海蜇膠原蛋白肽的酶解制備工藝

李玉芬,鄭明星,葉秀云,林 娟

(福州大學(xué)福建省海洋酶工程實(shí)驗(yàn)室,福建福州 350116)

自由基的累積會(huì)造成機(jī)體嚴(yán)重?fù)p傷,與DNA損傷、心血管疾病、衰老和癌癥等疾病息息相關(guān)。早期對(duì)機(jī)體內(nèi)自由基的清除多采用一些合成類抗氧化劑,如丁羥甲苯和叔丁基羥基茴香醚等。但是由于這些合成類抗氧化劑對(duì)人體具有較強(qiáng)的毒副作用,我國(guó)政府已經(jīng)限制了該類添加劑的用量。因此尋找天然、高效且無(wú)毒副作用的新型抗氧化劑是近幾年的研究熱點(diǎn)。一些研究表明,膠原蛋白肽對(duì)自由基具有良好的清除效果,是一種天然的抗氧化劑。Li等[1]使用不同蛋白酶酶解豬皮膠原蛋白,得到氨基酸序列為QGAR的抗氧化肽,具有較高的DPPH自由基清除能力、金屬離子螯合能力和脂質(zhì)過(guò)氧化抑制能力。膠原蛋白肽擁有獨(dú)特的氨基酸組成,擁有多種生理功能活性[2-3],如降血壓、抗黑色素、免疫活性、促進(jìn)鈣吸收和抗關(guān)節(jié)炎等,具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前制備膠原蛋白肽最常用的方法是酶解法,其工藝主要包括單酶酶解法[4]和復(fù)合酶酶解法[5]。較為常用的提取用酶為胃蛋白酶[6]、中性蛋白酶[7]、堿性蛋白酶[8]和胰蛋白酶[9]等。研究發(fā)現(xiàn),單一酶作用范圍較小,只能使小部分的蛋白降解;而選用復(fù)合酶法進(jìn)行水解,可有效增大底物的水解程度,可以使得更多的活性氨基酸殘基暴露出來(lái)[10]。

本文以海蜇加工下腳料為原料提取膠原蛋白,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法對(duì)海蜇膠原蛋白肽的單酶水解工藝進(jìn)行優(yōu)化,并進(jìn)一步與復(fù)合酶水解工藝進(jìn)行比較,確定海蜇膠原蛋白肽的最優(yōu)制備工藝,為海蜇加工下腳料的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海蜇加工下腳料 已除鹽的南蟄海蜇皮,海蜇體呈傘蓋狀,通體呈半透明,福建億達(dá)食品有限公司;丙酮、碳酸氫二鈉、Tris、濃鹽酸(HCl)、福林試劑、谷胱甘肽、胃蛋白酶(1.58 U/mg)、胰蛋白酶(4.40 U/mg)、還原型谷胱甘肽 國(guó)藥集團(tuán);風(fēng)味蛋白酶(7.62 U/mg)、木瓜蛋白酶(13.73 U/mg)、中性蛋白酶(9.02 U/mg)、堿性蛋白酶(84.63 U/mg) Solarbio公司;2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(HHL)、馬尿酸、Tyrosinase Sigma公司;DPPH Aladdin公司。

T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;HWS24電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司;THZ-82恒溫振蕩器 國(guó)華企業(yè);BC/BD-320HCN臥式冷藏冷凍轉(zhuǎn)換柜 海爾集團(tuán);TP-114分析天平、UB-7pH計(jì) DENVER INSTRVMENT;U-2910雙光束分光光度計(jì)、CF16R-XI高速冷凍離心機(jī) HITACHI;移液槍 Eppendorf;GL-3250C漩渦混合器 Qilinbeier;BL25H11攪拌機(jī) 廣東美的生活電器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海蜇膠原蛋白肽的提取 將海蜇加工下腳料用清水沖洗,將除鹽的海蜇用攪拌機(jī)攪碎20 min,過(guò)濾瀝干;添加丙酮溶液沒(méi)過(guò)海蜇,靜置1 d,蒸餾水清洗至無(wú)異味,過(guò)濾瀝干;置于0.1 mol/L磷酸氫二鈉溶液中浸泡三次,每3 h更換一次溶液,蒸餾水清洗至中性,過(guò)濾瀝干,4 ℃冰箱存放備用。

