柴歡寧神顆粒對肝郁失眠證候大鼠模型行為學(xué)及下丘腦—垂體—腎上腺軸的影響

獨(dú)家能 聶春霞 許雯雯 劉聰 康永 倪艷 郝旭亮

[摘要] 目的 探討柴歡寧神顆粒對多因素復(fù)合法致肝郁失眠證候模型大鼠的行為學(xué)和下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸的影響。 方法 將70只SD大鼠雌雄各半，隨機(jī)分為空白組，模型組，柴歡寧神顆粒高、中、低劑量組（2.25、1.125、0.5625 g/kg），解郁安神組（1.25 g/kg），艾司唑侖組（0.5 mg/kg）。除空白組外，其余各組均采用束縛+夾尾刺激+PCPA多因素制備肝郁失眠證候的大鼠模型。各給藥組經(jīng)灌胃給予相應(yīng)的藥物，空白組及模型組給予等體積的生理鹽水，每日1次，連續(xù)14 d。分別于實(shí)驗(yàn)第0、7、14、21天測試各組大鼠的體重、糖水消耗量、睡眠狀況及水迷宮定位航行和空間搜索能力等指標(biāo)評價(jià)大鼠的行為學(xué)。后采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測大鼠下丘腦中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）、血漿促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）和血清皮質(zhì)醇（CORT）水平。 結(jié)果 與空白組比較，模型組大鼠體重、糖水消耗量、睡眠時(shí)間、空間搜索能力明顯降低，下丘腦CRH、血漿ACTH、血清CORT及水迷宮定位航行時(shí)間升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。經(jīng)給藥干預(yù)后，與模型組比較，各給藥組可增加大鼠的體重、睡眠時(shí)間、糖水消耗量、穿越平臺(tái)的次數(shù)，同時(shí)降低大鼠下丘腦CRH、血漿ACTH、血清CORT的水平，以及定位航行的時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 柴歡寧神顆?？擅黠@改善肝郁失眠證候模型大鼠的行為學(xué)，延長睡眠時(shí)間，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)改善HPA軸功能的亢進(jìn)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 柴歡寧神顆粒；肝郁失眠；下丘腦-垂體-腎上腺軸；作用機(jī)制

[中圖分類號(hào)] R256.23 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）02（b）-0013-05

[Abstract] Objective To investigate the effects of Chaihuan Ningshen Granules on the behavior and hypothalamic-pituitary-adrenal （HPA） axis of rats with insomnia with syndrome of stagnation of liver qi induced by multifactor combination therapy. Methods Seventy SD rats （half male and half female） were randomly divided into 7 groups： blank group， model group， high， medium and low dose of Chaihuan Ningshen Granules groups （2.25， 1.125， 0.5625 g/kg）， Jieyu Anshen Granules group （1.25 g/kg）， Estazolam group （0.5 mg/kg）. Except for the blank group， rats in each group were established for the model with syndrome of stagnation of liver qi by multifactorial stimulation including tie， pinch-tail and PCPA. Each administration group was treated daily with an oral infusion of corresponding drug， whereas， the blank group and the model group were given equal volume of saline once a day for 14 days. All rats were tested on the 0， 7th， 14th， 21st d for body weight， sugar consumption， sleep status， water maze navigation and spatial search ability to evaluate the behavior of rats， The levels of corticotropin-releasing hormone （CRH）， adrenocorticotropic hormone （ACTH） and serum cortisol （CORT） in the hypothalamus of rats were detected by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. Results Compared with blank group， the body weight， sugar consumption， sleep duration and spatial search ability of the model group were significantly decreased， while the hypothalamic CRH， plasma ACTH， serum CORT and water maze positioning sailing time were markedly increased （P < 0.05）. Compared with the model group， all medicine groups could significantly increase body weight， sleep duration， consumption of sugar water and the number of crossing platform （P < 0.05）， meanwhile decrease the levels of the hypothalamic CRH， plasma ACTH and serum CORT， as well as water maze positioning sailing time， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Chaihuan Ningshen Granules can remarkably improve the behavior of rats with insomnia with syndrome of stagnation of liver qi， and prolong their sleep time， the mechanism underlying this event is mainly dependent on the improvement effect of Chaihuan Ningshen Granules on the function of HPA axis.

