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    外源鈣對(duì)鎘脅迫下南美蟛蜞菊毛狀根生長(zhǎng)、抗氧化酶活性和鎘吸收的緩解效應(yīng)

    2012-02-10 01:20:20施和平王云靈曾寶強(qiáng)陳利華
    生物工程學(xué)報(bào) 2012年6期
    關(guān)鍵詞:毛狀毒害南美

    施和平,王云靈,曾寶強(qiáng),陳利華

    1 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣東省植物發(fā)育生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510631

    2 香港教育學(xué)院科學(xué)與環(huán)境學(xué)系,香港 新界

    鎘 (Cd) 雖不是植物生長(zhǎng)必需的微量元素,但由于其移動(dòng)性強(qiáng)、被植物吸收利用和累積后,不僅可影響植物的產(chǎn)量和品質(zhì),導(dǎo)致植物生長(zhǎng)被抑制或產(chǎn)生毒害;而且也易通過(guò)食物鏈進(jìn)入人和動(dòng)物體內(nèi)富集來(lái)危及人和動(dòng)物健康,是目前土壤和水體環(huán)境中最受關(guān)注的、毒性最強(qiáng)的重金屬元素之一,而且Cd污染問(wèn)題已成為威脅土壤生態(tài)安全和制約農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一個(gè)重要因素[1]。因而,如何治理和控制重金屬Cd污染,尋找降低Cd毒害或修復(fù)被Cd污染環(huán)境的有效方法,一直是國(guó)內(nèi)外環(huán)境科學(xué)研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。根既是植物吸收礦質(zhì)離子的最主要器官,也是鎘最直接、最嚴(yán)重的受害器官之一。有研究表明,利用植物尤其是重金屬蓄積植物的根系對(duì)土壤和水體中某種重金屬污染元素具有特殊的吸收富集和轉(zhuǎn)化能力,不失為治理重金屬污染,實(shí)現(xiàn)生態(tài)修復(fù)的高效而廉價(jià)的有效方法之一[2]。與對(duì)照根(自然根) 相比,由發(fā)根農(nóng)桿菌 Agrobacterium rhizogenes感染植物細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生的毛狀根,由于具有產(chǎn)生分枝側(cè)根能力很強(qiáng)、可快速自主生長(zhǎng),根系極發(fā)達(dá)及具有很大的吸收面積;近年相繼有人利用可離體自主快速生長(zhǎng)的毛狀根來(lái)吸收重金屬離子Ni和Cd[3],或根濾重金屬鈾以修復(fù)被放射性金屬元素鈾污染的環(huán)境[4],以及利用毛狀根迅速吸收和轉(zhuǎn)化廢水中的2,4-D等污染物[5]。但到目前為止,國(guó)內(nèi)外少見(jiàn)利用發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的毛狀根或其再生植株來(lái)開(kāi)展對(duì)重金屬污染物修復(fù)的更多研究報(bào)道。南美蟛蜞菊Wedelia trilobata (L.) A.S.Hitche是華南地區(qū)常見(jiàn)的用作園林綠化的耐陰地被植物和護(hù)坡植物,并具有較強(qiáng)的對(duì)有害金屬元素的吸附積累作用[6],但因其植物根系不發(fā)達(dá),目前仍未見(jiàn)大量利用該植物進(jìn)行環(huán)境修復(fù)的研究報(bào)道。我們?cè)冒l(fā)根農(nóng)桿菌獲得了可自主生長(zhǎng)的南美蟛蜞菊毛狀根[7];而開(kāi)展其毛狀根對(duì)重金屬鎘的吸收和鎘耐受能力的研究,是今后開(kāi)發(fā)利用生長(zhǎng)迅速,且根系發(fā)達(dá)的南美蟛蜞菊毛狀根系及其再生植株進(jìn)行重金屬鎘污染環(huán)境生物修復(fù)的前提。但至今為止,未見(jiàn)有關(guān)重金屬 Cd對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根生長(zhǎng)和毒害的影響及其對(duì) Cd吸收的任何報(bào)道。

    鈣 (Ca) 是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的大量元素。已有研究表明,Ca可以與Cd競(jìng)爭(zhēng)植物根系上吸收位點(diǎn),降低植物含Cd量[8];而外源Ca可以增強(qiáng)植物對(duì)許多非生物逆境的適應(yīng)性,減輕逆境對(duì)植物所造成的傷害[9]。但到目前為止,少見(jiàn)有關(guān)Cd和Ca結(jié)合對(duì)毛狀根生長(zhǎng)或毒害影響的系統(tǒng)研究報(bào)道。

    本研究以發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的可在無(wú)激素培養(yǎng)基上自主生長(zhǎng)的南美蟛蜞菊毛狀根為材料,來(lái)探討重金屬Cd及其與Ca結(jié)合對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根生長(zhǎng)、抗氧化酶活性以及吸收 Cd影響的生理機(jī)理,旨在為今后開(kāi)展利用生長(zhǎng)迅速的具發(fā)達(dá)根系的南美蟛蜞菊毛狀根及其再生植株來(lái)凈化被重金屬Cd污染的水體和土壤環(huán)境奠定實(shí)驗(yàn)技術(shù)基礎(chǔ)和提供可能性。

    1 材料與方法

    1.1 植物材料

    采用由含農(nóng)桿堿型野生 Ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834遺傳轉(zhuǎn)化南美蟛蜞菊葉片外植體所產(chǎn)生的、能在MS培養(yǎng)基上自主快速生長(zhǎng)并已繼代培養(yǎng)的毛狀根,其誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)見(jiàn)歐少云等的方法[7]。

    1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

    在探討培養(yǎng)基中Cd濃度對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根生長(zhǎng)、抗氧化酶活性的影響時(shí),采用添加不同濃度Cd (以CdCl2的形式加入) 的液體MS培養(yǎng)基,其中 Cd濃度分別為 0、10、50、100、300 μmol/L;而在探討Cd與Ca組合對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根生長(zhǎng)及酶活性的影響時(shí),采用 200、300 μmol/L Cd和10、20、30 mmol/L Ca組合的MS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng);在探討培養(yǎng)基中Cd濃度及其與 Ca組合對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根吸收及吸附 Cd的影響時(shí),分別采用 100 μmol/L或300 μmol/L Cd和10、20、30 mmol/L Ca組合的MS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。以上所有培養(yǎng)基在滅菌前pH值調(diào)至5.8~6.0,經(jīng)121 ℃高溫濕熱滅菌后待用。每250 mL錐形瓶中盛50 mL液體培養(yǎng)基,定量接種南美蟛蜞菊毛狀根后,將培養(yǎng)瓶置于搖床上,于 (25±2) ℃下振蕩培養(yǎng)。