取一定質(zhì)量的海蜇皮勻漿,加入一定體積相應(yīng)pH的緩沖液至一定料液比,添加一定比例的蛋白酶,置于一定溫度酶解一定時(shí)間;待反應(yīng)結(jié)束后,將酶解液置于沸水浴中加熱10 min使蛋白酶失活,13000 r/min離心10 min,取上清多肽液進(jìn)行水解度(DH)和還原力(RP)測(cè)定。

1.2.2 緩沖液體系 Phosphate緩沖體系:pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)的緩沖液由0.1 mol/L的Na2HPO4·12H2O和0.1 mol/L NaH2PO4·2H2O配制而成。

Tris-HCl緩沖體系:pH(8.0、8.5、9.0)的緩沖液由0.1 mol/L的Tris和0.1 mol/L的HCl配制而成。

1.2.3 蛋白酶的選擇 以DH和RP為指標(biāo),在酶添加量100 U/g、料液比1∶1 (g/mL)和酶解時(shí)間4 h條件下,比較六種不同蛋白酶在其最適酶解條件(見(jiàn)表1)下對(duì)海蜇蛋白的酶解效果,并選用最適的兩種蛋白酶用于下一步實(shí)驗(yàn)研究。

表1 不同蛋白酶的最適酶解條件Table 1 Optimal enzymatic conditions of different protease

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 溫度對(duì)酶解效果的影響 在酶添加量1.0%、酶解時(shí)間2 h、料液比1∶2 (g/mL)和pH7.0條件下,考察了不同溫度(30、35、40、45、50、55 ℃)對(duì)胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶酶解效果的影響,測(cè)定酶解液的DH和RP。

1.2.4.2 pH對(duì)酶解效果的影響 在酶添加量1.0%、酶解時(shí)間2 h、料液比1∶2 (g/mL)和溫度45 ℃條件下,采用兩種不同緩沖體系(Phosphate緩沖體系和Tris-HCl緩沖體系)考察了不同pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)對(duì)胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶酶解效果的影響,測(cè)定酶解液的DH和RP。

1.2.4.3 料液比對(duì)酶解效果的影響 在酶添加量1.0%、酶解時(shí)間2 h、溫度45 ℃和pH8.0(pH7.0)條件下,比較不同料液比[3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5 (g/mL)]下胰蛋白酶(風(fēng)味蛋白酶)的酶解效果,測(cè)定酶解液的DH和RP。

1.2.4.4 酶添加量對(duì)酶解效果的影響 在料液比1∶1 (g/mL)、酶解時(shí)間2 h、溫度45 ℃和pH8.0(pH7.0)條件下,比較了不同酶添加量(1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%)對(duì)胰蛋白酶(風(fēng)味蛋白酶)酶解效果的影響,測(cè)定酶解液的DH和RP。

1.2.4.5 酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響 在酶添加量3.0%(酶添加量4.0%)、料液比1∶1 (g/mL)、溫度45 ℃和pH8.0(pH7.0)條件下,測(cè)定不同酶解時(shí)間(2、3、4、5、6、7 h)下胰蛋白酶(風(fēng)味蛋白酶)酶解液的DH和RP。

1.2.5 酶解膠原蛋白的響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以DH和RP為響應(yīng)值,以蛋白酶的酶解溫度、pH和料液比作為自變量進(jìn)行響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn),在Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì),確定海蜇蛋白單酶最優(yōu)酶解工藝。胰蛋白酶因素水平編碼表見(jiàn)表2,風(fēng)味蛋白酶因素水平編碼表見(jiàn)表3。

表2 胰蛋白酶響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平編碼表Table 2 Factors and levels of trypsase response surface experimental design

表3 風(fēng)味蛋白酶響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平編碼表Table 3 Factors and levels of flavourzyme response surface experimental design

1.2.6 復(fù)合酶酶解工藝研究

1.2.6.1 混合酶解 將兩種蛋白酶A、B混合,分別在蛋白酶A和蛋白酶B的最適酶解條件下對(duì)膠原蛋白進(jìn)行酶解,測(cè)定DH和RP,比較混合酶對(duì)膠原蛋白酶解效果的影響。

1.2.6.2 先后酶解 在蛋白酶A(蛋白酶B)最適的酶解條件下進(jìn)行酶解,繼而添加蛋白酶B(蛋白酶A),在蛋白酶B(蛋白酶A)最適的酶解條件下酶解,測(cè)定DH和RP比較先后酶解對(duì)膠原蛋白酶解效果的影響。

