大麻幼苗葉形與毛狀體及乳汁管性狀的相關(guān)性研究

程薪宇，徐海軍，郭夢橋，2，孫宇峰，曹焜，潘冬梅，魏國江，王曉飛，2，張旭，2，王曉楠*

（1.黑龍江省科學院大慶分院，黑龍江大慶163319；2.黑龍江省科學院高技術(shù)研究院，哈爾濱150020）

大麻（Cannabis sativa L.）又名寒麻、線麻、火麻等［1］，為大麻科（Cannabaceae）大麻屬一年生直立草本植物，原產(chǎn)錫金、不丹等國，現(xiàn)各國均有野生或栽培［2］。大麻是一種重要的經(jīng)濟作物，根據(jù)用途可分為纖維用、籽用和藥用3類，現(xiàn)有品種150個左右［1］。但大麻同時也是一種具有制幻作用的毒品［3］，其主要毒性成分為四氫大麻酚（Tetrahydrocannabinol，THC）［4－7］。攝入過量的 THC可導致擬精神病癥狀，諸如人格解體、幻聽、幻視、幻覺，對記憶力損害等［4］。國際上將THC含量低于0.3%的品種稱為纖維大麻或工業(yè)大麻［8］，而將THC含量高于0.3%的品種稱為藥用或毒品大麻（Marijuana、Hashish）［9］。目前，低毒大麻品種選育是工業(yè)大麻育種的重要方向之一［10－12］，而在低毒品種選育過程中，主要利用組織化學［9］或色譜法［13－14］來檢測毒性高低，但這些方法的高成本及低效性卻大大延長了新品種選育周期。

植物的形態(tài)特征能在一定程度上反映作物的品質(zhì)，可作為經(jīng)濟作物品種選育的重要參考依據(jù)［15－17］。同時，形態(tài)學特征亦可作為大麻優(yōu)良品種選育的依據(jù)，如株高、莖粗常被用作高纖品種選育的參考依據(jù)［18］，穗緊湊程度及花性狀則主要作為低毒品種選育的依據(jù)［19］。以上形態(tài)學特征主要通過觀察快速生長期及隨后發(fā)育時期的植株來獲得，大麻優(yōu)勢植株的首次篩選并非始于快速生長期，而是始于對幼苗期植株的間苗過程。然而目前尚未見關(guān)于大麻幼苗期優(yōu)勢植株篩選依據(jù)方面的報道。Furr等［20］曾通過組織化學染色法對不同時期、不同部位的大麻植株進行染色處理，發(fā)現(xiàn)大麻酚類物質(zhì)主要集中于乳汁管及腺毛中，這一結(jié)論在后期的研究中也得到了證實［21－23］。由此可見，大麻腺毛及乳汁管數(shù)量很可能成為反映大麻酚類物質(zhì)含量或毒性高低的間接判斷依據(jù)。但這些特征在田間實際生產(chǎn)中無法輕易獲得，需在找到與之相關(guān)性強且便于觀察的特征的前提下，方有可能將其應(yīng)用至田間工作中。因此，本研究選取4個大麻品種火麻1號、火麻3號、金刀－15和格列西亞以及兩個高世代種資源20170114和資源CA－4幼苗期（6葉期）完全展開的第一真葉作為研究材料，對其外形、毛狀體特征和葉柄乳汁管數(shù)進行觀察統(tǒng)計，并對其進行相關(guān)分析及因子分析，旨在找到與大麻腺毛及乳汁管數(shù)量相關(guān)且能直接應(yīng)用于生產(chǎn)中的幼苗形態(tài)學性狀，為減輕大麻低毒品種育種工作量提供形態(tài)學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以4個大麻品種火麻1號、火麻3號、金刀－15和格列西亞以及兩個高世代種資源20170114和資源CA－4為試驗材料。其中金刀－15和格列西亞引自烏克蘭，其余材料由黑龍江省科學院大慶分院提供。試驗于2017年5月在黑龍江省大慶市東風農(nóng)場黑龍江省科學院大慶分院試驗基地進行，土壤為鹽堿化草甸土，其理化性質(zhì)為：pH 8.48，堿解氮220.13 mg／kg，速效磷24.57 mg／kg，速效鉀349.32 mg／kg，有機質(zhì) 17.6 mg／kg，測土配方施肥；播種后立即進行封閉除草，視實際情況采取灌溉及病蟲害綜合防治等措施。播種密度為450粒／m2。

1.2 試驗方法

1.2.1 形態(tài)學試驗材料采集

每種供試材料隨機采集5株幼苗期（6葉期）植株，重復3次，摘取第一真葉（第一對真葉中的一片），固定于FAA固定液（甲醛、冰醋酸、70%乙醇按1∶1∶18比例混合而成）中24 h以上。

