超聲波輔助酶法脫除石莼水溶性膳食纖維中蛋白質(zhì)的工藝研究

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(福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

水溶性膳食纖維(Soluble dietary fiber,SDF)廣泛存在于植物中，具有抗氧化、抗衰老、抗癌癥和提高機體免疫力的功效，對高血糖、高血脂、高血壓等均有降低功效[1-2]。然而在酶法水提石莼SDF的過程中，常會混入溶解性質(zhì)相同的游離蛋白和一些與SDF結(jié)合形成的糖蛋白復(fù)合物，而蛋白質(zhì)因其所帶的電荷，會吸附大量其他雜質(zhì)[3-4]，可能影響對SDF結(jié)構(gòu)及生物活性的研究，所以分離、純化SDF需要脫蛋白。目前植物類SDF脫蛋白常用的方法有Sevage法、三氯乙酸(TCA)法、鹽酸法、酶法等[5]，這些方法普遍存在SDF損失率高、SDF活性易被破壞、需消耗大量有機溶劑、繁瑣耗時及安全等問題。

超聲波具有穿透力強和空化、震蕩等效應(yīng)[6]，當(dāng)其作用于酶解體系時，可以改變酶分子的結(jié)構(gòu)及催化點，從而提高酶催化活性，縮短酶解時間[7]。采用超聲波輔助酶法脫除天然大分子中蛋白質(zhì)，可避免引入有機試劑，具有蛋白質(zhì)脫除率高、產(chǎn)物損失率低、利于保持產(chǎn)物的活性等優(yōu)勢，是一種值得推廣的高效脫蛋白方法[8]。

本研究采用超聲波輔助堿性蛋白酶法去除石莼SDF中的蛋白質(zhì)。以蛋白脫除率和SDF保留率作為指標(biāo)，探討各主要因素對石莼SDF蛋白質(zhì)脫除效果的影響，并采用L9(34)正交試驗確定超聲波輔助酶法脫蛋白的優(yōu)化工藝參數(shù)，為研究石莼SDF的生理活性和開發(fā)保健食品、藥品等提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

孔石莼粉(80目)：購于福建海興保健食品有限公司；石莼SDF粗品粉末：將原材料孔石莼制成懸浮液，提取、過濾、離心，蒸發(fā)濃縮至原來體積1/10，按濃縮液與無水乙醇體積比1∶4加入無水乙醇，靜置過夜，離心，微量蒸餾水溶解沉淀，冷凍干燥后即為石莼SDF粗提物；堿性蛋白酶(比活力：2.0×105U/g)：江蘇銳陽生物科技有限公司；95%乙醇、苯酚、濃硫酸、葡萄糖、考馬斯亮藍(lán)、檸檬酸、碳酸鈉：均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

試驗用的儀器、設(shè)備如表1所示。

表1 試驗儀器與設(shè)備

1.3 試驗內(nèi)容與方法

1.3.1 石莼SDF超聲波輔助酶法脫蛋白工藝流程

石莼SDF粗品粉末→加蒸餾水溶解→調(diào)節(jié)石莼SDF溶液的濃度→調(diào)節(jié)pH值→添加堿性蛋白酶→堿性蛋白酶活化30 min→超聲波酶解→沸水浴鍋中滅酶10 min→冷卻、4 000 r/min離心10 min→脫蛋白后的SDF溶液→稀釋、定容→紫外分光光度計中在波長510 nm和490 nm處分別測其吸光值→計算石莼SDF中的蛋白質(zhì)含量和SDF含量。