    1.3 Cd對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根生長(zhǎng)的影響

    選取生長(zhǎng)旺盛的南美蟛蜞菊毛狀根,剪切成4~5 cm且具根尖的根段,按定量接種法接入含有不同濃度Cd或Cd-Ca組合的液體MS培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)。每錐形瓶的接種量為0.2 g (FW)。在為期 25 d的培養(yǎng)過(guò)程中觀察毛狀根的生長(zhǎng)變化并進(jìn)行生物量的測(cè)定。每隔5 d隨機(jī)抽取不同濃度處理的毛狀根培養(yǎng)物各3瓶,用自來(lái)水沖洗去培養(yǎng)物上的殘留液體培養(yǎng)基,然后再用蒸餾水沖洗并用吸水紙吸干水分后進(jìn)行毛狀根生物量(鮮重) 測(cè)量。將新鮮毛狀根培養(yǎng)物保存于-80 ℃的超低溫冰箱中,用于進(jìn)行毛狀根可溶性蛋白含量、POD、SOD活性和MDA含量的測(cè)定。

    1.4 毛狀根可溶性蛋白含量、POD、SOD活性及MDA含量的測(cè)定

    為了探討不同濃度Cd單獨(dú)及其與Ca組合對(duì)毛狀根過(guò)氧化物酶 (POD) 和超氧化物歧化酶(SOD) 及丙二醛 (MDA) 含量的影響,取毛狀根定量接種到僅添加 10、50、100 μmol/L或300 μmol/L Cd及200 μmol/L或300 μmol/L Cd與10~30 mmol/L CaCl2組合的液體MS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),并分別在培養(yǎng)后5、10、15、20、25 d取樣進(jìn)行測(cè)定。其中,毛狀根培養(yǎng)物可溶性蛋白含量的測(cè)定參照Bradford的方法[10],用考馬斯亮藍(lán)G-250進(jìn)行染色并用紫外分光光度法測(cè)定。培養(yǎng)過(guò)程中其 SOD活性變化的測(cè)定基本按照Beauchamp和 Fridovich的測(cè)定方法[11],以抑制NBT光還原50%所需要的酶量為1個(gè)酶活性單位;其POD活性的測(cè)定按照張志良等的愈創(chuàng)木酚法進(jìn)行[12],以制備酶提取液所用的磷酸緩沖液作空白對(duì)照,用每分鐘OD470變化值表示酶活性的大小,即以 OD470/(min·mg) 蛋白表示。MDA含量的測(cè)定按Heath和Packer的方法[13]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次,取平均值。

    1.5 南美蟛蜞菊毛狀根Cd含量測(cè)定

    南美蟛蜞菊毛狀根在培養(yǎng)2~3 d后,分別移入含100、300 μmol/L Cd 和 (或) 10、20、30 mmol/L CaCl2組合的液體培養(yǎng)基中,分別培養(yǎng)2 d、4 d和6 d后,取出毛狀根,用去離子水洗1遍后,再用約50 mL 20 mmol/L EDTA液洗2~3次,收集EDTA洗滌液,經(jīng)濃縮、常規(guī)消化后供測(cè)定毛狀根吸附的Cd含量用;殘余的培養(yǎng)基經(jīng)濾紙過(guò)濾后用去離子水定容至 50 mL ,經(jīng)常規(guī)消化后供測(cè)定培養(yǎng)基殘存的Cd含量用。毛狀根樣品置于60 ℃~70 ℃下烘干,精密稱(chēng)取粉碎過(guò)的毛狀根樣品于 100 mL錐形瓶中,加混酸(VHNO3∶VHClO4=4∶1) 15 mL消化,電爐上加熱烘干后,1% HNO3定容,供測(cè)定毛狀根吸收的Cd含量。各樣品的Cd含量采用原子吸收分光光度計(jì)法測(cè)定。其測(cè)定條件為:波長(zhǎng)228.8 nm,燈電流7 mA,狹縫寬度113 nm,干燥110 ℃,30 s,灰化500 ℃。實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次,取平均值。

    1.6 數(shù)據(jù)處理

    數(shù)據(jù)處理采用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析,采用LSD法進(jìn)行處理間的差異性比較 (P<0.05),采用Excell 2003進(jìn)行圖表制作。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 重金屬Cd單獨(dú)及其與Ca組合對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根生長(zhǎng)的影響

    南美蟛蜞菊毛狀根接種至MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1~2 d后,可見(jiàn)從毛狀根根段開(kāi)始產(chǎn)生新的白色側(cè)根,且根段不斷伸長(zhǎng)。與對(duì)照相比,培養(yǎng)至10 d時(shí),無(wú)論是低濃度還是高濃度Cd培養(yǎng)的毛狀根,其主、側(cè)根都變粗,根段表面從淺紅色變成紫紅色。其中,10~50 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根分支能力較強(qiáng),根尖白色且健壯;而高濃度100~300 μmol/L Cd培養(yǎng)的南美蟛蜞菊毛狀根的主根很少伸長(zhǎng),側(cè)根數(shù)量少且短小,根尖開(kāi)始發(fā)黃 (圖1, A-E)。隨著培養(yǎng)基中Cd濃度的升高和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),各濃度 Cd培養(yǎng)的南美蟛蜞菊毛狀根在培養(yǎng)后期時(shí)根尖都逐漸變黃,起始根段開(kāi)始變綠,并逐漸老化;而高濃度100~300 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根根段開(kāi)始發(fā)黑,呈現(xiàn)明顯的重金屬Cd毒害癥狀。