[Key words] Chaihuan Ningshen Granules； Insomnia with syndrome of stagnation of liver qi； Hypothalamic-pituitary-adrenal axis； Mechanism

失眠是臨床上最為常見的一種生理、心理疾病，指入睡困難或睡眠質(zhì)量差，給人們的正常工作和生活帶來嚴(yán)重的不良影響[1-2]。其中，在失眠患者中，肝郁引起的失眠所占比重較大[3]。柴歡寧神顆粒是山西省中醫(yī)院調(diào)節(jié)改善肝郁失眠的常用制劑，組方由柴胡、黃芩、黨參、大黃等14味藥構(gòu)成，具有調(diào)和陰陽、宣暢化郁、重鎮(zhèn)安神之功，多年的臨床應(yīng)用對于肝郁失眠有一定的療效，但目前對其治療的具體作用機(jī)制尚不明確。因此本研究采用多因素復(fù)合法制備肝郁失眠的模型，進(jìn)一步觀察柴歡寧神顆粒對模型大鼠行為學(xué)，及對血漿促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）、血清皮質(zhì)醇（CORT）和下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）的影響，從而探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)6周齡SD大鼠雌雄各半，體重（200±20）g，購自中國食品藥品檢定研究院，合格證號(hào)SCXK（京）2014-0013。大鼠飼養(yǎng)于山西省中醫(yī)藥研究院中藥方劑研究所藥理動(dòng)物室，每籠5～6只，飼養(yǎng)溫度21～24℃，相對濕度18%～22%，12/12明暗交替，期間自由攝食、飲水，以普通飼料喂養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑

柴歡寧神顆粒（山西千匯藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20170801）；解郁安神顆粒（河南輔仁堂制藥有限公司，批號(hào)：20161202）；艾司唑侖（山東信誼制藥有限公司，批號(hào)：170407）；對氯苯丙氨酸（PCPA）（美國SIGMA-ALDRICH公司，批號(hào)：SHBG8045V）；CRH試劑盒（上海優(yōu)仟生物科技有限公司，批號(hào)：2017110）；ACTH試劑盒（上海優(yōu)仟生物科技有限公司，批號(hào)：20171101）；CORT試劑盒（上海優(yōu)仟生物科技有限公司，批號(hào)：20171020）。

PCPA的溶解：將PCPA充分研磨，加入生理鹽水，后滴加幾滴吐溫80助溶，繼續(xù)研磨，直至達(dá)到基本混溶，臨用時(shí)配成40 mg/mL混懸液。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

KDC-2046低速冷凍離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；Morris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；IXA-T25數(shù)顯高速離心機(jī)；Lenovo電腦；攝像頭；OFT-100開場實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組與給藥 實(shí)驗(yàn)當(dāng)日，依據(jù)OFT-100開場實(shí)驗(yàn)對大鼠行為學(xué)測試的結(jié)果，選取活動(dòng)次數(shù)相近的SD大鼠，依照體重隨機(jī)分為空白組，模型組，柴歡寧神顆粒高、中、低劑量組，解郁安神組，艾司唑侖組，每組10只。空白組與模型組每天灌胃給予等體積量的生理鹽水。柴歡寧神顆粒高、中、低劑量組（2.25、1.125、0.5625 g/kg），解郁安神組（1.25 g/kg），艾司唑侖組（0.5 mg/kg），以上各組均按大鼠1 mL/100 g配置成相同的水溶液，灌胃給藥。于刺激第7天后，造模的同時(shí)開始灌胃給藥，每日1次，連續(xù)14 d[4]。

1.4.2 模型制備 參照文獻(xiàn)[5-6]的方法，并加以改進(jìn)，進(jìn)行肝郁失眠模型的建立。適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，分組每籠5～6只飼養(yǎng)，空白組大鼠無任何外加刺激，其他組分別用醫(yī)用膠帶將其前肢束縛，使其活動(dòng)受限，并堅(jiān)持每天用尖端包裹海綿的止血鉗夾大鼠尾部（離近端1/3處），每只5 min，令其處于打斗狀態(tài)，以不破皮流血為度，連續(xù)21 d，并在造模第14天后，注射40 mg/mL的PCPA，連續(xù)2 d。根據(jù)肝郁失眠證候文獻(xiàn)建立本研究造模成功的標(biāo)準(zhǔn)[7]：①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重下降，飲食活動(dòng)量明顯減少。②體毛凌亂無華，精神萎靡，以圈縮為主。③睡眠節(jié)律紊亂，時(shí)長下降。④再次刺激時(shí)，反抗明顯下降，低落。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 大鼠一般狀態(tài)及總睡眠量 從實(shí)驗(yàn)開始，分別記錄實(shí)驗(yàn)第0、7、14、21天各組大鼠一般狀態(tài)的特征，包括精神狀態(tài)、活動(dòng)、毛發(fā)、飲食及排泄等指標(biāo)，并通過監(jiān)控?cái)z像系統(tǒng)記錄觀察各組大鼠的睡眠時(shí)間。