1.2.2 觀察方法

待大麻葉完全固定后，按以下方法進行觀察：

葉外形——將葉平展后，用相機拍照，并用Image J進行葉柄長度、葉片長度、葉片寬度、葉面積的測量，柄葉比為葉柄長度／葉片長度。

葉柄乳汁管數(shù)——用雙面刀片制作大麻葉柄徒手切片，并將其制作成臨時裝片后，用萊卡DM4000B進行觀察，Las X軟件計數(shù)。

毛狀體相關(guān)性狀——將葉片直接制成臨時裝片，用萊卡DM4000B在葉片最寬處附近隨機選取3個遠離葉脈的區(qū)域進行葉片腹背面（近軸面及遠軸面）毛狀體特征的觀察，并用Las X軟件統(tǒng)計和測量非腺毛及腺毛的密度（每平方毫米中的毛狀體數(shù)量，重復觀察3個視野，取平均值）、總數(shù)（由密度值與葉面積值相乘所得）和腺毛直徑（視野中所有腺毛直徑的平均值，重復觀察3個視野，取平均值）。

1.2.3 統(tǒng)計分析

利用SPSS 20.0對大麻形態(tài)學觀察結(jié)果進行相關(guān)性分析和因子分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉形態(tài)學性狀分析

供試材料16個形態(tài)學性狀的平均值及變異情況見表1。由表1可知，葉片長度、葉片寬度、葉面積、腹面腺毛直徑和背面腺毛直徑的變異系數(shù)相對較小，分別為11.99%、12.50%、22.28%、9.87%、9.48%，表明與大麻葉片外形及腺毛直徑相關(guān)的性狀相對穩(wěn)定。而葉柄外形及毛狀體數(shù)量相關(guān)的性狀在大麻個體間的差異卻較大，其中葉柄長度、柄葉比、葉柄乳汁管數(shù)、腹面非腺毛密度、腹面非腺毛總數(shù)、腹面腺毛密度、腹面腺毛總數(shù)、背面非腺毛密度、背面腺毛密度、背面腺毛總數(shù)的變異系數(shù)分別 42.27%、40.91%、54.07%、52.63%、60.15%、77.98%、82.42%、50.86%、102.17%、103.33%，表明這些性狀在研究大麻個體差異及變化規(guī)律方面具有更高的實用價值。

2.2 大麻葉形態(tài)學性狀相關(guān)性分析

對大麻幼苗葉外形、毛狀體及乳汁管性狀進行相關(guān)性分析（詳見表2），結(jié)果顯示葉片外形性狀間存在極顯著正相關(guān)關(guān)系，其中葉面積與葉片長度和葉片寬度的相關(guān)系數(shù)分別為0.892和0.851；與葉柄外形相關(guān)的兩個性狀，葉柄長度和柄葉比之間的相關(guān)系數(shù)為0.950；與毛狀體數(shù)量有關(guān)的性狀間的相關(guān)性均達到極顯著水平，其中腹面非腺毛密度與腹面腺毛密度、腹面腺毛總數(shù)、背面腺毛密度和背面腺毛總數(shù)的相關(guān)系數(shù)依次為0.893、0.864、0.872和0.880。腺毛直徑相關(guān)的兩個性狀腹面腺毛直徑和背面腺毛直徑與本研究觀察的其它大麻葉性狀相關(guān)性較弱，而二者彼此間卻呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)0.734。由此可見，選擇一些指征性良好的指標來代替絕大多數(shù)觀測指標是可行的。

2.3 葉形及毛狀體性狀因子分析

2.3.1 葉形性狀因子分析

由上述結(jié)果可知，大麻葉各類特征內(nèi)部性狀彼此間常存在較強的相關(guān)性，經(jīng)主成分進一步分析，可知：葉形相關(guān)性狀可提取為兩個主因子，貢獻率分別為64.739%和27.019%，累計貢獻率為91.758%，說明這兩個主因子可以對葉形性狀做出很好的解釋。但葉片長度、柄葉比及葉柄長在兩個主因子中的載荷量均較大，為了更好的定義因子并解釋向量，將成分矩陣進行正交旋轉(zhuǎn)，將上述3個變量分別歸入2個公因子中，結(jié)果表明，第一公因子主要包括葉面積、葉片長度和葉片寬度，其荷載系數(shù)分別為0.966、0.927、0.811，主要反映的是葉片外形特征，將其命名為“葉片外形因子”；柄葉比及葉柄長度在公因子2上有較大的載荷，載荷量分別為0.996和0.930，主要反應(yīng)的是葉柄外形相關(guān)特征，因此命名為“葉柄外形因子”。

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表3 葉形特征因子分析Tab.3 The factor analysis of leaf shape characteristics

2.3.2 毛狀體性狀因子分析

經(jīng)主成分進一步分析，大麻毛狀體相關(guān)性狀可提取兩個主因子，貢獻率分別為73.691%和14.823%，累計貢獻率為88.514%，說明這兩個主因子可以對毛狀體相關(guān)性狀做出很好的解釋。但腹面腺毛直徑在兩個主因子中的載荷量均較大，為了更好地定義因子并解釋向量，將成分矩陣進行正交旋轉(zhuǎn)，結(jié)果表明，腹面腺毛總數(shù)、腹面腺毛密度、腹面非腺毛總數(shù)、腹面非腺毛密度、背面腺毛總數(shù)、背面非腺毛總數(shù)、背面腺毛密度和背面非腺毛密度8個變量在公因子1上的載荷量較高，依次為0.949、0.944、0.938、0.934、0.930、0.898、0.892和0.873。這些變量均與毛狀體數(shù)量相關(guān)，因此將公因子1命名為“毛狀體數(shù)量因子”。公因子2中僅有背面腺毛直徑和腹面腺毛直徑兩個變量，在公因子2上的載荷量分別為0.930和0.894，因此將其命名為“腺毛直徑因子”。