    圖2為Cd濃度對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根生長(zhǎng)的影響。從圖2可見(jiàn),對(duì)照 (不添加Cd的MS培養(yǎng)基) 毛狀根生物量 (鮮重) 在0~20 d的培養(yǎng)期內(nèi),隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加,至培養(yǎng)20 d時(shí)達(dá)到最大,其生物量增值倍數(shù)達(dá)到12.475;隨后毛狀根逐漸老化,生長(zhǎng)速率下降。與對(duì)照相比,不同濃度Cd培養(yǎng)的毛狀根生物量在培養(yǎng)后5~10 d期間也逐漸增加,除高濃度300 μmol/L Cd外,≤100 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根生物量增殖倍數(shù)都與對(duì)照相當(dāng)或略高。但培養(yǎng)15 d后,除低濃度10 μmol/L Cd外,50~300 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根生物量增殖倍數(shù)都隨培養(yǎng)基Cd濃度的增加而逐漸下降,培養(yǎng)至 25 d時(shí),高濃度300 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根鮮重增值倍數(shù)僅為同期對(duì)照毛狀根的40.69%。這表明高濃度Cd不僅抑制南美蟛蜞菊毛狀根的生長(zhǎng),而且會(huì)使毛狀根出現(xiàn)毒害癥狀。

    圖1 重金屬鎘單獨(dú)及其與鈣組合對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根生長(zhǎng)形態(tài)的影響Fig. 1 Effect of Cd alone or in combination with calcium on the growth and morphology of hairy roots. (A-E) Hairy roots cultured for 10 days in medium with different concentration of Cd. (A) 0 μmol/L. (B) 10 μmol/L. (C) 50 μmol/L. (D) 100 μmol/L. (E) 300 μmol/L. (F-H) Hairy roots cultured for 20 days in medium with 200 μmol/L Cd and 10?30 mmol/L Ca. (F) 200 μmol/L Cd+10 mmol/L Ca. (G) 200 μmol/L Cd +20 mmol/L Ca. (H) 200 μmol/L Cd +30 mmol/L Ca.

    圖3為200 μmol/L Cd 與10~30 mmol/L Ca組合對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根生長(zhǎng)的影響。與對(duì)照(僅添加200 μmol/L Cd培養(yǎng)的) 毛狀根相比,200 μmol/L Cd與10~30 mmol/L Ca組合培養(yǎng)的毛狀根鮮重增值倍數(shù)比對(duì)照顯著提高,其中以200 μmol/L Cd 與20 mmol/L Ca組合培養(yǎng)促進(jìn)毛狀根生長(zhǎng)的效果最好,不僅毛狀根生長(zhǎng)旺盛,而且分支側(cè)根更多;在毛狀根培養(yǎng)過(guò)程的各個(gè)時(shí)期,其鮮重增值倍數(shù)分別為對(duì)照的6.53倍、4.88倍、5.22倍、4.91倍和4.17倍;同時(shí),與對(duì)照相比,培養(yǎng)5 d后,200 μmol/L Cd和10~30 mmol/L Ca組合培養(yǎng)的南美蟛蜞菊毛狀根根表面也由淺紅色變成紫紅色,不僅根表面顏色比對(duì)照深;且其主、側(cè)根變得更粗而彎曲 (圖1,F(xiàn),G,H)。而與對(duì)照 (僅添加300 μmol/L Cd培養(yǎng)的) 毛狀根相比,300 μmol/L Cd與10~30 mmol/L Ca組合培養(yǎng)的毛狀根根尖褐變程度和根生長(zhǎng)受抑制程度明顯比對(duì)照輕,不僅毛狀根根系能產(chǎn)生較多的分枝側(cè)根,根生長(zhǎng)形態(tài)正常,根尖褐化變慢;而且300 μmol/L Cd 與10~30 mmol/L Ca組合培養(yǎng)的毛狀根鮮重增殖倍數(shù)與 200 μmol/L Cd和10~30 mmol/L Ca組合培養(yǎng)的趨勢(shì)相似,其根表面也呈現(xiàn)深紫紅色、根體增粗且部分彎曲。這表明,低濃度Cd對(duì)毛狀根生長(zhǎng)的影響較小,甚至促進(jìn)生長(zhǎng);但高濃度Cd則抑制其生長(zhǎng),且濃度愈高抑制程度愈強(qiáng),甚至產(chǎn)生毒害;但外源添加10~30 mmol/L Ca可緩解高濃度Cd對(duì)毛狀根生長(zhǎng)的抑制和毒害。

    2.2 Cd單獨(dú)及其與Ca組合對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根可溶性蛋白含量的影響

    圖2 Cd濃度對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根生長(zhǎng)的影響Fig. 2 Effect of Cd concentration in MS medium on the growth of W. trilobata hairy roots.

    圖3 200 μmol/L Cd與10~30 mmol/L Ca組合對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根生長(zhǎng)的影響Fig. 3 Effect of 200 μmol/L Cd in combination with 10?30 mmol/L Ca on the growth of W. trilobata hairy roots.

    圖4 Cd濃度對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根可溶性蛋白含量的影響Fig. 4 Effect of Cd concentration on the soluble protein content in hairy roots of W. trilobata.

    圖4為培養(yǎng)基Cd濃度對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根可溶性蛋白含量的影響。從圖4可見(jiàn),無(wú)論是對(duì)照還是不同濃度Cd培養(yǎng)的毛狀根,其可溶性蛋白含量都隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而呈先上升后逐漸下降的趨勢(shì)。與對(duì)照相比,10 μmol/L Cd處理的毛狀根可溶性蛋白含量?jī)H在培養(yǎng)后5~10 d期間比同期對(duì)照提高;而后隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸下降。50 μmol/L Cd處理的毛狀根可溶性蛋白含量幾乎在整個(gè)培養(yǎng)期間都比對(duì)照提高,其中,以培養(yǎng)15 d的可溶性蛋白含量最高,達(dá)到7.12 mg/g FW;而100 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根可溶性蛋白含量則比對(duì)照低;而當(dāng)毛狀根在300 μmol/L Cd中培養(yǎng)時(shí),其可溶性蛋白含量?jī)H在培養(yǎng)后5~10 d期間比同期對(duì)照提高,且隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸下降;但其可溶性蛋白含量在5~25 d的培養(yǎng)期間均比100 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根高。這表明在培養(yǎng)過(guò)程中添加10~50 μmol/L Cd可在一定程度上促進(jìn)毛狀根可溶性蛋白的產(chǎn)生,但隨著Cd脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)和Cd濃度的升高,毛狀根的蛋白質(zhì)合成受阻或合成能力逐漸下降。