1.2.7 DH的測(cè)定 采用茚三酮法[11],按下式(1)計(jì)算DH。

式(1)

式中:DH:蛋白水解度,%;h1:每克原料水解液中游離氨基酸的含量,μmol/g;h0:每克原料溶液中游離氨基酸的含量,μmol/g;h2:對(duì)照溶液中游離氨基酸的含量,μmol/g。

1.2.8 RP的測(cè)定 參考Liu等[12]的方法,略有修改。在15 mL試管中,依次加入1 mL不同濃度的多肽樣品、2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH6.6)和2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液;置于50 ℃水浴反應(yīng)20 min,加入1 mL 10%的三氯乙酸終止反應(yīng);取上述溶液2.5 mL,加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液,于700 nm處測(cè)定其吸光值。吸光值越大表明樣品的RP越高。以蒸餾水作為空白對(duì)照,同時(shí)以谷胱甘肽(GSH)作為陽(yáng)性對(duì)照。其IC50值定義為相對(duì)空白組吸光值為0.5時(shí)，有效多肽濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的選擇

由圖1可知,不同蛋白酶酶解液的DH和RP存在一定的差異;堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶酶解制備的水解液DH最高,分別為36.33%和43.67%,其次為胰蛋白酶(21.92%)和中性蛋白酶(19.17%),胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解液的DH最低。胰蛋白酶酶解液的RP(0.246)最大,風(fēng)味蛋白酶(0.122)次之,其余蛋白酶酶解液的RP均較低。可以看出,胰蛋白酶酶解液雖然DH不高,但是其RP是所有蛋白酶酶解液中最高的;而堿性蛋白酶酶解液恰恰相反,擁有較高的DH,其RP卻只有0.086;這可能是因?yàn)榕c堿性蛋白酶相比,胰蛋白酶的酶切位點(diǎn)暴露出了更多的活性位點(diǎn),從而使得水解液擁有更高的RP。綜合比較了六種不用蛋白酶的酶解效果,在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中選取了具有最高RP的胰蛋白酶和最高DH的風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行下一步單酶酶解工藝優(yōu)化。

圖1 不同蛋白酶的酶解效果比較Fig.1 Effect of different protease treatment on the hydrolysis of protein

2.2 胰蛋白酶酶解制備膠原蛋白肽的工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) 胰蛋白酶酶解制備膠原蛋白肽的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2～圖6所示,溫度對(duì)胰蛋白酶酶解液的DH和RP的影響趨勢(shì)類似;隨著反應(yīng)溫度的升高,酶解液的DH和RP也隨之升高,在45 ℃時(shí)達(dá)到最大值(圖2);在pH8.0時(shí)胰蛋白酶酶解液DH和RP均達(dá)到最大,偏離該pH,酶解液的DH和RP都呈小幅度的降低(圖3);在一定范圍內(nèi),隨著液料比的減小,胰蛋白酶酶解液的DH和RP呈先增大后減小的趨勢(shì),在液料比為1∶1 (g/mL)時(shí),DH和RP最大(圖4);胰蛋白酶酶解液DH和RP都隨酶添加量的增加而增大,在酶添加量大于3.0%時(shí),DH的增大趨勢(shì)趨于平緩,RP則保持在同一水平(圖5);在一定范圍內(nèi),胰蛋白酶酶解液DH和RP隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增大,在4 h之后,DH變化趨于平穩(wěn),而RP反而有所下降(圖6)。最終確定最佳酶解條件為:酶解溫度為45 ℃,pH為8.0,料液比為1∶1 (g/mL),酶添加量為3.0%,酶解時(shí)間為4 h。當(dāng)酶解時(shí)間大于4 h,加酶量超過(guò)3.0%,膠原蛋白的DH和RP趨于穩(wěn)定,由于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示酶解溫度、pH、料液比對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響比時(shí)間和酶添加量對(duì)實(shí)驗(yàn)影響明顯。因此在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步采用響應(yīng)曲面法研究酶解溫度、pH、料液比對(duì)DH和RP的影響。

圖2 不同溫度酶解效果的影響Fig.2 Effect of different temperatures on the hydrolysis of protein

圖3 不同pH對(duì)酶解效果的影響Fig.3 Effect of different pH values on hydrolysis of protein

圖4 不同料液比對(duì)酶解效果的影響Fig.4 Effect of different ratios of material to solvent on hydrolysis of protein

