嗎啡預(yù)處理對(duì)NGF誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞TRPV1通道敏化及ERK蛋白活化的影響

馬振曉，何淑芳，鄒桂昌，黃 成，熊 偉，張 野

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科，安徽 合肥 230601；2.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，中國(guó)科學(xué)院腦功能與腦疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230027)

心肌缺血/再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury, IRI)常見(jiàn)于心肌梗死后溶栓或冠脈介入治療，也可見(jiàn)于體外循環(huán)下的心臟手術(shù)、心臟驟停后的心肺復(fù)蘇等，導(dǎo)致缺血后心肌損傷和功能障礙進(jìn)一步加重，嚴(yán)重威脅患者的生命安全[1]。阿片類(lèi)藥物是心臟手術(shù)麻醉中廣泛應(yīng)用的鎮(zhèn)痛藥，椎管內(nèi)給藥是其常用的給藥方式。前期研究表明，鞘內(nèi)嗎啡預(yù)處理(morphine preconditioning, MPC)可明顯減輕心肌IRI[2]，但其具體機(jī)制仍不明確。心肌缺血/再灌注過(guò)程中，局部產(chǎn)生的大量代謝產(chǎn)物如酸性物質(zhì)、緩激肽、腺苷等，可激活心臟感覺(jué)傳入神經(jīng)元上的辣椒素受體(transient receptor potential vanilloid 1, TRPV1)，將傷害性感受信號(hào)經(jīng)背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion, DRG)上傳至脊髓和上級(jí)中樞[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，鞘內(nèi)MPC可抑制心肌缺血后脊髓背角神經(jīng)元興奮性[4]，并降低DRG組織中神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor, NGF)表達(dá)水平[5]。NGF是一種典型的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，其除了營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)的作用以外，還可通過(guò)敏化TRPV1通道，增加初級(jí)傳入神經(jīng)元對(duì)傷害性刺激的敏感性[6]。因此，本課題在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用體外DRG神經(jīng)元和PC12神經(jīng)細(xì)胞系，探討MPC對(duì)NGF誘導(dǎo)TRPV1通道電流的調(diào)控作用及其信號(hào)機(jī)制，以期闡明鞘內(nèi)MPC發(fā)揮心肌保護(hù)作用的神經(jīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 大鼠嗜鉻瘤細(xì)胞株P(guān)C12細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2藥物與試劑 MEM、neurobasal-A、高糖DMEM培養(yǎng)基、B27、胎牛血清、青、鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；多聚賴(lài)氨酸、胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、5-氟-2′脫氧尿苷、尿苷購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；辣椒素購(gòu)自美國(guó)Cayman公司；鹽酸嗎啡注射液(1 mL ∶10 mg,批號(hào)：120412.2)購(gòu)自沈陽(yáng)第一制藥廠；細(xì)胞外液(mmol·L-1)：NaCl 140.0、KCl 5.0、CaCl21.8、MgCl21.2、葡萄糖 5.0、HEPES 10.0，NaOH調(diào)pH值至7.4；電極內(nèi)液(mmol·L-1)：CsCl 120.0、MgCl24.0、EGTA 10.0、HEPES 10.0、Na-GTP 0.5、Mg-ATP 2.0，CsOH調(diào)pH值至7.2。電極內(nèi)液和電極外液中所有試劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；鼠抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuronal specific enolase, NSE)抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；鼠抗TRPV1抗體、兔抗磷酸化TRPV1(phosphorylated TRPV1, p-TRPV1)抗體購(gòu)自美國(guó)Abnova公司；兔抗細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase, ERK)抗體和兔抗p-ERK抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；鼠抗β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；Alexa594標(biāo)記的山羊抗鼠熒光抗體和 HRP標(biāo)記的山羊抗兔、山羊抗鼠抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司；ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.1.3儀器 玻璃電極購(gòu)自武漢微探科學(xué)儀器有限公司，Axopatch 200B型膜片鉗放大器購(gòu)自美國(guó)Axon公司，凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海天能科技公司。