    而與對(duì)照 (僅添加 200 μmol/L Cd) 培養(yǎng)的毛狀根相比,200 μmol/L Cd和10~20 mmol/L Ca組合培養(yǎng)的毛狀根可溶性蛋白含量在培養(yǎng)后5~15 d間均比對(duì)照略高,而當(dāng)毛狀根在200 μmol/L Cd和30 mmol/L Ca組合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí),雖在培養(yǎng)5~15 d期間的可溶性蛋白含量比對(duì)照低,但在培養(yǎng)15~25 d期間,其可溶性蛋白含量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高,且明顯高于對(duì)照。與對(duì)照 (僅添加300 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根) 相比,300 μmol/L Cd和10~30 mmol/L Ca組合培養(yǎng)的毛狀根可溶性蛋白含量也隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高后逐漸下降的趨勢(shì),但其含量均比同期對(duì)照明顯升高,尤其是當(dāng)毛狀根在300 μmol/L Cd和30 mmol/L Ca中培養(yǎng)時(shí),其可溶性蛋白含量分別是同期對(duì)照的 2.39倍、1.80倍、1.62倍、3.11倍和 2.67倍。這表明,隨著Cd脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng),Ca可能通過(guò)促進(jìn)蛋白水解酶活性,加強(qiáng)了某些蛋白質(zhì)的分解,通過(guò)提高南美蟛蜞菊毛狀根的可溶性蛋白含量來(lái)影響重金屬Cd對(duì)毛狀根生長(zhǎng)的抑制或毒害。

    2.3 Cd單獨(dú)及其與Ca組合對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根POD活性的影響

    植物體內(nèi)的超氧化物歧化酶 (SOD)、過(guò)氧化物酶 (POD) 是活性氧自由基清除系統(tǒng)中重要的保護(hù)酶,其活性的提高可以為細(xì)胞清除過(guò)多的自由基,是使細(xì)胞免受毒害的調(diào)節(jié)反應(yīng),但這種調(diào)節(jié)能力有一定限度。從圖5可見(jiàn),對(duì)照 (0 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根) 的POD活性在培養(yǎng)過(guò)程中呈緩慢上升的趨勢(shì),與對(duì)照相比,不同濃度Cd培養(yǎng)的毛狀根POD活性則呈先上升后下降的趨勢(shì);而無(wú)論是低濃度Cd (10 μmol/L和50 μmol/L) 還是高濃度Cd (100 μmol/L和300 μmol/L) 培養(yǎng)的毛狀根POD活性在5~20 d內(nèi)均比同期對(duì)照高。其中,100 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根POD活性在培養(yǎng)至10 d達(dá)到最高,為同期對(duì)照的1.47倍,但培養(yǎng)10 d后其POD活性隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降,至培養(yǎng)25 d時(shí)其POD活性甚至比對(duì)照及其他濃度 Cd培養(yǎng)的都低;而300 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根POD活性則在培養(yǎng)的各個(gè)時(shí)期都比對(duì)照和其他鎘濃度培養(yǎng)的毛狀根高,其POD活性分別比同期對(duì)照增加25.6%、63.6%、77.6%、64.4%和44.4%,達(dá)到顯著水平 (P<0.05)。這表明,在一定Cd濃度范圍內(nèi)南美蟛蜞菊毛狀根可通過(guò)提高其POD活性來(lái)抵御Cd脅迫引起的毛狀根生長(zhǎng)的抑制或毒害。

    圖6為200 μmol/L與10~30 mmol/L Ca組合對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根POD活性影響的測(cè)定結(jié)果。從圖6可見(jiàn),200 μmol/L Cd和10~30 mmol/L Ca組合培養(yǎng)的毛狀根 POD活性均比對(duì)照 (僅添加200 μmol/L Cd) 毛狀根的POD活性明顯降低,其毛狀根POD活性在培養(yǎng)后5~20 d內(nèi)均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高;20 d后,除200 μmol/L Cd和30 mmol/L Ca組合培養(yǎng)的毛狀根POD活性繼續(xù)升高外,200 μmol/L Cd和 10 mmol/L及20 mmol/L Ca組合培養(yǎng)的毛狀根POD活性迅速下降,培養(yǎng)到25 d時(shí)分別僅為對(duì)照的31.1%和38.0%。而300 μmol/L Cd和10~30 mmol/L Ca組合培養(yǎng)的毛狀根POD活性與200 μmol/L Cd和10~30 mmol/L Ca組合培養(yǎng)的毛狀根的POD活性變化趨勢(shì)相似,其 POD活性也比僅添加300 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根明顯降低。這表明,外源Ca與Cd組合可以明顯降低南美蟛蜞菊毛狀根的POD活性,并可能通過(guò)對(duì)POD活性的調(diào)節(jié)來(lái)拮抗或減輕重金屬Cd對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根生長(zhǎng)的抑制或毒害。

    2.4 Cd單獨(dú)及其與Ca組合對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根SOD活性的影響

    圖5 Cd濃度對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根POD活性的影響Fig. 5 Effect of Cd concentrations on POD activities in hairy roots of W. trilobata.

    圖6 200 μmol/L Cd與10~30 mmol/L Ca組合對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根POD活性的影響Fig. 6 Effect of 200 μmol/L Cd in combination with 10?30 mmol/L Ca on POD activities in hairy roots of W. trilobata.

    圖7 Cd濃度對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根SOD活性的影響Fig. 7 Effect of Cd concentrations on SOD activities in hairy roots of W. trilobata.

