型，卵巢無囊腫。符合以上降調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)后開始皮下注射GnRH?a醋酸曲普瑞林注射液（達(dá)必佳，德國輝凌公司）每天0.05 mg至HCG扳機(jī)日進(jìn)行垂體降調(diào)節(jié)，使用劑量根據(jù)患者雙側(cè)竇卵泡數(shù)確定。垂體降調(diào)14～16 d后，抽血清檢測FSH＜5mU/mL、黃體生成素（LH）＜5mU/mL、雌二醇小于50pg/mL、P＜0.9 ng/mL；B超檢測示：子宮內(nèi)膜厚度小于或等于5 mm，所有卵泡直徑小于10 mm，直徑大于或等于4 mm的竇卵泡數(shù)占總竇卵泡數(shù)60%及以上，確定垂體降調(diào)滿意。同時給予人基因重組促卵泡生成素[rFSH，果納芬（瑞士，默克雪蘭諾公司）]、麗申寶（中國，麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠）、尿促性素（HMG）（中國，麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠）促排卵。經(jīng)陰道B超檢測卵泡發(fā)育情況及血清雌二醇水平，調(diào)整促排卵用藥劑量，根據(jù)卵泡大小、數(shù)量、性激素水平綜合考慮，決定HCG扳機(jī)日。扳機(jī)日注射HCG 10 000 U或艾澤（注射用重組人絨促性素，瑞士，默克雪蘭諾公司）37.5 μg，36.0 h或37.5 h經(jīng)陰道B超引導(dǎo)下穿刺取卵，行IVF/卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI），3 d后B超引導(dǎo)下行優(yōu)質(zhì)胚胎移植術(shù)1～2枚，其余有冷凍價值胚胎簽署知情同意后全部玻璃化冷凍保存，雪諾同（瑞士，默克雪蘭諾公司）每天90 mg行黃體支持。移植后2周測定血HCG，移植后4周經(jīng)陰道B超臨床妊娠者繼續(xù)給予黃體支持治療至移植后70 d，胚胎移植后成功分娩被定義為活產(chǎn)。

1.2.2 激素測定 卵巢儲備功能評估，包括自然周期月經(jīng)第2～4天測定FSH、LH、雌二醇、P、HCG扳機(jī)日雌二醇水平，根據(jù)HCG扳機(jī)日雌二醇/卵泡數(shù)值分為三組（200～400、＞400～600、＞600 pg/mL），移植后 2 周測定HCG，采用化學(xué)發(fā)光法測定，操作按試劑盒說明書進(jìn)行（批內(nèi)和批間變異為 LH＜3%～4%，F(xiàn)SH＜3%～6%，HCG＜5%～7%，雌二醇小于5%～10%）

1.2.3 冷凍胚胎解凍移植內(nèi)膜準(zhǔn)備 月經(jīng)規(guī)律，有正常排卵者自然周期監(jiān)測排卵，排卵期內(nèi)膜達(dá)8 mm及以上，監(jiān)測卵泡破裂日為第0天，當(dāng)天抽血檢測雌二醇、P，當(dāng)P＜1 ng/mL時，當(dāng)天起每天予以地屈孕酮10 mg口服，每天2次，直至移植日。第3天行卵裂期胚胎復(fù)蘇移植。月經(jīng)不規(guī)律、排卵障礙、多囊卵巢綜合征、子宮內(nèi)膜發(fā)育不良等患者采用人工建內(nèi)膜，自撤血或自然周期月經(jīng)第3天開始口服予以雌二醇每天2～10 mg口服，用藥第5天開始采用B超監(jiān)測子宮內(nèi)膜情況；用藥12～15 d，子宮內(nèi)膜厚度大于或等于8 mm，血雌二醇大于或等于200 pg/mL，血P＜1.5 pg/mL時當(dāng)作第0天，給予陰道雪諾同90 mg，地屈孕酮10 mg口服，每天2次，第3天行卵裂期胚胎復(fù)蘇移植術(shù)，如子宮內(nèi)膜異位癥或基礎(chǔ)性激素異常等患者采用GnRH?a降調(diào)后再行人工建內(nèi)膜方案，治療周期月經(jīng)來予長效GnRH?a 3.75 mg肌內(nèi)注射1～2次，20 d后開始口服雌二醇，用藥15～25 d，子宮內(nèi)膜厚度大于或等于8 mm，血清雌二醇大于或等于200 pg/mL，血P＜1.5 pg/mL時當(dāng)作第0天，予雪諾同（黃體酮陰道緩釋凝膠）90 mg陰道用，地屈孕酮10 mg口服，每天2次，第3天行卵裂期胚胎復(fù)蘇移植術(shù)。

1.2.4 新鮮周期或冷凍周期胚胎選擇 采用伊斯坦布爾共識推薦的胚胎評分方法，即根據(jù)細(xì)胞數(shù)、碎片數(shù)、對稱性、空泡及是否有粗顆粒等進(jìn)行胚胎發(fā)育潛能評估，選取優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行新鮮或冷凍周期移植（卵裂胚胎滿足7細(xì)胞、8細(xì)胞，達(dá)到1、2級甚至是融合）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以表示，采用t檢驗(yàn)；多組間計量數(shù)據(jù)比較采用one?way ANOVA方差分析；計數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用 Pearsonχ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 新鮮周期ET一般情況比較（±s）

