光周期和紅光對(duì)光唇魚(yú)卵巢發(fā)育和機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響

，

(1.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004；2.浙江省野生動(dòng)物生物技術(shù)與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 金華 321004)

晝夜交替形成的光周期是自然界中變化最恒定、變動(dòng)規(guī)律最嚴(yán)格的信號(hào)之一，對(duì)動(dòng)物的季節(jié)性繁殖起著重要的調(diào)節(jié)作用。大部分魚(yú)類(lèi)的繁殖季節(jié)與自然界光周期的季節(jié)變化間存在明顯的相關(guān)性，在進(jìn)化上，這有利于后代在一年當(dāng)中最適宜的季節(jié)出生以保障幼體的成活率[1]。因此，在實(shí)施全人工或反季節(jié)繁育過(guò)程中，人們可根據(jù)魚(yú)類(lèi)在繁殖期對(duì)光周期的要求，利用人工照明來(lái)調(diào)控魚(yú)類(lèi)的繁殖進(jìn)程[2]。

水下光譜成分會(huì)隨水的深度變化而發(fā)生顯著改變，如在深水區(qū)以穿透能力較強(qiáng)的短波光為主成分，而長(zhǎng)波光如紅光則在較淺的水層被吸收[3-4]。但是，短波光在某些渾濁水體中有可能被色素和懸浮顆?？焖傥张c分散，因而導(dǎo)致長(zhǎng)波光成為主成分[5-6]。不同波段的光譜可以被魚(yú)類(lèi)視網(wǎng)膜視蛋白及視網(wǎng)膜外的光感受器所感知，生活在不同水域和水層的魚(yú)類(lèi)在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成了不同的光譜敏感性，如淺水性魚(yú)類(lèi)對(duì)長(zhǎng)波光的敏感性可能會(huì)高于深水性魚(yú)類(lèi)[4，7-8]。此外，魚(yú)類(lèi)的性腺發(fā)育和繁殖內(nèi)分泌對(duì)不同波長(zhǎng)光照的反應(yīng)存在物種差異[9-11]。

褪黑素(Melatonin，MT)是一種主要由松果體和視網(wǎng)膜分泌的吲哚雜環(huán)類(lèi)神經(jīng)內(nèi)分泌激素組成，其分泌受光的抑制，常表現(xiàn)出白天降低而夜間升高的趨勢(shì)[12]。MT可通過(guò)下丘腦-垂體-性腺軸(Hypothalamus-pituitary-gonad aix，HPG aix)正向或負(fù)向調(diào)控相關(guān)性激素分泌，從而影響?hù)~(yú)類(lèi)的性腺發(fā)育[13-15]。MT本身作為一種抗氧化劑，可直接清除自由基，還可調(diào)節(jié)超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)等抗氧化酶酶活力[16]，從而降低氧化壓力和減輕卵母細(xì)胞損傷與老化，提高卵母細(xì)胞質(zhì)量[17-19]。此外，不同波段的光譜對(duì)MT分泌的調(diào)節(jié)作用存在差異，如紅光等長(zhǎng)波光穿透腦部的能力較強(qiáng)，可更有效地調(diào)節(jié)松果體MT的分泌[20]。

光唇魚(yú)(Acrosssoeheilusfasciatus)隸屬鯉形目、鲃亞科、光唇魚(yú)屬，主要分布于我國(guó)浙江山區(qū)溪流內(nèi)，繁殖高峰期為6—7月[21]，屬典型的長(zhǎng)日照繁殖類(lèi)型。該魚(yú)作為一種具有地方特色的溪源性魚(yú)類(lèi)，受到廣大消費(fèi)者的歡迎。目前光唇魚(yú)的人工繁育已基本成功，但在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)母本存在明顯的性腺發(fā)育不同步現(xiàn)象，這成為阻礙規(guī)模化繁育的技術(shù)瓶頸。為了解決這一問(wèn)題，并考慮到溪流水淺且透明度高的特點(diǎn)，推測(cè)紅光可能對(duì)光唇魚(yú)的繁殖具有重要影響，因此本研究嘗試以紅光LED作為光源并結(jié)合光周期來(lái)加速光唇魚(yú)母本的性成熟，并分析與生理狀態(tài)相關(guān)的指標(biāo)的變化，以期為該魚(yú)的全人工繁育或反季節(jié)繁育提供理論指導(dǎo)與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚(yú)與馴化