    圖7為Cd濃度對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根SOD活性影響的測(cè)定結(jié)果。從圖7可見(jiàn),與對(duì)照相比,不同濃度Cd培養(yǎng)的南美蟛蜞菊毛狀根SOD活性在培養(yǎng)后5~20 d間隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高,且其活性均比同期對(duì)照明顯提高;而培養(yǎng) 20 d后,對(duì)照毛狀根的SOD活性繼續(xù)上升;而不同濃度Cd培養(yǎng)的毛狀根SOD活性則逐漸下降,培養(yǎng)至25 d時(shí),10、50、100 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根 SOD活性甚至比同期對(duì)照還低;其中以100 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根SOD活性最低,僅為同期對(duì)照SOD活性的64.06%。該結(jié)果表明,重金屬Cd可明顯提高毛狀根的SOD活性,并可能通過(guò)對(duì)毛狀根SOD活性的調(diào)節(jié)來(lái)影響Cd對(duì)毛狀根生長(zhǎng)的抑制或毒害。

    而與對(duì)照相比,當(dāng)南美蟛蜞菊毛狀根在200 μmol/L Cd和10 mmol/L 或30 mmol/L Ca中培養(yǎng)5~20 d時(shí),其SOD活性大都比同期僅添加200 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根低,但培養(yǎng)至20~25 d時(shí)其SOD活性與對(duì)照相當(dāng)或略升高;而200 μmol/L Cd和20 mmol/L Ca培養(yǎng)的毛狀根SOD活性在培養(yǎng)后5~25 d期間則始終比對(duì)照降低,培養(yǎng)至 25 d時(shí)其 SOD活性為同期對(duì)照的46.76%。此外,當(dāng)毛狀根在300 μmol/L Cd和10、20和30 mmol/L Ca組合中培養(yǎng)時(shí),在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中其SOD活性呈先升后降的趨勢(shì),其SOD活性均較對(duì)應(yīng)的僅添加300 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根不同程度的降低??梢?jiàn),與僅加高濃度 Cd培養(yǎng)的毛狀根相比,外源加入10~30 mmol/L Ca可降低毛狀根的SOD活性。而SOD作為一種重要的防御酶,其活性的維持和提高是植物耐受Cd脅迫的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。該結(jié)果表明,南美蟛蜞菊毛狀根對(duì)Cd脅迫具有一定的耐受能力;而外源添加一定濃度的 Ca可能通過(guò)降低毛狀根的SOD活性,來(lái)減輕或緩解重金屬Cd對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根生長(zhǎng)的抑制或毒害。

    2.5 Cd單獨(dú)及其與Ca組合對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根MDA含量的影響

    膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量的高低是細(xì)胞膜受損傷程度的重要指標(biāo)之一。從圖8可見(jiàn),無(wú)論南美蟛蜞菊毛狀根是在10 μmol/L或50 μmol/L低濃度 Cd,還是在高濃度 100 μmol/L Cd和300 μmol/L Cd中培養(yǎng),其MDA含量均比同期對(duì)照升高,并且隨著Cd濃度的增加而逐漸升高;其中,以300 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根MDA含量最高,在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中,其MDA含量分別為同期對(duì)照毛狀根MDA含量的1.53、1.49、1.23、1.17和2.10倍。這可能表明,重金屬Cd對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根生長(zhǎng)的抑制或毒害可能與其對(duì)毛狀根細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的促進(jìn)有關(guān)。

    圖8 Cd濃度對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根MDA含量的影響Fig. 8 Effect of Cd concentration on MDA content in hairy roots of W. trilobata.

    而與對(duì)照 (僅添加 200 μmol/L Cd) 相比,200 μmol/L Cd和20~30 mmol/L Ca組合培養(yǎng)的南美蟛蜞菊毛狀根 MDA含量比對(duì)照降低,而200 μmol/L Cd和10 mmol/L Ca組合培養(yǎng)的毛狀根 MDA含量在 5~15 d培養(yǎng)期間比對(duì)照略高,而培養(yǎng) 15 d后也逐漸降低,至培養(yǎng) 25 d時(shí)其MDA含量比同期對(duì)照降低了33.72%。圖9為300 μmol/L Cd與10~30 mmol/L Ca組合對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根 MDA含量的影響。從圖 9可見(jiàn),與對(duì)照 (僅添加300 μmol/L Cd) 相比,300 μmol/L Cd和10、20和30 mmol/L Ca組合培養(yǎng)的毛狀根MDA含量在培養(yǎng)后5~20 d期間,其MDA含量都比對(duì)照明顯降低;而培養(yǎng)至25 d時(shí),300 μmol/L Cd和10~20 mmol/L Ca組合培養(yǎng)的毛狀根的MDA含量略高于對(duì)照,但300 μmol/L Cd和30 mmol/L Ca培養(yǎng)毛狀根的MDA含量則比對(duì)照低。可見(jiàn),外源加入10~30 mmol/L Ca可降低毛狀根的MDA含量。這可能表明,外源Ca可能通過(guò)降低毛狀根細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度而對(duì)重金屬鎘對(duì)毛狀根生長(zhǎng)的抑制或毒害產(chǎn)生拮抗作用或緩解效應(yīng)。

    2.6 Cd2+及其與 Ca2+組合對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根吸收Cd2+的影響

    圖10為培養(yǎng)液Cd2+濃度對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根吸收重金屬Cd2+的影響。從圖10可見(jiàn),當(dāng)毛狀根在含有100 μmol/L和300 μmol/L Cd2+的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí),毛狀根能從培養(yǎng)基中吸收重金屬Cd2+,其中當(dāng)培養(yǎng)基鎘濃度100 μmol/L Cd2+時(shí),毛狀根對(duì)Cd2+的吸收量較高,且Cd2+吸收量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高。然而,當(dāng)毛狀根在300 μmol/L Cd2+培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d、4 d和6 d后,其Cd2+吸收量則分別比100 μmol/L Cd2+培養(yǎng)的同期毛狀根降低約40.23%、32.35%和42.53%。這表明,南美蟛蜞菊毛狀根能吸收重金屬Cd2+,但其對(duì) Cd2+的吸收效率與 Cd2+的濃度和培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短等因素有關(guān)。

    圖9 300 μmol/LCd與10~30 mmol/L Ca組合對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根MDA含量的影響Fig. 9 Effect of 300 μmol/L Cd in combination with 10?30 mmol/L Ca on on MDA content in hairy roots of W. trilobata.

    圖10 Cd2+濃度對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根吸收 Cd2+的影響Fig. 10 Effect of Cd concentrations on absorption of Cd2+ in hairy roots of W. trilobata.