1.5.2 糖水實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)第0、6、13、20天分別禁水不禁食24 h，次日給予1%的蔗糖水，分別測試大鼠5 h糖水消耗量。

1.5.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)中水深約30 cm，水溫控制在24℃左右，將各組大鼠面壁從固定的位置放入水中（第二象限標(biāo)記處），儀器追蹤錄像系統(tǒng)自動(dòng)追蹤記錄大鼠潛伏期（大鼠完全爬上平臺(tái)并停留2 s），如果大鼠在2 min內(nèi)未找到平臺(tái)，將其引至平臺(tái)[8]。從造模第14天開始訓(xùn)練，1次/d，連續(xù)5 d，選取最后2 d的成績平均值為最終的定位航行成績。第6天撤去水中的平臺(tái)，記錄大鼠2 min中內(nèi)穿越原平臺(tái)的次數(shù)，分別作為評價(jià)大鼠成績的指標(biāo)[9]。

1.5.4 大鼠下丘腦CRH、血漿ACTH、血清CORT含量檢測 各行為學(xué)實(shí)驗(yàn)考察結(jié)束后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，一部分放入抗凝管中，一部分置于EP管中，后迅速斷頭，置于冰袋上取出下丘腦等腦組織，放置液氮罐中，最后存放于-80℃冰箱中備用；將血清、血漿靜置30 min后，4℃，3000 r/min離心（離心半徑為16 cm），取上清液，于-20℃存放，照試劑盒說明，分別進(jìn)行下丘腦CRH、血漿ACTH、血清CORT的檢測。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用One-way ANOVA單因素方差分析，兩兩組間比較，方差齊則采用LSD法，方差不齊采用Dunnett-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組間大鼠宏觀體表特征及睡眠量

實(shí)驗(yàn)前各組大鼠毛色光亮、活動(dòng)靈敏，精神狀態(tài)良好，睡眠正常；實(shí)驗(yàn)刺激第7天時(shí)，除空白組外，其余各組大鼠毛色明顯灰暗，行動(dòng)遲緩，大多弓背貼壁行走，叫聲變尖細(xì)，組內(nèi)打斗明顯，胡須下垂，大多表現(xiàn)為聚積奢睡，且大便開始不成形；14 d時(shí)，模型組大鼠毛發(fā)明顯凌亂，夾尾刺激反抗低落，大便溏薄稀，大多弓縮在角落，體重與空白組比較明顯下降（P < 0.05），與給藥組比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）（圖1）；21 d時(shí)，模型組大鼠精神明顯萎靡，全部弓縮在角落，體重與給藥組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）（圖1），且通過攝像記錄系統(tǒng)觀察到模型組大鼠睡眠節(jié)律紊亂，總睡眠量明顯減少，與空白組比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），而給藥組狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，毛色有光澤，睡眠時(shí)間較模型組明顯延長，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）（圖2）。實(shí)驗(yàn)過程中模型組大鼠死亡1只（可能注射PCPA導(dǎo)致）。

2.2 對肝郁失眠模型大鼠糖水偏愛度的影響

在大鼠接受7、14、21 d刺激后，與空白組比較，模型組大鼠糖水的偏愛度明顯下降（P < 0.05或P < 0.01）；實(shí)驗(yàn)第21天時(shí)，與模型組比較，各給藥組大鼠對糖水的偏愛度均明顯增加（P < 0.05），尤以艾司唑侖組明顯（P < 0.01）。見表1。

2.3 對肝郁失眠模型大鼠水迷宮定位航行及空間搜索的影響

與空白組比較，模型組大鼠定位航行時(shí)間明顯延長（P < 0.01），穿臺(tái)次數(shù)顯著減少（P < 0.05）；與模型組比較，各給藥組均較明顯縮短了其定位航行的時(shí)間，且增加了穿越平臺(tái)的次數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

2.4 對肝郁失眠模型大鼠下丘腦CRH、血漿ACTH、血清CORT的影響

與空白組比較，模型組下丘腦CRH、血漿ACTH、血清CORT的含量均明顯升高（P < 0.05或P < 0.01）。與模型組比較，各給藥組均對上述指標(biāo)有明顯改善（P < 0.05或P < 0.01）。見表3。

3 討論

隨著社會(huì)、生活等各方面壓力的增加，肝郁化火、肝郁氣滯已成為引起失眠的主要病機(jī)，大多表現(xiàn)為心煩怒燥、胸悶脹痛、舌紅、苔黃等[10]。柴歡寧神顆粒以柴胡、黃芩、大黃為君藥，配伍黨參等14味藥組方，能調(diào)陰陽、散肝郁、安心神，故為治療肝郁化火兼有痰熱的良方，并被臨床廣泛應(yīng)用所證明。本研究采用大鼠束縛+夾尾刺激+PCPA的多因素復(fù)合法制備大鼠肝郁失眠證候的動(dòng)物模型，并從實(shí)驗(yàn)藥效學(xué)的角度對其進(jìn)行了科學(xué)論證。

