槲皮素對糖尿病大鼠的降糖作用及機(jī)制研究*

王建禮 楊作成 王 聰 孫 芳 徐興華△

(1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院，濟(jì)寧 272067)

糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病，高血糖則是由于胰島素分泌缺陷或其生物作用受損，或兩者兼有引起。氧化應(yīng)激是指機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)的活性氧化物產(chǎn)生增多和抗氧化系統(tǒng)的清除能力降低，引起組織細(xì)胞損傷的一種病理狀態(tài)，主要通過氧化修飾DNA 堿基、氨基酸及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)等參與糖尿病的發(fā)生、發(fā)展[1]。研究表明，糖尿病患者體內(nèi)可能存在不同程度的氧化應(yīng)激紊亂[2]，胰島β細(xì)胞抗氧化酶的含量及活性相對較低，因而對活性氧產(chǎn)物介導(dǎo)的損害非常敏感，活性氧可直接損傷胰島β細(xì)胞，還可通過影響胰島素合成和分泌的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間接損傷胰島β細(xì)胞的功能。降低糖尿病患者體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平，防止氧化應(yīng)激對胰島細(xì)胞的進(jìn)一步損傷，或許對降低糖尿病的高血糖水平有一定作用。槲皮素是具有多種生物活性的黃酮類化合物，廣泛存在于蔬菜、水果、酒和茶葉中。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)槲皮素對人體起著重要的保護(hù)作用，包括抗氧化及清除自由基作用、抗炎及心血管保護(hù)和血糖調(diào)節(jié)作用[3-6]。本文在高脂飼料喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上，以鏈脲佐菌素腹腔注射制備大鼠2型糖尿病模型，旨在觀察槲皮素對2型糖尿病大鼠的血糖水平、體內(nèi)氧化應(yīng)激水平及對胰島組織中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，以及對糖代謝限速酶丙酮酸激酶活性的影響，探索槲皮素對2型糖尿病的降糖作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康雄性SD大鼠，50只，體重(220±20)g，由濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院動物中心提供。實(shí)驗(yàn)前尾靜脈采血測定大鼠空腹血糖，選取血糖在3.0～5.0mmol/L 者進(jìn)入本研究。

1.2 試劑及儀器

槲皮素(Sigma公司)；鏈脲佐菌素(Sigma公司)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)；丙酮酸激酶檢測試劑盒(南京建成生物工程有限公司)；Bax抗體(sc-6236，sant cruz biotechnology)；Bcl-2抗體(sc-56015，sant cruz biotechnology)；GAPDH抗體(sc-293335，sant cruz biotechnology)；抗兔IgG-HRP(sc-2370，sant cruz biotechnology)。血糖儀及試紙(強(qiáng)生醫(yī)療器械有限公司)；酶標(biāo)儀(Promega)；半干式碳板轉(zhuǎn)印電泳儀；雙垂直電泳槽(北京六一生物科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.12型糖尿病大鼠模型制備 適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠1周后，以高脂高糖飼料喂養(yǎng)4 周。以0.1M pH 4.0的檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液配制鏈脲佐菌素溶液；取大鼠，稱重，按45 mg/kg的劑量腹腔注射鏈脲佐菌素。72h后，取尾靜脈血測隨機(jī)血糖，血糖值>16.7mmol/L者，視為2型糖尿病大鼠模型復(fù)制成功。

1.3.2實(shí)驗(yàn)分組 將SD大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組和槲皮素組，每組10只。模型組給予1ml生理鹽水灌胃，槲皮素組按5mg/kg 槲皮素配成1ml溶液灌胃，對照組以1ml生理鹽水灌胃，時間為3周。

1.3.3血糖測定 實(shí)驗(yàn)分組后，每周一次取大鼠尾靜脈血，以血糖儀及試紙測定血糖，共3次。

1.3.4血清MDA含量、SOD活性的測定 灌胃3周后，取大鼠心臟血液，1000rpm離心10min，取血清，按試劑盒說明書測定各組大鼠血清中MDA的含量和SOD的活性。

1.3.5肝臟丙酮酸激酶的測定 灌胃3周后，取大鼠肝臟，勻漿，3000rpm離心10min，取上清，按試劑盒說明書測定各組大鼠肝組織中丙酮酸激酶的活性。

1.3.6Western bloting法測定胰腺組織中凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá) 灌胃3周后，取對照組、模型組和槲皮素組各6只大鼠胰腺組織30mg，置于液氮中冷凍，研磨，加入100ul組織細(xì)胞裂解液，吹打均勻；12000rpm，4℃離心10min，取上清。以BCA法進(jìn)行蛋白定量。加入上樣緩沖液，制備電泳蛋白樣本；進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)膜，以脫脂奶粉封閉，分別以Bax抗體、Bcl-2抗體和GAPDH抗體(內(nèi)參)孵育，4℃過夜，以TBST洗滌后，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(抗兔IGg HRP)室溫孵育1h，以TBST洗滌；以化學(xué)發(fā)光法顯影定影，拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對2型糖尿病大鼠血糖的影響