1.2DRG細(xì)胞分離與培養(yǎng)10日齡健康SD大鼠，♀♂不拘，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠乙醇浸泡后斷頭處死、縱行剖開(kāi)胸段T2-T8脊柱。于解剖顯微鏡下分離出兩側(cè)椎間孔內(nèi)圓形透亮神經(jīng)節(jié)，轉(zhuǎn)入4℃含有10%胎牛血清、1%青、鏈霉素的MEM培養(yǎng)基中。使用眼科剪將神經(jīng)節(jié)上被膜剝離干凈，再將其移入加有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.025%胰蛋白酶和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的I型膠原酶的離心管中，37℃水浴消化40 min。使用含有胎牛血清的MEN培養(yǎng)基洗酶3次后，使用拋光玻璃滴管吹打至單細(xì)胞懸液，接種于事先包被多聚賴(lài)氨酸的24孔板中，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3DRG神經(jīng)元純化及鑒定DRG神經(jīng)元完成貼壁后，全量換液為含有2% B27、50 μg·L-1NGF、50 μmol·L-15-氟-2′脫氧尿苷及150 μmol·L-1尿苷的neurobasal-A培養(yǎng)基培養(yǎng)純化。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，用預(yù)熱的PBS洗10 min×3次；0.1% Triton X-100通透5 min，PBS洗10 min×3次；2%山羊血清封閉1 h，并加入抗NSE鼠抗(1 ∶100)4℃孵育過(guò)夜。次日用PBS洗10 min×3次，加入Alexa594標(biāo)記的山羊抗鼠熒光抗體(1 ∶500)，室溫避光孵育1 h，DAPI染核；PBS漂洗后，加入熒光封片劑封片，于熒光顯微鏡下觀察。

1.4DRG細(xì)胞分組與處理原代培養(yǎng)48 h后的DRG神經(jīng)元采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組(n=10)：對(duì)照組(C組)、NGF刺激組(NGF組)、3個(gè)嗎啡預(yù)處理組(MPC 0.3、1.0、3.0 μmol·L-1組)。C組細(xì)胞正常培養(yǎng)，NGF組細(xì)胞給予含NGF 100 μg·L-1的neurobasal-A培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h，MPC組細(xì)胞于NGF培養(yǎng)前分別給予終濃度為0.3、1.0、3.0 μmol·L-1的含嗎啡neurobasal-A培養(yǎng)液，孵育10 min后，換用無(wú)嗎啡培養(yǎng)基培養(yǎng)30 min。上述處理后，各組DRG神經(jīng)元給予100 nmol·L-1辣椒素刺激，即刻采用單細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)辣椒素誘發(fā)電流。

1.5全細(xì)胞膜片鉗記錄玻璃電極使用P-1000電極拉制儀拉制，尖端直徑1.5 μm，入液電阻3～5 MΩ，微電極內(nèi)充灌電極內(nèi)液。高倍鏡下選取邊界清晰、表面光整、反光明顯、有較強(qiáng)光暈及完整突起的神經(jīng)元進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。當(dāng)電極貼近細(xì)胞后，予以負(fù)壓吸引細(xì)胞膜，形成高阻封接(>1 GΩ)，后給予脈沖式負(fù)壓吸破細(xì)胞膜，形成全細(xì)胞記錄模式，鉗制電壓-60 mV。待基線穩(wěn)定，采用電壓鉗模式，通過(guò)微操縱給藥系統(tǒng)給予辣椒素(終濃度100 nmol·L-1)，觀察全細(xì)胞電流變化，并經(jīng)過(guò)Axopatch 200B型膜片鉗放大器及Clampfit10.6軟件采集分析后，輸入計(jì)算機(jī)儲(chǔ)存。

1.6大鼠嗜鉻瘤細(xì)胞PC12細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理PC12細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到80%～90%時(shí)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.025%的胰酶消化細(xì)胞，吹打均勻并1 ∶3傳代。正常培養(yǎng)的PC12細(xì)胞，接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到80%～90%時(shí)，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組(n=3)：對(duì)照組(C組)、NGF刺激組(NGF組)、3個(gè)嗎啡預(yù)處理組(MPC 0.3、1.0、3.0 μmol·L-1組)。C組細(xì)胞正常培養(yǎng)，NGF組細(xì)胞加入100 μg·L-1NGF孵育1 h， MPC組細(xì)胞于NGF培養(yǎng)前分別給予終濃度為0.3、1.0、3.0 μmol·L-1的含嗎啡高糖DMEM培養(yǎng)液，孵育10 min后，再換為無(wú)嗎啡的培養(yǎng)基培養(yǎng)30 min。培養(yǎng)結(jié)束前，各組PC12細(xì)胞均加入100 nmol·L-1辣椒素刺激30 min后，收集細(xì)胞用于Western blot檢測(cè)。