1.3.2 石莼SDF超聲波輔助酶法脫蛋白單因素試驗

1)酶解pH對石莼SDF超聲波輔助酶法脫蛋白效果的影響

石莼SDF粗品粉末加蒸餾水溶解配制成濃度為0.6%的石莼SDF溶液，準(zhǔn)確移取5份等體積的上述溶液，分別調(diào)節(jié)其pH為 8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，按每g石莼SDF粗品粉末1 000 U酶的量分別加入活化后的堿性蛋白酶，混勻，在溫度為55℃、功率為200 W的超聲波中酶解2 h，結(jié)束后滅酶10 min，在4 000 r/min條件下離心10 min，以一定倍數(shù)稀釋上清液，分別測定并計算SDF中的蛋白質(zhì)含量和SDF含量。

2)超聲時間對石莼SDF超聲波輔助酶法脫蛋白效果的影響

試驗分五組，固定石莼SDF粗品溶液的pH值11.0，設(shè)超聲輔助酶解時間依次為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，其余條件和操作同1)。

3)超聲功率對石莼SDF超聲波輔助酶法脫蛋白效果的影響

設(shè)五組試驗，調(diào)節(jié)超聲波功率分別為0、200、300、400、500 W，超聲酶解時間均控制為1.5 h，其余條件和操作同2)。

4)超聲溫度對石莼SDF超聲波輔助酶法脫蛋白效果的影響

試驗分五組，控制超聲功率為200 W，設(shè)超聲溫度依次為40、45、50、55、60℃，其余條件和操作同3)，進(jìn)行試驗。

5)底物濃度對石莼SDF超聲波輔助酶法脫蛋白效果的影響

試驗設(shè)五組，控制超聲溫度為50℃，配制底物(石莼SDF)濃度依次為0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%，其余條件和操作同4)。

6)堿性蛋白酶使用量對石莼SDF超聲波輔助酶法脫蛋白效果的影響

設(shè)五組試驗，固定石莼SDF的濃度為0.6%，分別設(shè)堿性蛋白酶的使用量為800、1 000、1 200、1 400、1 600 U/g石莼SDF粗品粉末，其余條件和操作同5)。

1.3.3 石莼SDF超聲波輔助酶法脫蛋白關(guān)鍵工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗，確定石莼SDF溶液的pH值(A)、超聲溫度(B)、堿性蛋白酶使用量(C)、超聲時間(D)為關(guān)鍵影響因素，以SDF保留率和蛋白質(zhì)脫除率為考察指標(biāo)，設(shè)計L9(34)正交試驗優(yōu)化超聲波輔助酶法脫除SDF蛋白質(zhì)關(guān)鍵工藝。正交試驗因素水平設(shè)計見表2。

表2 L9(34)正交試驗因素水平表

1.4 指標(biāo)與測定方法

1.4.1 石莼SDF含量測定

采用苯酚-硫酸法測定SDF含量[9]。

式中：M1、M2分別為脫蛋白前后石莼SDF樣液中的SDF含量(mg/g)。

1.4.2 石莼SDF中蛋白質(zhì)含量測定

1.5 統(tǒng)計分析

采用DPSv7.05軟件進(jìn)行分析，用LSD法對各單因素的均值進(jìn)行差異性分析，P<0.01為極顯著差異，P<0.05為顯著差異，P>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解pH對石莼SDF超聲波輔助酶法脫蛋白效果的影響

如圖1所知，樣液pH值落在8～11范圍內(nèi)，石莼SDF的蛋白質(zhì)脫除率與酶解液pH值呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)關(guān)系，從(74.21±0.28)%增加到(81.38±0.36)% (P<0.01)；而SDF保留率隨酶解液pH值的增大，從(89.29±0.23)%下跌到(84.80±0.20)% (P<0.01)；之后隨pH的增大，石莼SDF的蛋白質(zhì)脫除率下降(P<0.01)，石莼SDF保留率升高(P<0.01)。