2017年5月從浙江省遂昌縣某養(yǎng)殖場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)處于繁殖前期的光唇魚(yú)親本，飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室全封閉循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，在12L∶12D光周期和(23±1)℃水溫下馴化2周。期間投喂某品牌全價(jià)配合飼料(粗蛋白>40%，粗脂肪>4%)，投喂時(shí)間為10∶00和16∶00，日投喂量為體重的2%～3%。循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水質(zhì)：溶解氧>7.0 mg/L，pH 7.0～7.5，總氨氮<0.5 mg/L，亞硝酸鹽<0.05 mg/L。

1.2 實(shí)驗(yàn)處理

挑選健康、體重均勻的雌性光唇魚(yú)64尾[體重(30± 2)g，體長(zhǎng)(13 ± 1)cm]，隨機(jī)分為4 組(每組2個(gè)平行組，8尾/平行組)，各組給予不同的光照條件。光源分別為白色熒光燈管(10 W)和紅光LED燈(632 nm)(圖1)，用定時(shí)器控制兩種光周期：12L∶12D和16L∶8D，共設(shè)置白光短光照(Short photoperiod with white light，SW)、紅光短光照(Short photoperiod with red light，SR)、白光長(zhǎng)光照(Long photoperiod with white light，LW)和紅光長(zhǎng)光照(Long photoperiod with red light，LR)4個(gè)組。調(diào)整燈距水面的高度，使輻照強(qiáng)度達(dá)到0.9 W/m2。養(yǎng)殖條件、投喂方式和水質(zhì)控制同馴化期，實(shí)驗(yàn)周期45 d。

1.3 取樣

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每平行組隨機(jī)取4尾魚(yú)，經(jīng)MS-222溶液(800 mg/L)深度麻醉后取樣。分別在12∶00和24∶00尾靜脈取血，血液于抗凝離心管中離心(4℃，3 500 rmp，15 min)，收集血漿用于激素分析。卵巢稱(chēng)重后鏡檢，肝臟、肌肉組織于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 性腺指數(shù)測(cè)定

魚(yú)體和卵巢稱(chēng)重，精確至0.01 g，根據(jù)公式計(jì)算性腺指數(shù)(Gonadosomatic index，GSI)，公式：GSI = [性腺質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)]×100%。

1.4.2 卵巢組織壓片觀察

取少量卵巢置于載玻片上，滴數(shù)滴醋酸洋紅溶液，加蓋玻片并輕輕擠壓，使卵母細(xì)胞破裂和分散，移至顯微鏡(Zeiss，Germany)下觀察并拍照，將卵母細(xì)胞分為卵原細(xì)胞、Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期卵母細(xì)胞和閉鎖卵泡5個(gè)時(shí)期[22]，統(tǒng)計(jì)各期卵細(xì)胞的比例。

1.4.3 血漿褪黑素(MT)含量的測(cè)定

利用酶聯(lián)免疫檢測(cè)(ELISA)試劑盒(IBL，Hamburg，Germany)測(cè)定血漿MT含量，試劑盒最低檢測(cè)極限為0.5 ng/L，組內(nèi)和組間變異系數(shù)分別小于9%和11%。血漿用量為50 μL，操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，酶標(biāo)儀(Pro200，TECAN，Switzerland)于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品吸光度(OD值)，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品濃度。