模型復(fù)制成功后，模型組各周測定的血糖值都顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3周后，槲皮素組大鼠的血糖值顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組SD大鼠血糖水平比較

注：與對照組相比，#P<0.05;與模型組相比，*P<0.05

2.2 槲皮素對2型糖尿病大鼠血清MDA含量和SOD活性以及肝臟丙酮酸激酶活性的影響

模型組大鼠血清中MDA含量顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，SOD活性顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，肝臟中丙酮酸激酶活性低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，槲皮素組大鼠血清中MDA含量低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，血清中SOD活性高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，肝臟中丙酮酸激酶活性都高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組SD大鼠血清MDA含量、SOD活性以及肝臟丙酮酸激酶活性水平比較

注：與對照組相比，#P<0.05;與模型組相比，*P<0.05

2.3 槲皮素對2型糖尿病大鼠胰腺組織中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)的影響

與對照組相比，模型組大鼠胰腺組織中抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；槲皮素組Bcl-2表達(dá)量高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)；模型組大鼠胰腺組織中促凋亡蛋白Bax表達(dá)量顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；槲皮素組Bax表達(dá)量低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：各組間比較，F(xiàn)=78.82，P<0.05，

與對照組相比，*P<0.05；

與模型組相比，#P<0.05，n=6

圖1 3組大鼠胰腺組織中Bcl-2的表達(dá)

注：各組間比較，F(xiàn)=140.22，P<0.05;

與對照組相比，*P<0.05；

與模型組相比，#P<0.05，n=6

圖2 3組大鼠胰腺組織中Bax的表達(dá)

3 討論

氧化應(yīng)激在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展過程中起了重要作用，抗氧化治療可以減輕氧化應(yīng)激，從而阻止或延緩糖尿病及其慢性并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展。因此，深入研究氧化應(yīng)激與糖尿病之間的相互關(guān)系，不僅有助于了解糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制，而且將為糖尿病及其并發(fā)癥的治療提供了一個新的策略。

本文采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周后，以鏈脲佐菌素一次腹腔注射法制備大鼠2型糖尿病模型[7]，所用劑量為45mg/kg體重，模型復(fù)制成功率達(dá)85%，且模型穩(wěn)定性好，3周時動物的血糖仍處于較高水平，且死亡率低。本型糖尿病大鼠，由于長期血糖處于較高水平，體內(nèi)氧化應(yīng)激水平高[8]。MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，可通過MDA了解膜脂過氧化的程度，以間接測定膜系統(tǒng)受損程度。SOD生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，能清除氧自由基，降低機(jī)體氧化應(yīng)激水平。本研究中所制備的2型糖尿病大鼠的血清中MDA含量高于對照組，SOD活性低于對照組，說明其氧化應(yīng)激水平較高。已有研究證實(shí)槲皮素具有較好的抗氧化作用，對于調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化應(yīng)激水平具有重要的意義，本研究中采用槲皮素治療后，大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平有所下降，血清中MDA含量與模型組相比有所下降，SOD活性也比模型組有所升高。因氧化應(yīng)激可降低外周組織對胰島素的敏感性，故本研究中槲皮素減輕了糖尿病大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平，使外周組織對胰島素的敏感性有所增加，可能是其降低血糖的一個機(jī)制。丙酮酸激酶是調(diào)節(jié)糖酵解的關(guān)鍵酶之一。丙酮酸激酶被激活,加速葡萄糖的分解；反之，通過糖酵解的葡萄糖就減少。糖酵解作為葡萄糖分解代謝的初始階段,其流量的變化對于組織對能量的需求有著重要影響。由此可以看出,丙酮酸激酶所調(diào)節(jié)的糖酵解是糖代謝的重要一環(huán),酶活性的高低對于血糖水平起著重要作用[9]。本研究還發(fā)現(xiàn)糖尿病模型組大鼠肝臟中丙酮酸激酶活性低于對照組，而給予槲皮素治療后能增加丙酮酸激酶活性，同時也使得血糖有所降低，故推測槲皮素升高糖尿病大鼠的丙酮酸激酶活性，也可能是其降低血糖的機(jī)制之一。另外，由于復(fù)制本糖尿病模型的原理為鏈脲佐菌素?fù)p傷胰島細(xì)胞，從而導(dǎo)致胰島素的分泌絕對不足，而隨之而來的高血糖也會使機(jī)體氧化應(yīng)激水平進(jìn)一步升高，可使胰島細(xì)胞凋亡增加；本研究中使用槲皮素治療后之所以能表現(xiàn)出降糖作用，可能與其降低機(jī)體氧化應(yīng)激水平，使抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增加，而促凋亡蛋白Bax表達(dá)減少，從而減輕氧化應(yīng)激所致的胰島細(xì)胞的凋亡，而在胰島細(xì)胞再生的作用下，胰島素的分泌有所增加，從而發(fā)揮出了降糖作用，但其是否確實(shí)能保護(hù)胰島細(xì)胞，尚需進(jìn)一步進(jìn)行胰島組織學(xué)的研究及體外培養(yǎng)胰島細(xì)胞進(jìn)行觀察。

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