    圖11 100 μmol/L Cd2+與10~30 mmol/L Ca2+組合對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根吸收Cd2+的影響Fig. 11 Effect of 100 μmol/L Cd2+ in combination with 10?30 mmol/L Ca2+ on absorption of Cd2+ in hairy roots of W. trilobata.

    圖12 300 μmol/L Cd2+與10~30 mmol/L Ca2+組合對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根吸收Cd2+的影響Fig. 12 Effect of 300 μmol/L Cd2+ in combination with 10?30 mmol/L Ca2+ on absorption of Cd2+ in hairy roots of W. trilobata.

    圖11和圖 12分別為 100 μmol/L Cd2+和300 μmol/L Cd2+與10~30 mmol/L Ca2+組合培養(yǎng)對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根吸收Cd2+的測(cè)定結(jié)果。由圖11可知,與對(duì)照 (僅添加100 μmol/L Cd2+培養(yǎng)的毛狀根) 相比,外源添加10~30 mmol/L Ca2+可顯著降低毛狀根對(duì)Cd2+的吸收,其鎘含量大都隨培養(yǎng)基中Ca2+濃度的升高而逐漸下降。培養(yǎng)到第6天時(shí),100 μmol/L Cd2+與10~30 mmol/L Ca2+組合培養(yǎng)的毛狀根對(duì) Cd2+的吸收量分別比同期對(duì)照降低了71.56%、87.49%和85.32%,達(dá)到顯著水平 (P<0.05)。而從圖 12可見(jiàn),與對(duì)照 (僅添加300 μmol/L Cd2+培養(yǎng)的) 毛狀根相比,外源加入10 mmol/L Ca2+時(shí),毛狀根對(duì)Cd2+的吸收量不但沒(méi)有降低,反而比對(duì)照有明顯提高,培養(yǎng)2 d、4 d和6 d時(shí)其毛狀根Cd2+含量分別為同期對(duì)照毛狀根Cd2+吸收量的2.26倍、1.31倍和1.26倍;但外源加入30 mmol/L Ca2+時(shí)毛狀根對(duì)Cd2+的吸收才受到明顯抑制,培養(yǎng)至6 d時(shí),其毛狀根吸收的Cd2+含量約比同期對(duì)照降低61.58%。可見(jiàn),外源添加 Ca2+可以影響南美蟛蜞菊毛狀根對(duì)重金屬Cd2+的吸收能力,但當(dāng)用高濃度Cd2+培養(yǎng)毛狀根時(shí),需添加較高濃度的外源Ca2+才能有效抑制毛狀根對(duì)Cd2+的吸收。而這表明外源Ca2+可能通過(guò)降低或減少毛狀根對(duì)Cd2+的吸收,從而拮抗或減弱高濃度Cd2+對(duì)毛狀根生長(zhǎng)的抑制或毒害。

    2.7 Cd2+及其與 Ca2+組合對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根吸附Cd2+的影響

    圖13為Cd2+濃度對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根吸附Cd2+的影響。從圖 13可見(jiàn),當(dāng)毛狀根在含有100 μmol/L和300 μmol/L Cd2+的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí),毛狀根能吸附培養(yǎng)基中的Cd2+,并且其Cd2+吸附量隨培養(yǎng)基 Cd2+濃度的增加及培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而升高;其中300 μmol/L Cd2+培養(yǎng)的毛狀根吸附的Cd2+含量較100 μmol/L Cd2+培養(yǎng)的高,培養(yǎng)2 d、4 d和6 d后,其Cd2+吸附量分別約為同期100 μmol/L Cd2+的0.82倍、3.74倍和5.26倍。這表明,南美蟛蜞菊毛狀根具有較強(qiáng)的吸附重金屬Cd2+的能力,且毛狀根對(duì)鎘的吸附作用與所用的Cd2+濃度及培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短等有關(guān)。

    圖13 Cd2+濃度對(duì)EDTA洗脫的毛狀根重金屬Cd2+含量的影響Fig. 13 Effect of Cd2+ concentration on Cd2+ content diluted by EDTA solution from hairy roots of W. trilobata.

    圖14為100 μmol/L和10~30 mmol/L Ca2+組合對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根吸附Cd2+的測(cè)定結(jié)果。由圖14可知,與對(duì)照 (僅100 μmol/L Cd2+培養(yǎng)的毛狀根) 相比,外源加入 10~30 mmol/L Ca2+時(shí)毛狀根對(duì) Cd2+的吸附量隨著 Ca2+濃度的升高增加而逐漸降低;其中以培養(yǎng)4 d時(shí)100 μmol/L Cd2+與 10~30 mmol/L Ca2+組合培養(yǎng)的毛狀根對(duì)Cd2+的吸附量下降程度最明顯,其Cd2+吸附量分別比同期對(duì)照下降約38.16%、62.26%和66.90%,達(dá)到顯著水平 (P<0.05)。而與100 μmol/L Cd2+與10~30 mmol/L Ca2+組合相比,300 μmol/L Cd2+和 10~30 mmol/L Ca2+組合更可降低毛狀根對(duì)Cd2+的吸附量;培養(yǎng)到6 d時(shí),毛狀根對(duì)Cd2+的吸附量分別比同期對(duì)照 (僅添加 300 μmol/L Cd2+培養(yǎng)的毛狀根) 下降了 66.01%、71.13%和97.53%,差異達(dá)到顯著水平 (P<0.05)??梢?jiàn),外源加入10~30 mmol/L Ca2+能不同程度地降低毛狀根對(duì)Cd2+的吸附量,并因而減少Cd2+對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根的抑制或毒害。

    圖14 100 μmol/L Cd2+與10~30 mmol/L Ca2+組合對(duì)EDTA洗脫的毛狀根Cd2+含量的影響Fig. 14 Effect of 100 μmol/L Cd2+ in combination with 10?30 mmol/L Ca2+ on Cd2+ content diluted by EDTA solution from hairy roots of W. trilobata.