1.4.4 組織氧化還原狀態(tài)評(píng)估

將肌肉或肝臟組織剪碎后加入4 倍體積(W/V)預(yù)冷的生理鹽水，用組織勻漿機(jī)制成勻漿，以3 000 r/min轉(zhuǎn)速4℃離心5 min，取上清液用于丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量和SOD酶活力測(cè)定，步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)(南京建成生物技術(shù)研究所)。組織蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。MDA含量單位為nmol·mgprot-1，SOD酶活力單位為U·mgprot-1。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean ± SE)表示。以光周期和光色作為兩因子，采用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)比較組間差異，當(dāng)檢測(cè)出各組間有統(tǒng)計(jì)差異后，利用Turkey法進(jìn)行多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 性腺發(fā)育

光周期和光色對(duì)雌性光唇魚(yú)性腺指數(shù)(GSI)(A)和不同發(fā)育階段卵母細(xì)胞相對(duì)百分?jǐn)?shù)(B)的影響，結(jié)果如圖2所示。紅光長(zhǎng)光照組(LR)雌性光唇魚(yú)性腺指數(shù)(GSI)和Ⅲ期卵母細(xì)胞比例最大，而白光短光照組(SW)最小(P<0.05)。在白光下，長(zhǎng)光照可顯著增加GSI和提高Ⅱ、Ⅲ 期卵母細(xì)胞的比例(P<0.05)，并顯著降低卵原細(xì)胞的比例。在紅光下，長(zhǎng)光照組(LR)GSI和Ⅲ期卵母細(xì)胞比例均顯著高于短光照組(SR)(P<0.05)。在相同光周期下，與白光組(SW或LW)相比，紅光均能顯著誘導(dǎo)GSI和Ⅲ期卵母細(xì)胞比例的增加，并降低卵原細(xì)胞的比例(P<0.05)。光周期和光色對(duì)GSI和Ⅲ期卵母細(xì)胞比例的影響具有明顯的交互作用(P<0.05)。

2.2 血漿MT含量

由圖3可知，各組夜間血漿褪黑素(MT)含量普遍高于日間(P<0.05)，紅光長(zhǎng)光照組(LR)夜間血漿MT水平最高，而白光短光照組(SW)最低(P<0.05)。在白光下，長(zhǎng)光照組(LW)無(wú)論日間還是夜間血漿MT水平均顯著高于短光周期組(SW)(P<0.05)。在紅光下，長(zhǎng)光照可顯著提高日間或夜間的血漿MT水平(P<0.05)。在兩種光周期條件下，與白光相比，紅光均能顯著提高夜間血漿MT水平(P<0.05)，但對(duì)日間MT水平無(wú)顯著影響(P>0.05)。光周期與光色對(duì)夜間血漿MT水平的影響同樣具有極顯著的交互作用(P<0.01)。

注：SW：白光短光照；SR：紅光短光照；LW：白光長(zhǎng)光照；LR：紅光長(zhǎng)光照；不同字母表示各組間具有顯著差異(P<0.05)，n=8；下同。

Notes：SW：short photoperiod with white light；SR：short photoperiod with red light；LW：long photoperiod with white light；LR：long photoperiod with red light.Different letters meant significant difference among groups(P<0.05)，n=8；the same as below.

2.3 肌肉和肝臟MDA含量和SOD酶活力

光周期和光色對(duì)肌肉組織MDA含量和組織SOD酶活力無(wú)顯著影響(P>0.05)(圖4)。紅光長(zhǎng)光照組(LR)肝臟MDA含量最高，而白光短光照組(SW)最低(P<0.05)。長(zhǎng)光照組(LW和LR)肝臟MDA含量均顯著大于相同光色的短光照組(SW和SR)(P<0.05)。在長(zhǎng)光周期下，紅光組(LR)肝臟MDA含量顯著高于白光組(LW)(P<0.05)，但在短光周期下，紅光和白光組(SR和SW)間無(wú)統(tǒng)計(jì)差異。光周期和光色僅對(duì)肝臟MDA含量具有明顯的交互作用(P<0.05)。