因為堿性蛋白酶的作用條件適合于偏堿性[11]，當(dāng)pH值逐漸接近11時，由于解離基團(tuán)處于堿性蛋白酶的最合適的解離狀態(tài)，此時酶分子更易與底物蛋白分子結(jié)合，蛋白脫除率升高；但pH值大于11后，由于其帶電基團(tuán)的解離狀態(tài)偏離其最適構(gòu)象所需的狀態(tài)，阻礙了其與底物相結(jié)合，酶活性降低，蛋白質(zhì)脫除率降低[6]，同時與蛋白質(zhì)結(jié)合的SDF損失也相應(yīng)變少；故其理想pH值為11.0左右。

2.2 超聲時間對石莼SDF超聲波輔助酶法脫蛋白效果的影響

如圖2所示，當(dāng)超聲時間在0.5～1.5 h之間時，石莼SDF的蛋白質(zhì)脫除率隨時間延長而升高，對石莼SDF的蛋白質(zhì)脫除率和SDF保留率的影響均為極顯著(P<0.01)。SDF蛋白質(zhì)脫除率從(72.56±0.19)%提高到(81.51±0.25)%，而石莼SDF保留率從(90.09±0.21)%下降到(84.39±0.24)%，1.5 h后兩指標(biāo)的值隨超聲時間的延長保持穩(wěn)定(P>0.05)。

延長超聲時間可強化超聲波的各種效應(yīng)，加大分子振動擴散，酶與蛋白質(zhì)充分作用，加快酶促反應(yīng)，蛋白質(zhì)脫除效果明顯[12-13]，但蛋白酶特異性較強，降解到一定程度后，繼續(xù)延長超聲時間并不能提高其作用；此外，過長時間超聲作用反而會使酶活性下降，而且石莼SDF的結(jié)構(gòu)也會遭到破壞，甚至碳環(huán)裂解[14]，造成損失，綜上，超聲時間以1.5 h較適宜。

2.3 超聲功率對石莼超聲波輔助酶法SDF脫蛋白效果的影響

如圖3所示，在200 W之內(nèi)，超聲功率對石莼SDF的蛋白質(zhì)脫除率和SDF保留率的影響均為極顯著(P<0.01)，其蛋白質(zhì)脫除率從(72.54±0.17)%提高至(81.52±0.13)%，而SDF保留率卻從(90.01±0.32)%降至(84.36±0.11)%；隨著超聲功率的進(jìn)一步提高，其蛋白質(zhì)脫除率反而呈極顯著(P<0.01)下降趨勢，而SDF保留率先極顯著(P<0.01)升高后顯著(P<0.05)下降。

在超聲波的機械振動和空化效應(yīng)的影響下，溶質(zhì)的傳遞作用加快，有助于反應(yīng)底物進(jìn)入酶的催化部位[15]，適宜強度的超聲波改變了酶分子構(gòu)象，易與底物分子結(jié)合，提高酶解效率[16]。適宜超聲處理可削弱蛋白質(zhì)和SDF之間的作用力，使蛋白質(zhì)易脫除；當(dāng)超聲功率超過200 W時，過高的超聲波強度和強烈的空化效應(yīng)和機械作用會破壞酶分子的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶鈍化甚至失活[17]，降低SDF蛋白脫除率，而且當(dāng)超聲功率超過400 W時，高熱量聚集和強烈的剪切和振動作用亦會打斷SDF的鏈結(jié)構(gòu)，造成SDF保留率下降[18]；故石莼SDF脫蛋白的適宜的超聲功率為200 W左右。

2.4 超聲溫度對石莼SDF超聲波輔助酶法脫蛋白效果的影響

如圖4所示，在40～50℃范圍內(nèi)，超聲溫度對石莼SDF的蛋白質(zhì)脫除率和SDF保留率的影響均極顯著(P<0.01)，當(dāng)超聲溫度達(dá)到50℃時，脫除率和保留率分別為(81.56±0.23)%和(84.01±0.13)%；但隨溫度的繼續(xù)升高，石莼SDF的蛋白質(zhì)脫除率極顯著(P<0.01)降低，而SDF保留率呈顯著(P<0.05)遞增趨勢。