表1 新鮮周期ET一般情況比較（±s）

注：Gn為外源性促性腺激素

項(xiàng)目年齡（±s，歲）不孕年限（±s，年）體重指數(shù)（±s，kg/m2）Gn天數(shù)（±s，d）Gn量（±s，U）取卵數(shù)（±s，個）夜針日雌二醇水平（±s，pg/mL）移植胚胎數(shù)（±s，個）臨床妊娠率[n（%）]活產(chǎn)率[n（%）]200～400 pg/mL組（n=390）31.02±4.95 4.51±3.29 22.50±3.42 11.85±1.57 2 025.64±830.65 8.32±3.21 2 869.82±1 487.35 1.83±0.55 203（52.05）147（37.69）雌二醇/卵泡數(shù)值＞400～600 pg/mL組（n=289）30.64±5.10 4.53±3.16 21.97±3.02 11.20±2.04 1 988.25±886.40 11.20±5.37 4 670.48±2 230.78 1.98±0.62 152（52.60）112（38.75）＞600 pg/mL組（n=76）30.12±5.24 4.28±3.07 22.87±3.88 10.98±1.74 1 978.49±894.92 16.88±4.97 6 710.75±2 987.82 1.66±0.58 34（44.74）24（31.58）t/χ2 0.91 0.89 0.95 0.96 2.42 8.01 9.58 2.90 5.12 5.48 P＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＜0.01＜0.01＞0.05＜0.05＜0.05

2 結(jié) 果

2.1 新鮮周期胚胎移植一般情況比較 取卵后行新鮮周期移植的三組患者中，＞600 pg/mL組臨床妊娠率、活產(chǎn)率均低于 200～400、＞400～600 pg/mL 組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表 1。

2.2 ET與FET一般情況比較 在755例行IVF?ET的患者中，417例獲得妊娠，389例（51.52%）獲得臨床妊娠，283例（37.48%）獲得活產(chǎn)，剩下338例未獲妊娠，322例接受了FET，其中193例（59.94%）獲得臨床妊娠，140例（43.48%）獲得活產(chǎn)。ET失敗后再次行FET的臨床妊娠率及活產(chǎn)率均明顯高于新鮮周期胚胎移植，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討 論

試管嬰兒被認(rèn)為是人類生殖技術(shù)的一大創(chuàng)舉，為不孕不育開辟了一條新的治療途徑，隨著促排卵藥物的不斷開發(fā)、改進(jìn)，促排卵藥物聯(lián)合GnRH?a的應(yīng)用及不同藥物組合的超促排方案，使卵泡發(fā)育更同步化，IVF獲得了越來越高的可移植胚胎概率，從而大幅提高了IVF的成功率。然而，IVF成功率不僅僅取決于一定數(shù)量可供移植的高質(zhì)量胚胎，還與胚胎發(fā)育同步，允許其種植的內(nèi)膜，也就是子宮內(nèi)膜容受性。因此，探索子宮內(nèi)膜的容受性，更精確地檢測其“種植窗”，是使IVF獲得臨床妊娠的關(guān)鍵[7]。卵巢高反應(yīng)所產(chǎn)生的高水平雌二醇對內(nèi)膜容受性的影響一直存在爭議。有研究發(fā)現(xiàn)，高水平雌激素并未對臨床結(jié)局產(chǎn)生不利影響[8]。盡管如此，但大部分研究證實(shí)，由于高雌二醇的調(diào)控，除內(nèi)膜的形態(tài)發(fā)生改變外，內(nèi)膜容受性也受到了影響[9]。因此，卵巢高反應(yīng)對著床率和妊娠率不利，并且卵巢高反應(yīng)不僅不會增加妊娠率，反而增加周期取消率及卵巢過度刺激綜合征的發(fā)生[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，在較低雌激素水平下，子宮內(nèi)膜著床窗口期能持續(xù)開放更長時間，而在高雌激素狀態(tài)下，則持續(xù)較短時間就關(guān)閉，這可能與超生理劑量雌激素水平、子宮肌層的環(huán)氧化酶?2和人白血病抑制因子異常表達(dá)有關(guān)，從而導(dǎo)致子宮收縮，影響胚胎植入[11]。高雌激素水平可能通過影響子宮內(nèi)膜腺體的成熟，以及使間質(zhì)提前發(fā)育來影響子宮內(nèi)膜與胚胎的同步性[12]。