3 討論

光周期是調(diào)控魚(yú)類(lèi)季節(jié)性繁殖最重要的生態(tài)因子之一，溫帶魚(yú)類(lèi)大部分屬于長(zhǎng)日照繁殖類(lèi)型，因此利用長(zhǎng)光照能夠促進(jìn)這些魚(yú)類(lèi)的繁殖，相關(guān)研究已有大量報(bào)道[2，23-24]。野生光唇魚(yú)的繁殖主要集中在每年6—7月[21]，此階段自然界光照時(shí)間達(dá)到峰值，因此其繁殖屬于典型的長(zhǎng)日照繁殖類(lèi)型。本研究中，長(zhǎng)光周期(16L∶8D)顯著提高了光唇魚(yú)的性腺指數(shù)，加速了卵母細(xì)胞的發(fā)育，這與其繁殖類(lèi)型相一致。

魚(yú)類(lèi)松果體和視網(wǎng)膜作為光感受器對(duì)光譜具有特殊吸收峰，而特定波段的光譜對(duì)魚(yú)類(lèi)的繁殖調(diào)控存在物種差異。水下光環(huán)境與陸地光環(huán)境存在巨大的差異，因?yàn)椴糠株?yáng)光在輻射時(shí)，首先在水面被反射，而通過(guò)折射進(jìn)入水中的光又進(jìn)一步發(fā)生散射，光譜組成和光強(qiáng)度隨著水深的增加而發(fā)生明顯的改變[5]，但長(zhǎng)波光僅能穿透到較淺的水層[4]。因此，生活在海水或淡水不同水層的魚(yú)類(lèi)可能對(duì)不同波長(zhǎng)的光譜產(chǎn)生適應(yīng)性進(jìn)化。利用電生理技術(shù)可以在魚(yú)類(lèi)的松果體中檢測(cè)到兩種光色素(視紫紅質(zhì)和視紫質(zhì))，如金魚(yú)(Carassiusauratus)松果體光受體的最大吸收峰為530 nm[25]，而虹鱒(Oncorhynchusmykiss)在500 nm和533 nm處均存在最大吸收峰[26]。魚(yú)類(lèi)視網(wǎng)膜內(nèi)存在長(zhǎng)波、中波、短波、紫外四種視錐色素蛋白，但每種視蛋白的吸收峰存在較大的物種差異。如金魚(yú)視錐色素蛋白分別在620、540、440、360 nm處存在最大吸收峰[27-31]，而條紋鱸(Moronesaxatilis)在542 nm和605 nm存在最大吸收峰[32]。Bapary等研究了不同顏色光照對(duì)藍(lán)刻齒雀鯛(Chrysipteracyanea)卵巢發(fā)育的影響，結(jié)果表明紅光(627 nm)可顯著增加淺水性魚(yú)類(lèi)的GSI，而且只有在紅光下卵巢中出現(xiàn)了含有卵黃的卵母細(xì)胞[9]。類(lèi)似地，紅光(640 nm)可誘導(dǎo)斑馬魚(yú)胚胎數(shù)量的增加[11]。本研究中在兩種光周期下紅光(626 nm)均能顯著增加光唇魚(yú)的GSI和卵母細(xì)胞的成熟度，說(shuō)明紅光對(duì)其性成熟具有明顯的促進(jìn)作用，與上述研究結(jié)果相一致。然而，有研究發(fā)現(xiàn)紅光(627 nm)可抑制副金翅雀鯛(Chrysipteraparasema)的性成熟[33]。還有研究表明紅光(630 nm)可抑制金魚(yú)神經(jīng)激素kisspeptin、促性腺激素(Gonadotropin hormones，GTHs)、P450芳香化酶(Cytochrome P450 aromatase，P450 arom)等性成熟相關(guān)激素的表達(dá)[10]。因此，魚(yú)類(lèi)繁殖對(duì)光色的反應(yīng)存在明顯的物種差異。