1.7Westernblot檢測(cè)TRPV1、p-TRPV1及p-ERK的相對(duì)表達(dá)量上述各組PC12細(xì)胞處理結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，4℃ PBS清洗細(xì)胞后加入蛋白裂解液，冰上靜置裂解30 min后，15 000 r·min-1、4℃離心10 min后，取上清，BCA定量法檢測(cè)樣品蛋白含量后，于-80 ℃保存。每組取20 μg蛋白行SDS-PAGE電泳后，將蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，置于含5%牛奶TBST溶液中封閉1 h后，分別置于鼠抗TRPV1(1 ∶250)、兔抗p-TRPV1(1 ∶250)、兔抗ERK(1 ∶1 000)、兔抗p-ERK(1 ∶1 000)和鼠抗β-actin(1 ∶500)抗體中，4℃搖床孵育過(guò)夜。次日TBST洗膜5 min×4次，再置于HRP標(biāo)記的二抗(1 ∶10 000)中室溫孵育1 h，TBST洗膜5 min×4次。使用ECL發(fā)光試劑盒，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光采集圖像，并分析條帶光密度。分別以目的蛋白與β-actin蛋白灰度值的比值反映蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1DRG神經(jīng)元鑒定結(jié)果倒置相差顯微鏡下可見(jiàn)，DRG神經(jīng)元胞體呈橢圓形，具有折光性，周?chē)忻黠@光暈，神經(jīng)元軸突之間交織成密集纖維網(wǎng)(Fig 1A)。NSE為神經(jīng)細(xì)胞所特有，可以作為神經(jīng)元區(qū)別于其他細(xì)胞的標(biāo)記物。免疫熒光染色結(jié)果顯示，DRG神經(jīng)元胞質(zhì)和軸突呈綠色，胞核復(fù)染呈藍(lán)色，為NSE陽(yáng)性；而施萬(wàn)細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等雜細(xì)胞僅有細(xì)胞核被染成藍(lán)色。說(shuō)明DRG神經(jīng)元培養(yǎng)成功(Fig 1B)。

Fig 1 Identification of DRG neurons (scale bar=200 μm)

A:The morphology of DRG neurons; B: The NSE immunofluorescence of DRG neurons.Blue marker is cell nucleus.Green colour is NSE fluorescence coloration.

2.2全細(xì)胞膜片鉗結(jié)果Fig 2的膜片鉗結(jié)果顯示，與C組比較，NGF組DRG神經(jīng)元的辣椒素誘發(fā)內(nèi)向電流增強(qiáng)(P<0.01)；與NGF組相比，各MPC組DRG神經(jīng)元內(nèi)向電流明顯降低(P<0.01)，提示NGF對(duì)DRG神經(jīng)元辣椒素誘發(fā)電流具有敏化作用，而MPC對(duì)敏化具有明顯的抑制作用。

2.3TRPV1蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果Fig 3的Western blot 結(jié)果顯示，與C組比較，NGF組PC12細(xì)胞的TRPV1及p-TRPV1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯上調(diào)(P<0.05)；與NGF組相比，各MPC組p-TRPV1蛋白相對(duì)表達(dá)量下調(diào)(P<0.05)，其中，MPC 0.3組TRPV1蛋白相對(duì)表達(dá)量下調(diào)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Fig 2 The inhibitory effects of morphine preconditioning on capsaicin triggered inward current in DRG cells

A: Whole-cell currents on DRG neurons; B: The data points of capsaicin amplitude (C,n=11 from 4 rats; NGF,n=15 from 4 rats; MPC 0.3,n=10 from 4 rats; MPC 1.0,n=10 from 4 rats; MPC 3.0,n=10 from 4 rats).**P<0.01vsC group;##P<0.01vsNGF group.

Fig 3 Effects of morphine preconditioning on expression of p-TRPV1 and TRPV1

A: Representative immune blot band of p-TRPV1, TRPV1 and β-actin protein in each group; B: The relative expression of p-TRPV1, TRPV1.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsNGF group.

2.4ERK蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果Fig 4的Western blot結(jié)果顯示，與C組比較，NGF組PC12細(xì)胞的p-ERK蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯上調(diào)(P<0.05)；與NGF組相比，各MPC組p-ERK蛋白相對(duì)表達(dá)量下調(diào)(P<0.05)。

Fig 4 Effects of morphine preconditioning on expression of p-ERK

A: Representative immune blot band of p-ERK, ERK and β-actin protein in each group; B:The relative level of p-ERK/ERK.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsNGF group.