目前研究已表明[11-12]：長期慢性的束縛與夾尾刺激可使大鼠出現(xiàn)諸如胡須下垂、弓背貼壁行走、飲食減少、叫聲尖細(xì)等情緒低落的表征。這種表現(xiàn)基本符合情感不舒，郁怒藏抑于體內(nèi)，肝氣郁滯，而導(dǎo)致的“肝郁”證候。而中醫(yī)理論中“肝主藏血”，肝郁久而化熱，耗費(fèi)陰血而致血不養(yǎng)心，進(jìn)而神魂不寧、虛煩不眠。 因此本研究在“肝郁”的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步腹腔注射PCPA，耗竭大鼠體內(nèi)5-HT，大鼠出現(xiàn)明顯晝夜節(jié)律紊亂、躁動(dòng)不安、晝夜不寐的現(xiàn)象，從而科學(xué)模擬肝郁失眠的大鼠模型[13]。目前已有眾多的文獻(xiàn)表明，采用此種方法可以較好地建立肝郁失眠的大鼠模型[14-15]。在對大鼠施加3周的刺激進(jìn)行造模后，分析大鼠的體重、糖水消耗、水迷宮學(xué)習(xí)記憶能力等行為活動(dòng)為測試指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，與空白組對比，模型組各項(xiàng)指標(biāo)均顯著降低（P < 0.05），說明動(dòng)物模型的建立可信、可靠。臨床肝郁失眠患者情緒低落，晝夜不寐，次日精神萎靡，漸之身體消瘦，影響正常工作生活。這與模型動(dòng)物體重、糖水的喜好度、記憶力下降、睡眠節(jié)律紊亂、總睡眠量減少等特征表現(xiàn)相類似。因此對于柴歡寧神顆粒治療肝郁失眠大鼠模型的研究，可以較好地明確其療效和初步的作用機(jī)制，并且通過陽性藥物解郁安神顆粒和艾司唑侖的正向?qū)Ρ?，可以更加充分地表明其確切的作用效果，增加實(shí)驗(yàn)的嚴(yán)謹(jǐn)性、科學(xué)性。

現(xiàn)代研究表明，HPA軸系統(tǒng)與睡眠-覺醒規(guī)律之間存在著密切的聯(lián)系，HPA軸功能紊亂，睡眠-覺醒規(guī)律失常，最終導(dǎo)致失眠的發(fā)生[16-17]。HPA軸作為機(jī)體最重要的應(yīng)激反應(yīng)軸，其中對睡眠的調(diào)節(jié)起著舉足輕重的作用[18-19]。長期的刺激會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)中樞HPA軸的功能亢進(jìn)，激活腦部的杏仁核組織，增加CRH的分泌與釋放，起到增加覺醒和減少睡眠的作用[20-21]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠下丘腦CRH、血漿ACTH和血清CORT均明顯升高，推測肝郁證候造成的失眠與上述指標(biāo)紊亂有密切關(guān)系。這可能是HPA軸過度活化，持續(xù)促使刺激CRH和CORT分泌，使機(jī)體處于持續(xù)興奮狀態(tài)而導(dǎo)致失眠。

本研究從宏觀和微觀兩種角度對模型組與柴歡寧神顆粒組及解郁安神組、艾司唑侖組進(jìn)行了評價(jià)研究。在宏觀上，通過對大鼠毛色、體重、糖水消耗以及睡眠狀況的攝像系統(tǒng)觀察，研究結(jié)果提示，柴歡寧神顆粒可以顯著改善模型大鼠的行為學(xué)及睡眠的時(shí)間；在微觀上，對下丘腦CRH、血漿ACTH和血清CORT等HPA 軸相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行了全面的檢測，結(jié)果顯示，模型組上述指標(biāo)均顯著升高，同時(shí)給藥組可以逆轉(zhuǎn)上述指標(biāo)的升高，最終結(jié)果與模型組比較有顯著差異，提示柴歡寧神顆粒對模型大鼠的作用效果顯著。

綜上所述，柴歡寧神顆粒能夠明顯改善肝郁失眠模型大鼠行為學(xué)，并明顯增加大鼠體重，延長睡眠的時(shí)間，其作用機(jī)制與改善HPA軸功能激進(jìn)有一定的關(guān)系，但具體的作用過程還有待深入探討。

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