在脊椎動(dòng)物中，褪黑素(MT)主要由松果體和視網(wǎng)膜分泌，其分泌量和晝夜節(jié)律受到光周期的調(diào)控[34]。光信號(hào)可轉(zhuǎn)化成MT信號(hào)將時(shí)間信息傳遞至大腦，進(jìn)而通過(guò)HPG軸影響?hù)~(yú)類(lèi)的繁殖。切除松果體顯著抑制了金體美鳊(Notemigonuscrysoleucas)[35]和金魚(yú)[36]的性腺發(fā)育，卻可促進(jìn)青鳉(Oryziaslatipes)的性成熟[37]。如MT處理可誘導(dǎo)斑馬魚(yú)GSI、排卵量的增加，以及促進(jìn)繁殖相關(guān)基因的表達(dá)[38]。飼料內(nèi)添加MT(50 μg/g)可以顯著促進(jìn)大馬哈魚(yú)(Oncorhynchusketa)性激素的分泌，但添加量提高十倍會(huì)起到反作用[13-14]。因此，MT對(duì)魚(yú)類(lèi)繁殖的促進(jìn)作用存在劑量效應(yīng)，甚至存在負(fù)作用。有趣的是，長(zhǎng)光照暴露可促進(jìn)切除松果體和摘除眼球的鯰魚(yú)(Heteropneustesfossilis)的性腺發(fā)育[39]。目前已有很多報(bào)道表明魚(yú)類(lèi)、兩棲類(lèi)等脊椎動(dòng)物腦內(nèi)均檢測(cè)到了光受體基因表達(dá)，有的還可檢測(cè)到MT合成關(guān)鍵酶芳烷基胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(Arylalkylamine N-acetyltransferase)基因的表達(dá)[40-42]，這暗示光信號(hào)還可以通過(guò)視網(wǎng)膜和松果體外的光感受器影響?hù)~(yú)類(lèi)的繁殖生理，而MT在此過(guò)程中充當(dāng)了重要角色。除光周期外，某些特定波段的光譜對(duì)褪黑素分泌具有特殊的調(diào)節(jié)作用，因此對(duì)魚(yú)類(lèi)繁殖的影響也存在差異。如紅光可促進(jìn)塞內(nèi)加爾鰨(Soleasenegalensis)[43]和歐洲齒舌鱸(Dicentrarchuslabrax)[44]MT分泌。本研究表明：長(zhǎng)光照同時(shí)提高了雌性光唇魚(yú)日間和夜間的血漿MT水平，尤其以紅光作為光源時(shí)夜間血漿MT水平最高，且MT水平越高，其卵巢的成熟度也越高，這暗示長(zhǎng)光照和紅光照射可以協(xié)同促進(jìn)該魚(yú)的性腺發(fā)育，而MT在其中可能扮演了重要的調(diào)控角色。

在環(huán)境壓力下機(jī)體產(chǎn)生的活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化(Lipid peroxidation，LPO)，從而影響細(xì)胞的存活[45]，而特定波段的光譜可增加或抑制魚(yú)體的氧化壓力。如藍(lán)光照射有助于提高尼羅羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)的抗脅迫能力[46]。Shin等研究表明綠光和藍(lán)光可以通過(guò)提高克氏雙鋸魚(yú)(Amphiprionclarkii)體內(nèi)抗氧化物質(zhì)的水平，而紅光則可誘導(dǎo)氧化壓力[47]。在本研究中，紅光長(zhǎng)光照導(dǎo)致了雌性光唇魚(yú)肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化物水平的提高，說(shuō)明紅光對(duì)魚(yú)體造成了氧化壓力，與上述研究結(jié)果較一致。然而，本研究還發(fā)現(xiàn)紅光雖然對(duì)關(guān)鍵抗氧化酶SOD酶活力無(wú)顯著影響，但是提高了血液中MT的水平，而MT作為強(qiáng)抗氧化物質(zhì)，在一定程度上可緩解由紅光引起的氧化壓力。

綜上所述，在循環(huán)水養(yǎng)殖條件下以626 nm紅光結(jié)合長(zhǎng)光周期(16L∶8D)可協(xié)同加速雌性光唇魚(yú)的性腺發(fā)育，從而提高親本繁殖的同步化水平。血漿褪黑素(MT)與性腺指數(shù)和卵細(xì)胞發(fā)育存在一定的相關(guān)性，這暗示褪黑素在魚(yú)類(lèi)繁殖調(diào)控方面發(fā)揮了重要作用。

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