當(dāng)溫度低于酶解最適溫度時，酶分子在溶液中的擴散動力隨溫度上升而增大，加劇酶促反應(yīng)，提高SDF的蛋白質(zhì)脫除率，與此同時有些SDF與蛋白質(zhì)合成糖蛋白質(zhì)復(fù)合物亦可能被脫除，從而降低SDF的保留率[11]。但超聲溫度超過酶的最適反應(yīng)溫度時，酶的空間結(jié)構(gòu)被破壞而漸漸變性[19]，導(dǎo)致SDF的脫蛋白效果急劇下降，而SDF的保留率呈現(xiàn)略微上升趨勢，故石莼SDF脫蛋白的理想超聲溫度為50℃左右。

2.5 底物濃度對石莼SDF超聲波輔助酶法脫蛋白效果的影響

如圖5所示，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.4%時，酶的濃度過低，故SDF的蛋白質(zhì)脫除率極低。隨著底物(石莼SDF)濃度增大，對石莼SDF的蛋白質(zhì)脫除率和SDF保留率的影響均為極顯著(P<0.01)。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.6%，石莼SDF的蛋白質(zhì)脫除率達(dá)到最大值，為(81.56±0.39)%，之后呈逐漸下降，而石莼SDF保留率達(dá)到最小值，為(82.87±0.23)%，之后呈逐漸上升趨勢。

底物濃度過低時，SDF溶液的流動性較大，底物與酶充分反應(yīng)，隨著底物濃度逐漸增大，酶解程度也隨之加大，SDF的蛋白質(zhì)脫除率提高，SDF損耗增加；但底物濃度過高時，SDF溶液的流動性下降，酶與底物難以完全接觸，限制酶解反應(yīng)速度[20]，蛋白質(zhì)脫除效果變差，而SDF保留率變大，石莼SDF的濃度控制在0.6%左右較適宜。

2.6 堿性蛋白酶使用量對石莼SDF超聲波輔助酶法脫蛋白效果的影響

如圖6所示，石莼SDF的蛋白質(zhì)脫除率和SDF保留率與堿性蛋白酶使用量在800～1 200 U/g間存在明顯的量效關(guān)系，其蛋白質(zhì)脫除率從(78.56±0.11)%極顯著(P<0.01)提高到(82.28±0.11)%；而SDF保留率從(89.15±0.14)%極顯著(P<0.01)降到(81.50±0.15)%。酶使用量大于1 200 U/g后，兩個指標(biāo)無顯著變化(P>0.05)。

底物濃度在一定的情況下，酶促反應(yīng)速度隨蛋白酶使用量的增多而加快，部分SDF亦受到蛋白酶的作用而發(fā)生降解；當(dāng)酶的使用量達(dá)一定程度后，酶促反應(yīng)達(dá)到飽和[21]，此時SDF中蛋白質(zhì)基本去除完全，故石莼SDF脫蛋白的堿性蛋白酶使用量以1 200 U/g左右較適宜。

2.7 石莼SDF超聲波輔助酶法脫蛋白關(guān)鍵工藝參數(shù)優(yōu)化

2.7.1 試驗結(jié)果

由表3中的極差R值可知，各因素對石莼SDF蛋白質(zhì)脫除率和SDF保留率的影響大小順序均是：A >C>B >D，即酶解液pH>超聲溫度>堿性蛋白酶使用量>超聲時間，但其蛋白質(zhì)脫除率和SDF保留率的優(yōu)化工藝條件組合分別是A2B3C2D2 、A3B2C1D1。由于上述兩個指標(biāo)的優(yōu)化組合條件不同，故以綜合評分來表示試驗結(jié)果。該處理的綜合評分(Z)是將試驗各指標(biāo)的權(quán)值加和后得到。指標(biāo)的權(quán)重分別為：蛋白質(zhì)脫除率占70%、SDF保留率占30%。綜合分值公式根據(jù)劉魁英的計算方法[22]，公式如下：