圖5 不同酶添加量對(duì)酶解效果的影響Fig.5 Effect of different proportion of enzymes on hydrolysis of protein

圖6 不同酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響Fig.6 Effect of different time on hydrolysis of protein

2.2.2 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表4所示。

利用Design-Expert 8.0軟件對(duì)表4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析,得到DH(Y1)和RP(Y2)的回歸方程分別為:

表4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Table 4 Design matrix and the correspondingresults of RSM experiments

Y1=28.50-0.60X1+1.01X2-0.084X3-0.17X1X2+0.19X1X3+0.34X2X3-2.00X12-1.18X22-0.44X32

Y2=24.26-0.42X1+1.18X2-0.12X3-0.32X1X2+1.00X1X3+0.84X2X3-1.97X12-2.29X22-0.73X32

進(jìn)一步對(duì)上述模型及回歸方程進(jìn)行方差分析,結(jié)果如表5所示。兩種模型的p<0.01,失擬項(xiàng)均大于0.05,表明模型效應(yīng)顯著且具有較好的擬合度。對(duì)于DH,X1、X2、X2X3、X12、X22和X32均有極顯著的影響(p<0.01),X3和交互項(xiàng)X1X2、X1X3在所取水平范圍內(nèi)對(duì)DH影響不顯著(p>0.05);對(duì)于RP,X2、X1X3、X2X3、X12、X22和X32均有極其顯著的影響(p<0.01),而X1有顯著性差異(p<0.05),X3和交互項(xiàng)X1X2在所取水平范圍內(nèi)對(duì)RP影響不顯著(p>0.05);由各項(xiàng)的F值可知,各因素對(duì)DH的影響程度次序與對(duì)RP的影響程度次序一致,依次為X2(pH)>X1(溫度)>X3(料液比)。

表5 方差分析表Table 5 Analysis of variance

2.2.3 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化 由方差分析結(jié)果各項(xiàng)的F值可知,各因素對(duì)DH的影響程度次序與對(duì)RP的影響程度次序一致,因此主要對(duì)RP的三維響應(yīng)面圖和等高線圖進(jìn)行分析。以胰蛋白酶酶解液RP為響應(yīng)值的三維響應(yīng)面圖及等高線圖如圖7所示。由圖7可知,在一定范圍內(nèi),隨著各因素值的增加,胰蛋白酶酶解液RP均呈不同程度的先上升后下降的趨勢(shì)。結(jié)合等高線圖可知,pH對(duì)酶解液RP的影響較溫度顯著(圖7a);溫度對(duì)酶解液RP的影響較料液比顯著(圖7b);pH對(duì)酶解液RP的影響較料液比顯著(圖7c)。

圖7 胰蛋白酶酶解液RP的響應(yīng)面及等高線圖Fig.7 Response surface and contourlines of reducing power of enzymatic hydmlysatcs注:a：溫度和pH對(duì)RP的影響;b：溫度和料液比對(duì)RP的影響;c：pH和料液比對(duì)RP的影響。

利用已建立的數(shù)學(xué)模型得出胰蛋白酶的最優(yōu)酶解條件為:溫度43.50 ℃、pH8.33和料液比0.50 g/mL,此時(shí)酶解液DH為28.76%,RP為0.24。根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件,將最佳參數(shù)調(diào)整為:溫度44 ℃,pH8.5,料液比0.50 g/mL,并在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得到DH為(28.26%±0.47%),RP為(0.247±0.002),與理論值有較好的擬合性。

2.3 風(fēng)味蛋白酶酶解制備膠原蛋白肽的工藝優(yōu)化

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 風(fēng)味蛋白酶酶解制備膠原蛋白肽的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8～圖12所示,在45 ℃時(shí),風(fēng)味蛋白酶酶解液的DH和RP最大,分別為24.96%和0.054(圖8);在pH7.0時(shí),風(fēng)味蛋白酶酶解液的DH(25.29%)和RP(0.054)最大(圖9);在1∶1 (g/mL)料液比時(shí),擁有最高的DH(25.84%)和RP(0.061)(圖10),風(fēng)味蛋白酶酶解液DH和RP隨酶添加量的增加而增大,在酶添加量4.0%之后,酶添加量的增加對(duì)DH和RP的影響不大(圖11);風(fēng)味蛋白酶酶解液DH在4 h之后時(shí)趨于平穩(wěn),RP隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)先升高后降低,在4 h時(shí)達(dá)到最大0.118(圖12)。最終確定風(fēng)胃蛋白酶最佳酶解條件為:酶解溫度為45 ℃,pH為7.0,料液比為1∶1 (g/mL),酶添加量為4.0%,酶解時(shí)間為4 h,當(dāng)酶解時(shí)間大于4 h,加酶量超過(guò)4.0%,膠原蛋白的DH和RP趨于穩(wěn)定,由于單因素實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化結(jié)果顯示,酶解溫度、pH、料液比對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較酶解時(shí)間、酶添加量影響大,因此在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步采用響應(yīng)曲面法研究酶解溫度、pH、料液比對(duì)DH和RP的影響。