    3 討論

    一些研究表明,Cd對(duì)植物生長(zhǎng)、根的形態(tài)和側(cè)根發(fā)生及其毒害的影響具有濃度劑量效應(yīng)和因植物類(lèi)型而異[14-15],如低濃度 (0.1 mg/L) Cd可促進(jìn)小白菜Brassica chinensis L.側(cè)根的發(fā)育,而≥5 mg/L Cd 則可使小白菜根變短變粗,根毛缺乏,側(cè)根分枝減少[14];而受鎘毒害的玉米幼苗根尖膨大變褐繼而腐爛[15]。然而,所有這些有關(guān)Cd對(duì)植物生長(zhǎng)和毒害的研究大都是通過(guò)水培、沙培或盆栽的方法來(lái)研究Cd對(duì)完整植株生長(zhǎng)的影響,少見(jiàn)有關(guān)Cd對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物如愈傷組織或毛狀根生長(zhǎng)影響的系統(tǒng)研究報(bào)道,未見(jiàn)有關(guān)重金屬Cd對(duì)南美蟛蜞菊W. trilobata毛狀根生長(zhǎng)影響及其Cd耐受能力研究的報(bào)道。Fornazier 等發(fā)現(xiàn),低濃度 (0.01~0.1 mmol/L) CdCl2能明顯促進(jìn)甘蔗Saccharum officinarum L. 愈傷組織的生長(zhǎng),但高濃度 (0.5~1 mmol/L) CdCl2則強(qiáng)烈抑制其生長(zhǎng)[16]。這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不完全一致。在本實(shí)驗(yàn)中,培養(yǎng)基中Cd≤50 μmol/L 時(shí)能促進(jìn)南美蟛蜞菊毛狀根生長(zhǎng),而高于100 μmol/L Cd 則抑制毛狀根生長(zhǎng),使其側(cè)根短小,根尖發(fā)褐或變黑,濃度越高抑制越重甚至產(chǎn)生毒害。所不同的是,在本實(shí)驗(yàn)中,無(wú)論是低濃度還是高濃度Cd培養(yǎng)南美蟛蜞菊毛狀根,培養(yǎng)10 d后其主、側(cè)根都變粗,分支較對(duì)照少;根體由淺紅色變成紫紅色;之后,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和培養(yǎng)基Cd濃度的加大,毛狀根根尖逐漸變黃,直至發(fā)褐或變黑。然而,張艷等[17]液體培養(yǎng)黃瓜毛狀根時(shí)發(fā)現(xiàn),Cd≤10 mg/L能促進(jìn)毛狀根生長(zhǎng),并使根增粗,而Cd≥15 mg/L才抑制黃瓜毛狀根生長(zhǎng),使根變得十分短而小,根尖膨大但不變褐,根表面變紅。此外,Cd≤50 μmol/L幾乎不影響褐脈少花龍葵毛狀根的生長(zhǎng),甚至還能略促進(jìn)生長(zhǎng);但≥100 μmol/L高濃度Cd則開(kāi)始抑制生長(zhǎng),且濃度愈高抑制作用愈明顯,使毛狀根側(cè)根根尖變褐變短,數(shù)目減少[18]。這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不完全一致。而這種差異表明重金屬Cd對(duì)植物毛狀根生長(zhǎng)及毒害影響的程度不僅具有劑量效應(yīng),而且還可因植物或毛狀根類(lèi)型而異。

    已有的研究表明,Cd對(duì)植物的毒害可能是通過(guò)損害生物體內(nèi)的抗氧化保護(hù)酶POD和SOD的活性及蛋白質(zhì)的合成等變化表現(xiàn)出毒性[19]。如低濃度Cd能促進(jìn)植物蛋白質(zhì)合成,但高濃度Cd則對(duì)蛋白質(zhì)合成起破壞或抑制作用[15]。而張利紅等在研究Cd污染對(duì)小麥生長(zhǎng)和部分生理特性影響時(shí)發(fā)現(xiàn),隨著 Cd濃度的增加,小麥幼苗的SOD、POD活性隨Cd濃度的增高而增加[20];而不同濃度Cd培養(yǎng)的黃瓜毛狀根可溶性蛋白含量大都隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸下降,但其 SOD和 POD活性則逐漸升高[17]。然而在高濃度 Cd培養(yǎng)時(shí),油菜Brassica napus L. cv Drakkar植株的抗氧化酶SOD和CAT活性均急劇下降;但高濃度Cd也可顯著降低白菜Brassica campestris L. ssp. chinensis (L.) Makino葉片和蘆葦Phragmite ausralis L.幼苗的SOD、CAT及POD 活性[21-22];然而也有報(bào)道表明,在超積累植物庭薺 Alyssum maritimum L.中,高濃度 Cd卻可提高該植物的SOD活性[23];而受Cd脅迫時(shí),印度芥菜Brassica juncea L.植株的抗氧化酶活性則保持恒定或幾乎不變[24]。此外,隨著鎘濃度增加,土培的Cd超富集植物圓錐南芥 Arabis paniculata Franch的SOD活性呈下降趨勢(shì),但其POD和CAT等活性則呈先升高后降低的變化趨勢(shì)[25]。而這些與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不一致。在本實(shí)驗(yàn)中,各濃度Cd培養(yǎng)的南美蟛蜞菊毛狀根的POD和SOD活性均隨著Cd濃度提高而逐漸升高,其中尤以POD活性的表現(xiàn)最為明顯,300 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根POD活性明顯高于其他濃度培養(yǎng)的毛狀根。這些結(jié)論表明,Cd對(duì)植物抗氧化保護(hù)酶活性的影響程度可能與所使用的Cd濃度、植物類(lèi)型以及毛狀根的生長(zhǎng)特性等有關(guān)。