3 討論

IRI是常見(jiàn)的心臟手術(shù)圍術(shù)期并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者術(shù)后恢復(fù)，甚至威脅患者生命安全[1]。有研究表明，鞘內(nèi)MPC可減輕心肌IRI[2]，并同時(shí)抑制脊髓神經(jīng)元興奮性[4]，降低DRG組織中NGF水平[5]。在此基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)體外培養(yǎng)DRG神經(jīng)元及PC12細(xì)胞系，模擬心肌缺血/再灌注損傷中T2-T8節(jié)段DRG神經(jīng)元狀態(tài)，闡明了MPC可能通過(guò)抑制NGF對(duì)DRG神經(jīng)元ERK蛋白活化，從而減輕TRPV1通道敏化，進(jìn)一步產(chǎn)生心肌保護(hù)作用。

DRG神經(jīng)元在傷害感受信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中起十分重要的作用，采用單細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄DRG神經(jīng)元全細(xì)胞電流，是研究神經(jīng)元興奮性和離子通道電流變化的重要手段[7]。參考文獻(xiàn)[8-9]的方法，分離培養(yǎng)大鼠T2-T8節(jié)段DRG神經(jīng)元，所得細(xì)胞NSE染色陽(yáng)性，狀態(tài)良好，膜表面光滑、完整。電極接觸細(xì)胞膜表面，易于形成高阻封接，封接電阻大于1 GΩ。

DRG神經(jīng)元上分布大量TRPV1受體，該受體通道是一種非選擇性陽(yáng)離子通道[10]，激活后誘發(fā)神經(jīng)元內(nèi)向電流，在傷害性刺激的感知、傳遞和調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[11]。辣椒素為T(mén)RPV1通道的特異性激動(dòng)劑[12]，因此，利用外源性辣椒素誘發(fā)T2-T8節(jié)段DRG神經(jīng)元內(nèi)向電流，可以模擬心肌缺血刺激誘導(dǎo)的TRPV1通道活化。NGF是神經(jīng)元存活和維持所必需的營(yíng)養(yǎng)因子，其與受體結(jié)合后可誘導(dǎo)TRPV1 敏化，增強(qiáng)神經(jīng)元放電，參與炎癥或損傷誘導(dǎo)的痛覺(jué)過(guò)敏[13]。心肌梗死后，局部缺血心肌及DRG組織內(nèi)NGF表達(dá)水平均升高，但其是否通過(guò)致敏TRPV1通道，參與心肌缺血傷害刺激信號(hào)的傳遞過(guò)程，尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)利用外源性NGF刺激DRG神經(jīng)元，模擬體內(nèi)DRG神經(jīng)元所處的環(huán)境。膜片鉗結(jié)果顯示，NGF刺激可以增強(qiáng)辣椒素誘發(fā)的DRG神經(jīng)元內(nèi)向電流，表明NGF對(duì)TRPV1通道具有敏化作用。在給予0.3、1.0、3.0 μmol·L-1的嗎啡進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，再以NGF刺激TRPV1通道活化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MPC可以明顯減弱DRG神經(jīng)元的內(nèi)向電流，表明MPC可抑制NGF刺激引起TRPV1通道敏化。以上結(jié)果提示，鞘內(nèi)MPC的心肌保護(hù)作用可能與其調(diào)控NGF誘導(dǎo)的DRG神經(jīng)元TRPV1通道敏化有關(guān)。

PC12細(xì)胞是一種常用的神經(jīng)細(xì)胞株，來(lái)源于可移植的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤，其細(xì)胞膜表面表達(dá)NGF受體，常被用于NGF作用分子機(jī)制的研究[14]。Western blot結(jié)果表明，NGF孵育可明顯升高PC12細(xì)胞內(nèi)辣椒素誘導(dǎo)的TRPV1蛋白表達(dá)水平，以及TRPV1、ERK蛋白磷酸化水平，而MPC可以抑制該表達(dá)上調(diào)。ERK信號(hào)通路是絲裂原活化蛋白激酶家族中的重要亞族，參與調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化，并在NGF致敏TRPV1的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[15]。因此，MPC抑制NGF誘導(dǎo)的TRPV1通道敏化，可能是通過(guò)抑制TRPV1蛋白本身表達(dá)量及其磷酸化而實(shí)現(xiàn)的，并且與抑制神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)ERK信號(hào)蛋白活化相關(guān)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MPC可以通過(guò)調(diào)節(jié)TRPV1蛋白本身表達(dá)量及其磷酸化水平，減弱NGF誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞TRPV1通道敏化，且這一過(guò)程可能與抑制神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)ERK蛋白磷酸化相關(guān)，為鞘內(nèi)MPC發(fā)揮心肌保護(hù)作用的神經(jīng)機(jī)制研究提供了理論依據(jù)。

(致謝：感謝安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室及中國(guó)科學(xué)院腦功能與腦疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室為本課題研究提供儀器設(shè)備和技術(shù)支持。)

參考文獻(xiàn)：

[1] Yellon D M, Hausenloy D J.Myocardial reperfusion injury[J].NEnglJMed, 2007,357(11):1121-35.