圖8 不同溫度對(duì)酶解效果的影響Fig.8 Effect of different temperatures on the hydrolysis of protein

圖9 不同pH對(duì)酶解效果的影響Fig.9 Effect of different pH on hydrolysis of protein

圖10 不同料液比對(duì)酶解效果的影響Fig.10 Effect of different ratios of material to solvent on hydrolysis of protein

圖11 不同酶添加量對(duì)酶解效果的影響Fig.11 Effect of different proportion of enzymes on hydrolysis of protein

圖12 不同酶解時(shí)間對(duì)單酶酶解效果的影響Fig.12 Effect of different time on hydrolysis of protein

2.3.2 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表6所示。

利用Design-Expert 8.0軟件對(duì)表6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析,得到DH(Y3)和RP(Y4)的回歸方程分別為:

表6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Table 6 Design matrix and the corresponding results of RSM experiments

Y3=47.96-1.16X1+0.98X2+1.78X3+0.045X1X2+0.37X1X3+0.015X2X3-5.16X12-0.94X22-1.65X32

Y4=13.18-0.12X1-0.32X2+0.20X3+0.28X1X2+0.27X1X3-0.13X2X3-0.48X12-0.83X22-0.38X32

對(duì)上述模型及回歸方程進(jìn)行的方差分析如表7所示。兩種模型的p<0.01,失擬項(xiàng)均大于0.05,表明模型效應(yīng)顯著且具有較好的擬合度。對(duì)于DH,X1、X2、X3、X12和X32均有極其顯著的影響(p<0.01),而X22有顯著性差異(p<0.05),交互項(xiàng)X1X2、X1X3、X2X3在所取水平范圍內(nèi)均對(duì)DH影響不顯著(p>0.05);由各項(xiàng)的F值可知,各因素對(duì)DH的影響程度次序依次為X3(料液比)>X1(溫度)>X2(pH)。對(duì)于RP,X2、X12、X22和X32均有極其顯著的影響(p<0.01),而X3、X1X2、X1X3有顯著性差異(p<0.05),X1和交互項(xiàng)X2X3在所取水平范圍內(nèi)對(duì)RP影響不顯著(p>0.05);由各項(xiàng)的F值可知,各因素對(duì)RP的影響程度次序與對(duì)DH的影響程度次序有差異,依次為X2(pH)>X3(料液比)>X1(溫度)。在下文主要對(duì)RP的三維響應(yīng)面圖和等高線圖進(jìn)行進(jìn)一步分析。

表7 方差分析表Table 7 Analysis of variance

2.3.3 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化 以風(fēng)味蛋白酶酶解液RP為響應(yīng)值的三維響應(yīng)面圖及等高線圖如圖14所示。在該實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi),隨著各因素值的增加,風(fēng)味蛋白酶酶解液的RP先增大后減小。結(jié)合等高線圖可知,pH對(duì)酶解液RP的影響較溫度顯著(圖14a);溫度和料液比對(duì)酶解液RP影響的顯著性差異不大(圖14b);pH對(duì)酶解液RP的影響較料液比顯著(圖14c)。

圖14 風(fēng)味蛋白酶酶解液RP的響應(yīng)面及等高線圖Fig.14 Response surface and contourlines of reducing power of enzymatic hydmlysatcs

構(gòu)建數(shù)學(xué)模型分析,得出風(fēng)味蛋白酶的最優(yōu)酶解條件為:溫度44.10 ℃、pH7.39和料液比0.56 g/mL,在該條件下獲得的酶解液DH預(yù)測(cè)值為48.32%,RP預(yù)測(cè)值為0.13。根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件,將最佳參數(shù)調(diào)整為:溫度44 ℃、pH7.5、料液比0.56 g/mL,并在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得到酶解液的DH為(48.26%±0.47%)、RP為(0.14±0.001),與理論值有較好的擬合性。