    丙二醛 (MDA) 是植物細(xì)胞膜脂過(guò)氧化作用的產(chǎn)物之一,其含量的高低在一定程度上能反映膜脂過(guò)氧化水平和膜結(jié)構(gòu)的受害程度及植株的自我修復(fù)能力。有關(guān)Cd促進(jìn)植物細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化已有不少報(bào)道。如用10~50 μmol/L Cd培養(yǎng)印度芥菜和油菜時(shí)發(fā)現(xiàn),Cd脅迫僅使油菜體內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化水平增加,而印度芥菜的 MDA含量則保持不變[24]。但扁桃Prunus dulcis L.幼苗在0~150 μmol/L Cd 水培時(shí)發(fā)現(xiàn),無(wú)論是根還是葉中,高濃度Cd 可通過(guò)提高脂質(zhì)過(guò)氧化水平而對(duì)植株產(chǎn)生氧化損傷[26]。而在本實(shí)驗(yàn)中,無(wú)論南美蟛蜞菊毛狀根在低濃度≤50 μmol/L Cd,還是在高濃度 (>100 μmol/L Cd) 中培養(yǎng),其MDA含量大都比同期對(duì)照 (不加 Cd處理) 升高,并且300 μmol/L Cd 處理的MDA含量在培養(yǎng)的各個(gè)時(shí)期幾乎都是最高的。而施和平等[18]報(bào)道,不同濃度Cd培養(yǎng)的褐脈少花龍葵毛狀根MDA含量均比同期對(duì)照顯著提高,表明Cd可促進(jìn)毛狀根細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化。然而,在Cd脅迫處理的胡蘿卜Daucus carota L. 植株及其毛狀根中并未出現(xiàn)明顯的膜脂過(guò)氧化[27]。這顯然與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相反。而這種差異的產(chǎn)生表明Cd對(duì)植物細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的促進(jìn)也可能因所使用的Cd濃度、植物種類(lèi)和毛狀根類(lèi)型等而異。

    Ca是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的大量元素。已有的研究表明,外源鈣可能通過(guò)對(duì)有害礦質(zhì)元素的拮抗作用[28]、維持較高的抗氧化保護(hù)酶系統(tǒng)活力[29]以及發(fā)揮鈣信使系統(tǒng)的功能[30]等而發(fā)揮作用。如在鎘脅迫下,玉米根部供鈣可明顯提高其SOD、POD和CAT 活性,降低其葉片丙二醛含量[15]。而在 Cd2+毒害下,用 5 mmol/L Ca2+和10 mmol/L Ca2+處理玉米種子后,其幼苗的SOD和CAT活性增加,而MDA含量逐漸下降,表明Ca能減少以至消除Cd2+對(duì)種子活力和幼苗生長(zhǎng)的毒害作用[31]。然而,這些研究都是以完整植物為材料,少見(jiàn)有關(guān)Ca和Cd結(jié)合對(duì)毛狀根生長(zhǎng)影響的研究報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中,南美蟛蜞菊毛狀根不僅能從培養(yǎng)基中吸收和吸附Cd2+,而且,所吸收和吸附的 Cd2+含量隨著培養(yǎng)基 Cd2+濃度的升高而增加;但外源加入 10~30 mmol/L Ca2+后,毛狀根吸收和吸附的Cd2+含量則逐漸降低。此外還發(fā)現(xiàn),與僅添加 Cd2+培養(yǎng)相比,外加10~30 mmol/L Ca2+不僅能通過(guò)離子拮抗而減少毛狀根對(duì)Cd2+的吸收,降低其Cd2+含量,而且可降低毛狀根可溶性蛋白含量和MDA含量,提高其抗氧化酶SOD活性,降低其膜脂過(guò)氧化水平,從而解除或減輕重金屬Cd2+對(duì)其生長(zhǎng)的毒害。賀迪等[22]發(fā)現(xiàn),在營(yíng)養(yǎng)液中 Cd2+濃度由 2 μmol/L增加到0.6 mmol/L時(shí),蘆葦幼苗的SOD、CAT和 POD等抗氧化酶活性顯著降低,而加入10 mmol/L CaCl2則可抑制 MDA產(chǎn)生,并刺激Cd2+脅迫蘆葦幼苗葉片SOD和CAT活性的增強(qiáng),從而提高蘆葦對(duì)Cd2+的抗性。而這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相似。這說(shuō)明,外源 Ca2+可以緩解過(guò)量 Cd2+脅迫引起的膜脂過(guò)氧化和刺激植物細(xì)胞抗氧化酶活性的提高,從而對(duì)Cd2+導(dǎo)致的毛狀根生長(zhǎng)的抑制或毒害產(chǎn)生拮抗或緩解效果。

    有研究表明,外源Ca2+在逆境脅迫中的作用可能與Ca2+-CaM的作用或與Ca2+在穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮的作用有關(guān)[30]。而在研究Cd2+對(duì)蘿卜Raphanus sativus L. 種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)時(shí)還發(fā)現(xiàn),Ca2+可部分逆轉(zhuǎn)Cd2+對(duì)種子生長(zhǎng)和Cd2+吸收的抑制,而Cd2+不僅可與Ca2+競(jìng)爭(zhēng)CaM的結(jié)合位點(diǎn);還可抑制Ca2+-CaM依賴(lài)的磷酸二酯酶的活化,這表明Cd2+對(duì)種子萌發(fā)的毒害是通過(guò)Cd2+對(duì)Ca2+-CaM的影響而發(fā)揮作用[32]。而在我們的結(jié)果中,外源供給10~30 mmol/L Ca2+后,毛狀根吸收和吸附的Cd2+含量雖比對(duì)照明顯降低,或隨著培養(yǎng)基中Ca2+濃度增加而降低,但含有相當(dāng)高含量Cd2+的毛狀根仍能較好地正常生長(zhǎng)。這表明外源加入足夠 Ca2+并不能完全抑制毛狀根對(duì)Cd2+的吸收和吸附;而這是否表明在Cd-Ca拮抗過(guò)程中,外源Ca2+是否是通過(guò)Ca2+-CaM介導(dǎo)而發(fā)揮作用?或者說(shuō)是否通過(guò)維持細(xì)胞內(nèi) Ca2+的低穩(wěn)態(tài)水平而發(fā)揮其生理作用?重金屬鎘毒害是否與通過(guò)影響Ca2+-CaM的功能有關(guān)則待進(jìn)一步研究。

    本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,南美蟛蜞菊毛狀根具有較強(qiáng)的重金屬Cd耐受能力;而外源加入Ca可拮抗Cd對(duì)毛狀根生長(zhǎng)的抑制或毒害,減少毛狀根對(duì)Cd的吸收和吸附。我們的結(jié)果為今后利用具發(fā)達(dá)根系的南美蟛蜞菊毛狀根及其再生植株來(lái)對(duì)受重金屬Cd污染的環(huán)境進(jìn)行植物修復(fù)奠定了相關(guān)的前期工作基礎(chǔ)并提供了可能性。

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