Zi=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin)；Z=Z1×0.7+Z2×0.3

(3)

式中：Zi為各項指標(biāo)的得分，Z1為石莼SDF的蛋白質(zhì)脫除率，Z2為石莼SDF保留率，Z為綜合得分；Yi為每組試驗各指標(biāo)值，Ymax為各指標(biāo)中最大數(shù)值，Ymin為各指標(biāo)中最小數(shù)值；0.7、0.3分別為SDF蛋白質(zhì)脫除率與SDF保留率的加權(quán)系數(shù)，結(jié)果見表4。表4為根據(jù)綜合評分后獲得的極差R值結(jié)果，該表數(shù)據(jù)顯示：當(dāng)pH為11.0、酶使用量為1 400 U/g、超聲溫度為50℃、超聲時間為1.5 h時，石莼SDF的蛋白質(zhì)脫除效果最好。表6方差分析表明，在本試驗的條件下，酶解液pH和堿性蛋白酶使用量對石莼SDF的蛋白質(zhì)脫除率均為極顯著(P<0.01)影響；而超聲溫度對石莼SDF保留率的影響顯著(P<0.05)，超聲時間影響不顯著(P>0.05)。

表3 正交試驗設(shè)計結(jié)果與分析(n=3)

表5 綜合評分法極差分析表

表6 綜合評分法的正交試驗方差分析表

注：*、**分別表示在α為0.05、0.01水平顯著；F0.05(2，2)=19.00；F0.01(2，2)=99.00。

Notes：*，* * in the alpha indicated 0.05，0.01 significant level，respectively.F0.05(2，2)=19.00；F0.01(2，2)=99.00.

2.7.2 參數(shù)優(yōu)化及驗證性試驗

表5數(shù)據(jù)顯示，以綜合評分為指標(biāo)，優(yōu)化后的石莼SDF脫蛋白關(guān)鍵工藝條件組合為A2B3C2D2，即pH 11.0、堿性蛋白酶使用量1 400 U/g、超聲溫度50℃、超聲時間1.5 h，以此為條件，結(jié)合其他因素的理想水平進(jìn)行驗證性試驗，重復(fù)三次，石莼SDF的蛋白質(zhì)平均脫除率為(83.91±0.18)%，石莼SDF平均保留率為(86.23±0.25)%。

3 小結(jié)

酶法脫蛋白是利用蛋白酶分解石莼SDF粗品中存在的游離蛋白和與SDF相結(jié)合的蛋白質(zhì)，將其降解成肽類、氨基酸等小分子，從而達(dá)到脫除蛋白的效果。本研究采用超聲波輔助酶法脫除石莼SDF中蛋白質(zhì)，通過超聲波振動傳遞的能量，可改變大分子物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能，以此加快進(jìn)程[23]，為后續(xù)石莼SDF的組成、結(jié)構(gòu)、活性等相關(guān)研究及其開發(fā)利用提供理論參考。

基于單因素試驗，在控制石莼SDF濃度為0.6%和超聲功率為200 W的前提下，以石莼SDF溶液的pH值、堿性蛋白酶使用量、超聲溫度、超聲時間為關(guān)鍵因素，以石莼SDF的蛋白質(zhì)脫除率和石莼SDF保留率為指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交試驗，獲得加權(quán)綜合后的石莼SDF脫蛋白工藝參數(shù)的最佳優(yōu)化組合條件是酶解液pH 11.0、堿性蛋白酶使用量1 400 U/g、超聲溫度50℃、超聲時間1.5 h，SDF蛋白質(zhì)平均脫除率為(83.91±0.18)%，SDF平均保留率為(86.23±0.25)%。

參考文獻(xiàn)：

[1]Chen P，Sun Y J，Zhu Z C，et al.A controlled release system of superoxide dismutase by electrospun fiber and its antioxidant activity in vitro [J].Journal of Materials Science Materials in Medicine，2010，21(2)：609-614.