2.4 復(fù)合酶酶解工藝研究

在上述單酶工藝優(yōu)化的基礎(chǔ)上,比較兩種蛋白酶不同組合方式(表8)的酶解效果,確定海蜇膠原蛋白的最優(yōu)復(fù)合酶解工藝。

由表8可知,B+A的酶解類型所得的DH(71.56%±0.11%)和RP(0.341±0.001)比其他酶解類型所得的DH和RP均高,所以復(fù)合酶的最佳組合方式確定為:先于溫度44 ℃、pH7.5、料液比0.56 g/mL和風(fēng)味蛋白酶添加量4.0%條件下酶解4 h,再于溫度44 ℃、pH8.5、料液比0.50 g/mL和胰蛋白酶添加量3.0%條件下繼續(xù)酶解4 h,所獲得水解液的DH和RP分別為:(71.56%±0.0076%)和(0.341±0.0101)。

表8 不同蛋白酶組合方式對(duì)海蜇蛋白酶解效果的影響Table 8 Effect of different combinations of proteases on hydrolysis of protein from jellyfish

3 結(jié)論

以DH和RP為指標(biāo),比較了6種常用蛋白酶對(duì)海蜇蛋白的酶解效果,確定胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶為最佳水解酶。采用單因素和響應(yīng)面BBD分別對(duì)這兩種蛋白酶的酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化,在實(shí)際實(shí)驗(yàn)條件下確定胰蛋白酶的最優(yōu)酶解條件為:溫度44 ℃、pH8.5、料液比0.50 g/mL、酶添加量3.0%和酶解時(shí)間4 h;風(fēng)味蛋白酶的最優(yōu)酶解條件為:溫度44 ℃、pH7.5、料液比0.56 g/mL、酶添加量4.0%和酶解時(shí)間4 h;進(jìn)一步選取上述兩種蛋白酶進(jìn)行復(fù)合酶解實(shí)驗(yàn),確定復(fù)合酶的最佳組合方式為:風(fēng)味蛋白酶和胰蛋白酶先后酶解,所獲得水解液的DH和RP分別為(71.56%±0.0076%)和(0.341±0.0101)。

[1]Li B,Chen F,Wang X,et al. Isolation and identification of antioxidative peptides from porcine collagen hydrolysate by consecutive chromatography and electrospray ionization-mass spectrometry[J]. Food Chemistry,2007,102(4):1135-1143.

[2]馬華威. 雙酶分步酶解制備鮟鱇魚(yú)皮膠原蛋白肽及生物活性的研究[D]. 浙江:浙江海洋學(xué)院,2014.

[3]丁進(jìn)鋒,蘇秀榕,李妍妍,等. 海蜇膠原蛋白肽的降血脂及抗氧化作用的研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2012,24(3):362-365.

[4]劉尊英,李八方,曾名勇,等. 鱈魚(yú)皮膠原蛋白胰蛋白酶控制水解動(dòng)力學(xué)模型[J]. 食品科技,2008,33(2):75-77.

[5]朱俊穎,王耀松,趙黎明,等. 復(fù)合酶法制備高純度魚(yú)基質(zhì)膠原蛋白肽[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào),2015,15(12):47-54.

[6]申鋒,楊莉莉,熊善柏,等. 胃蛋白酶水解草魚(yú)魚(yú)鱗制備膠原肽的工藝優(yōu)化[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,29(3):387-391.

[7]陳露. 鯉魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白肽的制備工藝和分析[D]. 內(nèi)蒙古:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[8]閔瑞. 微波輔助酶解提取硫酸軟骨素下腳料中膠原蛋白肽的工藝研究[J]. 糧食與食品工業(yè),2016,23(3):51-54.

[9]東忠方,閆鳴艷. 安康魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白多肽酶法制備工藝研究[J]. 食品工業(yè),2013,34(3):87-90.

[10]朱靜靜,潘道東,孫楊贏,等. 酶解法制備膠原蛋白肽及其抗氧化活性的研究[J]. 寧波大學(xué)學(xué)報(bào):理工版,2016,29(4):26-32.

[11]蔣婧. 蛋白質(zhì)水解度測(cè)定及其標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制研究[J]. 廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào),2012,11(1):4-6.

[12]Liu J,Jin Y,Lin S,et al. Purification and identification of novel antioxidant peptides from egg white protein and their antioxidant activities[J]. Food Chemistry,2015,175:258-266.