表4 毛狀體特征因子分析Tab.4 The factor analysis of trichome characteristics

2.4 葉柄乳汁管數(shù)與新因子間的相關(guān)性分析

將葉柄乳汁管數(shù)性狀與之前因子分析提取的4個公因子變量進行相關(guān)性分析（詳見表5）。結(jié)果顯示葉柄乳汁管數(shù)與葉柄外形因子及毛狀體數(shù)量因子均存在極顯著的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.697和0.721。而葉柄外形因子與毛狀體數(shù)量因子彼此間的相關(guān)性也達到了極顯著水平，相關(guān)系數(shù)0.771。葉片外形因子和腺毛直徑因子與葉柄乳汁管數(shù)和其它兩個公因子的相關(guān)性較弱。這表明可通過觀察葉柄外形來估測葉柄乳汁管數(shù)和毛狀體數(shù)量或通過統(tǒng)計毛狀體數(shù)量來估測葉柄乳汁管數(shù)。但卻無法通過觀察葉片外形和腺毛直徑來估測其它性狀情況。

表5 葉柄乳汁管數(shù)與新因子間的相關(guān)性分析Tab.5 The correlation analysis between petiole laticifer number and new factors

3 討論

植物形態(tài)特征除作為系統(tǒng)學及分類學研究［24］的依據(jù)外，在作物優(yōu)良品種選育過程中也發(fā)揮著重要作用［15－17］。目前大麻低毒品種幼苗期主要保留目測長勢較好且整齊的植株［20，25］。但此種篩選方式并不能有效地降低大麻低毒品種選育的周期。而現(xiàn)有研究結(jié)果表明，大麻酚類物質(zhì)主要分布于大麻的腺毛及乳汁管中［20－23］。因此，了解腺毛及乳汁管數(shù)量與其它大麻形態(tài)學性狀間的關(guān)系，可為大麻低毒品種選育過程中育種中間材料的篩選提供新的參考依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示腺毛數(shù)量相關(guān)性狀和非腺毛數(shù)量有關(guān)的性狀共同組成了毛狀體數(shù)量因子。毛狀體數(shù)量因子中腹面腺毛總數(shù)載荷量最大，為0.949，其次為腹面腺毛密度（0.944）、腹面非腺毛總數(shù)（0.938）和腹面非腺毛密度（0.934），這4個變量在毛狀體數(shù)量因子中的載荷量較為接近。而這4個變量彼此間的相關(guān)系數(shù)均大于0.850。綜合以上信息后，認為在實際生產(chǎn)過程中，觀察這4個變量中任一變量，均可以在一定程度上反映其它3個變量的情況。再考慮到腺毛在葉上的總數(shù)和密度遠不及非腺毛多（前者在葉片腹面的平均總數(shù)和密度分別為3154.76個和5.63個／mm2，后者則分別為31253.99個和56.81個／mm2），以及腹面非腺毛密度與所有腺毛數(shù)量相關(guān)性狀的相關(guān)系數(shù)均大于0.860，從實用性角度出發(fā)，認為可通過觀察腹面非腺毛密度這一性狀來推測腺毛總數(shù)及密度的高低，并可由其來代表毛狀體數(shù)量因子。

由表5可知，葉柄乳汁管數(shù)與葉柄外形因子及毛狀體數(shù)量因子間均為極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.697和0.721。認為可通過這兩個因子來推測葉柄乳汁管數(shù)。而葉柄外形因子中柄葉比對公因子的貢獻最大，其因子載荷量達到0.996，且與公因子中的另一個變量葉柄長的相關(guān)系數(shù)也達到了0.950，因此在生產(chǎn)中可直接用柄葉比代表葉柄外形因子使用。再結(jié)合之前提到的用腹面非腺毛密度來代表毛狀體數(shù)量因子，最終認為，可通過觀察大麻葉的柄葉比或腹面非腺毛密度來推測葉柄乳汁管數(shù)的高低。

根據(jù)表5的分析結(jié)果可知，葉片外形因子和腺毛直徑因子與葉柄乳汁管數(shù)和毛狀體數(shù)量間無較強的相關(guān)性，這意味著無法通過葉片外形和腺毛直徑特征來反映乳汁管及毛狀體的相關(guān)特征。

通過本次研究，最終篩選出兩個較為容易觀察的性狀——柄葉比和葉腹面非腺毛密度。這兩個性狀可在一定程度上間接反映與大麻腺毛及葉柄乳汁管數(shù)量的多寡，為進一步研究大麻形態(tài)學特征與其所含大麻酚類物質(zhì)含量間的關(guān)系提供了新的形態(tài)學依據(jù)。

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