然而，在臨床上如何界定卵巢高反應(yīng)、正常反應(yīng)及低反應(yīng)一直存在爭議，很多研究者提出了自己的定義。有研究發(fā)現(xiàn)，HCG扳機(jī)日雌二醇/卵泡值對臨床結(jié)局更有預(yù)測意義，且雌二醇水平對內(nèi)膜容受性的建立非常重要，還可能對卵子成熟度的預(yù)測有一定意義[14]。本研究結(jié)果顯示，雌二醇/卵泡值與IVF/ICSI活產(chǎn)率密切相關(guān)，且雌二醇/卵泡值大于600 pg/mL時其活產(chǎn)率最低。有研究報道，在GnRH?a長方案中，有2個大樣本回顧性研究數(shù)據(jù)表明，盡管超促排卵可以通過增加獲卵數(shù)來提高成功率，但其同樣也會對子宮內(nèi)膜容受性造成影響，因此，新鮮周期ET與凍胚移植妊娠結(jié)局相當(dāng)，甚至低于凍胚移植[14]。同時，這個結(jié)論在YANG等[15]的研究中也得到證實(shí)，在雌二醇/卵泡值大于或等于350 pg/mL時，妊娠率和著床率明顯低于小于或等于350 pg/mL時。

此外，本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ET臨床妊娠率及著床率顯著高于新鮮ET，推測新鮮周期移植高雌二醇可能會造成內(nèi)膜容受性受損。通過臨床觀察及文獻(xiàn)回顧發(fā)現(xiàn)，卵巢高反應(yīng)患者新鮮ET后臨床妊娠率低于卵巢正常反應(yīng)患者，而FET成功率無明顯差異，由此有學(xué)者推論高反應(yīng)患者之所以新鮮周期著床率低的原因主要在于內(nèi)膜容受性因素，而非胚胎因素。有研究表明，高雌二醇可使子宮內(nèi)膜腺體與間質(zhì)發(fā)育二者同步性喪失，這種對子宮內(nèi)膜的影響可能是高雌二醇水平下改變與著床密切相關(guān)的分子、基因及超微結(jié)構(gòu)的時序性表達(dá)，可能是胚泡發(fā)育與種植窗的開放不同步，從而影響胚胎著床、降低著床率。至于影響IVF結(jié)局的雌二醇峰的閾值是多少，目前尚無定論。本研究采用雌二醇/卵泡數(shù)值 200～400、＞400～600、＞600 pg/mL 進(jìn)行分組，所選取的病例中，年齡、體重指數(shù)、基礎(chǔ)FSH、HCG扳機(jī)日P值、移植胚胎數(shù)等均無顯著性差異（P＜0.05），結(jié)果顯示，雌二醇/卵泡數(shù)值大于600 pg/mL時的妊娠率、活產(chǎn)率顯著降低。有學(xué)者觀察了治療周期的卵子形態(tài)和胚胎質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)HCG扳機(jī)日雌二醇水平高者能產(chǎn)生質(zhì)量更好的卵子和胚胎，并且認(rèn)為血清雌二醇水平可以作為預(yù)測胚胎質(zhì)量的指標(biāo)。然而，本研究結(jié)果與其卻不盡相同，盡管血清雌二醇水平增高，獲卵數(shù)、受精卵數(shù)、卵裂數(shù)呈遞增趨勢，但優(yōu)質(zhì)胚胎率卻呈遞減趨勢，提示過高的雌二醇水平可能損害胚胎發(fā)育潛能。獲卵數(shù)和妊娠率并不呈正相關(guān)，因此，有學(xué)者提倡溫和刺激的理念用以“自然的”選擇最“合適”的卵子[16]。此外，根據(jù)一項(xiàng)由VAN DER GAAST等[17]進(jìn)行的7 422例IVF取卵患者參與的大型隊列研究數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)起始周期取卵個數(shù)為13時，每單個胚胎可以獲得最高的妊娠率。小鼠模型研究結(jié)果也提示，一個較狹窄范圍的血清雌激素水平就可能決定了“種植窗”的開放與關(guān)閉，并且其開放時間在低劑量雌激素維持中可以得到短時延續(xù)，而升高時則快速關(guān)閉[8]。

需值得注意的是，一些優(yōu)質(zhì)胚胎無論是新鮮周期還是冷凍周期，無論血清雌激素水平高低，都能“挺過”內(nèi)膜容受性缺陷并最終著床。因此，盡管血清雌二醇水平有高有低，子宮內(nèi)膜的容受性與血清雌二醇水平也并不是絕對地完全相關(guān)。最后，在推薦既往高雌二醇或高P水平移植失敗的患者進(jìn)行常規(guī)FET前，我們必須找到一些問題的答案，例如，F(xiàn)ET的最佳時機(jī)、HCG扳機(jī)日血清雌二醇及P的截斷值到底是多少，以考慮是否進(jìn)行鮮胚移植。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，在IVF卵巢正常反應(yīng)行GnRH?a長方案的患者中，雌二醇/卵泡數(shù)值對活產(chǎn)率有影響，F(xiàn)ET可避免高雌激素對子宮內(nèi)膜容受性的影響，從而獲得更高的妊娠率和活產(chǎn)率。本研究支持多數(shù)學(xué)者研究觀點(diǎn)，即在IVF?ET過程中，為了獲得更好的臨床結(jié)局，在可控范圍內(nèi)，盡可能選取較溫和的促排方案和劑量，因?yàn)槟繕?biāo)主要是卵母細(xì)胞的“質(zhì)量”，而非單純的“數(shù)量”。

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