[2]Lópezrubio A，Sanchez E，Sanz Y，et al.Encapsulation of Living Bifidobacteria in Ultrathin PVOH Electrospun Fibers[J].Biomacromolecules，2009，10(10)：2823-2829.

[3]高美風(fēng)，俞婷婷.黃芪多糖中脫蛋白方法的研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26(3)：614-615．

[4]郭思維．蟲草多糖脫色脫蛋白工藝研究及抗NCI-H446腫瘤細(xì)胞活性檢測[D]．長沙：湖南師范大學(xué)，2014.

[5]王娜．費菜多糖的提取及分離純化研究[D]．泉州：華僑大學(xué)，2013．

[6]張麗美．粕多糖提純工藝、結(jié)構(gòu)初探及體外抗氧化研究[D]．南昌：南昌大學(xué)，2013．

[7]何余堂，高虹妮，解玉梅，等．超聲波協(xié)同酶法制備杏仁皮中水溶性膳食纖維及理化研究[J]．食品工業(yè)科技，2013，34(1)：229-232．

[8]Ye C，Ran Y，Luo Y，et al．Novel blasting extrusion processing improved the physicochemical properties of soluble dietary fiber from soybean residue and in vivo，evaluation[J]．Journal of Food Engineering，2014，120(1)：1-8．

[9]張賀.玉米皮中多糖的提取、純化、結(jié)構(gòu)表征及抗氧化性的研究[D].黑龍江：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，2015.

[10]楊強．銀杏果多糖的提取分離及功能特性研究[D]．沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013．

[11]陳俊真.酶法脫除香菇粗多糖蛋白質(zhì)的工藝研究[J]．食品工業(yè)，2011，(1)：34-36．

[12]Wei X，Chen M，Xiao J，et al．Composition and bioactivity of tea flower polysaccharides obtained by different methods [J].Carbohydrate Polymers，2010，79(2)：418-422．

[13]Chen X P，Wang W X，Li S B，et al．Optimization of ultrasound-assisted extraction of Lingzhi polysaccharides using response surface methodology and its inhibitory effect on cervical cancer cells[J]．Carbohydrate Polymers，2010，80(3)：944-948．

[14]Dhingra D，Michael M，Rajput H，et al．Dietary fibre in foods：a review[J]．Journal of Food Science & Technology，2012，49(3)：255-266．

[15]孔美蘭，劉謀泉，孔德虎，等．超聲波輔助酶法水解尋氏肌蛤蛋白[J].食品研究與開發(fā)，2014，(6)：19-22．

[16]王婷，何榮海，馬海樂．物理場對酶活力的影響[J]．食品工業(yè)科技，2010，31(6)：401-403．

[17]何余堂，高虹妮，解玉梅，等．超聲波協(xié)同酶法制備杏仁皮中水溶性膳食纖維及理化研究[J]．食品工業(yè)科技，2013，34(1)：229-232．

[18]宋國勝，胡松青，李琳．超聲波技術(shù)在食品科學(xué)中的應(yīng)用與研究[J]．現(xiàn)代食品科技，2008，24(6)：609-612．

[19]麻佩佩，陳雪峰，李睿．?dāng)D壓蘋果渣中膳食纖維的酶法改性工藝條件研究[J]．食品科技，2013，(3)：88-91．

[20]曲玲玉，李大為，張鵬，等．酶水解制備山藥皮可溶性膳食纖維及性能測定[J]．天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2015，(3)：496-501．

[21]岳金玫．攀枝花塊菌多糖的提取、純化及抗氧化活性研究[D]．成都：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012．

[22]劉魁英.食品研究與數(shù)據(jù)分析[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2009.

[23]唐志紅，王碩，鞠寶，等．超聲波協(xié)同酶法提取滸苔多糖工藝的研究[J]．煙臺大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)與工程版)，2013，26(4)：303-306．