[2] Li R, Wong G T, Wong T M, et al.Intrathecal morphine preconditioning induces cardioprotection via activation of delta, kappa, and mu opioid receptors in rats[J].AnesthAnalg, 2009,108(1):23-9.

[3] Peart J N, Gross E R, Gross G J.Opioid-induced preconditioning: recent advances and future perspectives[J].VasculPharmacol, 2005,42(5-6):211-8.

[4] 黃 成, 何淑芳, 許世進(jìn), 等.鞘內(nèi)嗎啡預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注大鼠脊髓背角SG區(qū)神經(jīng)元興奮性的影響[J].中華麻醉學(xué), 2016,36(7): 771-5.

[4] Huang C, He S F, Xu S J, et al.Effect of inthathecal morphine preconditioning on excitability of substantia gelatinosa neurons in dorsal horn of spinal cord in a rat model of myocardial ischemia-reperfusion[J].ChinJAnesthesiol, 2016,36(7):771-5.

[5] 許世進(jìn), 何淑芳, 胡 軍, 等.鞘內(nèi)嗎啡預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響[J].中華麻醉學(xué), 2016,36(6):666-9.

[5] Xu S J, He S F, Hu J, et al.Effect of intrathecal morphine preconditioning on expression of nerve growth factor in dorsal root ganglia in a rat model of myocardial ischemia-reperfusion [J].ChinJAnesthesiol, 2016,36(6):666-9.

[6] Ieda M, Kanazawa H, Ieda Y, et al.Nerve growth factor is critical for cardiac sensory innervation and rescues neuropathy in diabetic hearts[J].Circulation, 2006,114(22): 2351-63.

[7] 蔡 捷, 方 東, 李 松, 等.膜片鉗技術(shù)在慢性痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元電生理學(xué)特性改變中的應(yīng)用[J].中國(guó)疼痛醫(yī)學(xué)雜志, 2017,23(1):25-8.

[7] Cai J, Fang D, Li S, et al.The application of patch-clamo recordings in the change of dorsal root ganglion neurons electrophysiological properties of chronic bone cancer pain[J].ChinJPainMed, 2017,23(1):25-8.

[8] Newberry K, Wang S, Hoque N, et al.Development of a spontaneously active dorsal root ganglia assay using multiwell multielectrode arrays[J].JNeurophysiol, 2016,115(6):3217-28.

[9] 張成標(biāo), 喻曉路, 潘志強(qiáng), 等.一種適合膜片鉗單通道記錄的大鼠DRG神經(jīng)元急性分離方法[J].中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2011,27(4):510-2.

[9] Zhang C B, Yu X L, Pan Z Q, et al.A method of acutely isolating rat dorsal root ganglion neurons for patch-clamp study of single channel[J].ChinJApplPhysiol, 2011,27(4):510-2.

[10] Caterina M J, Schumacher M A, Tominaga M, et al.The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway[J].Nature, 1997,389(6653):816-24.

[11] Liu D L, Wang T W, Xing J L, et al.Research progress in transient receptor vanilloid 1 of sensory nervous system[J].NeurosciBull, 2009,25(4):221-7.

[12] Yang F, Xiao X, Cheng W, et al.Structural mechanism underlying capsaicin binding and activation of the TRPV1 ion channel[J].NatChemBiol, 2015,11(7):518-24.

[13] Priestley J V, Michael G J, Averill S, et al.Regulation of nociceptive neurons by nerve growth factor and glial cell line derived neurotrophic factor[J].CanJPhysiolPharmacol, 2002,80(5):495-505.

[14] 竇夢(mèng)云, 何淑芳, 黃 成, 等.慢病毒介導(dǎo)的NGF基因沉默對(duì)PC12細(xì)胞分化的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2016,32(8):1153-8.

[14] Dou M Y, He S F, Huang C, et al.Lentivirus-mediated NGF gene silencing inhibited differentiation of PC12 Cells[J].ChinPharmacolBull, 2016,32(8):1153-8.

[15] Zhuang Z Y, Xu H, Clapham D E, et al.Phosphatidylinositol 3-kinase activates ERK in primary sensory neurons and mediates inflammatory heat hyperalgesia through TRPV1 sensitization[J].JNeurosci, 2004,24(38):8300-9.