血清對(duì)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和水通道蛋白-4表達(dá)的影響

賈 梅，師忠芳，王玉嬌，閆 旭，徐立新，董麗萍，李佳欣，陳 燁，袁 芳

首都醫(yī)科大學(xué)北京市神經(jīng)外科研究所病理生理室，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院，北京市100050

腦水腫是腦外傷后嚴(yán)重的并發(fā)癥，常常危及生命[1]。星形膠質(zhì)細(xì)胞上的水通道蛋白-4(aquaporin-4,AQP-4)是腦內(nèi)最豐富的水通道蛋白，主要維持細(xì)胞內(nèi)外水平衡，在外傷性腦水腫的病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2-4]。現(xiàn)有研究顯示，在不同類(lèi)型的腦外傷模型中，AQP-4表達(dá)增高或降低[5-9]。不同原因引起的腦外傷均導(dǎo)致血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)功能障礙[1]，漏出到腦組織間隙的血清蛋白是否對(duì)AQP-4表達(dá)有影響目前并不清楚。整體實(shí)驗(yàn)存在多種組織細(xì)胞之間的相互作用，無(wú)法觀察單一因素引起的變化，故本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)基中添加血清的方法模擬BBB功能障礙，離體水平觀察血清對(duì)培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)及AQP-4表達(dá)的直接影響，旨在明確BBB破壞對(duì)AQP-4表達(dá)的影響，為更好地理解AQP-4在外傷性腦水腫中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

出生24 h內(nèi)的雌性Wistar大鼠，由軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK-(軍)2012-0004。實(shí)驗(yàn)過(guò)程按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用“3R”原則給予人道關(guān)懷，所有實(shí)驗(yàn)操作通過(guò)北京市神經(jīng)外科研究所倫理委員會(huì)審查。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Light Cycler480實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)儀：瑞士ROCHE公司。Observer A1倒置熒光顯微鏡：德國(guó)ZEISS公司。5415R高速離心機(jī)：德國(guó)EPPENDORF公司。CB150三氣細(xì)胞培養(yǎng)箱：德國(guó)BINDER公司。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑

DMEM培養(yǎng)基(11966025)、NB培養(yǎng)基(A2477501)、丙酮酸鹽溶液(11360070)、Glutamax溶液(35050061)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(10099-141)：美國(guó)THERMO FISHER公司。牛胰島素(I5500)、肝素-表皮生長(zhǎng)因子(E4643)、腐胺(P5780)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(T1147)、N-乙酰-L-半胱氨酸(A8199)、亞硒酸鹽(S5261)、多聚賴(lài)氨酸(P1524)：美國(guó)SIGMA公司。血清白蛋白(HY-D0842)、孕酮(HY-N0437)：美國(guó)MEDCHEM EXPRESS公司。

兔抗大鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體(Z0334)：丹麥DAKO公司。小鼠抗大鼠AQP-4抗體(ab9512)：美國(guó)ABCAM公司。兔抗大鼠代謝型谷氨酸受體5(metabotropic glutamate receptor 5,mGluR5)抗體(ab76316)：美國(guó)ABCAM公司。Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔二抗(A1108)、Alexa Fluor 546標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(A1103)、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)：美國(guó)THERMO FISHER公司?？篃晒獯銣绶馄瑒?ZLI-9556)：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司?？俁NA提取試劑盒(LS1040)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(A3500)：美國(guó)PROMEGA公司。SYBR GreenⅠ核酸染色試劑盒(04887352001)：瑞士ROCHE公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞原代培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)參考本課題組已發(fā)表的方法[10]并進(jìn)行改良。出生24 h內(nèi)雌性Wistar大鼠乙醚麻醉后取大腦皮層，剝除腦膜后用解剖刀切碎成1 mm3組織塊，加入DMEM培養(yǎng)基并制成細(xì)胞懸液。200目濾網(wǎng)過(guò)濾后，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞密度，按照1.2×105/cm2接種到已包被多聚賴(lài)氨酸的培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中，15 min后將上清取出，添加新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基或者有血清培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

無(wú)血清培養(yǎng)基(serum free medium,SFM)配方參考文獻(xiàn)[11]并進(jìn)行改良，主要成分為DMEM培養(yǎng)基和NB培養(yǎng)基，添加丙酮酸鹽、Glutamax、牛胰島素、肝素-表皮生長(zhǎng)因子、腐胺、轉(zhuǎn)鐵蛋白、N-乙酰-L-半胱氨酸、亞硒酸鹽、血清白蛋白、孕酮。有血清培養(yǎng)基分別為DMEM培養(yǎng)基加10%FBS(DMEM+FBS)、上述無(wú)血清培養(yǎng)基加10%FBS(SFM+FBS)。

1.3.2 倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

細(xì)胞分別在SFM、DMEM+FBS及SFM+FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，每天在倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.3.3 細(xì)胞免疫熒光染色

培養(yǎng)細(xì)胞免疫熒光染色方法參考文獻(xiàn)[10]。原代培養(yǎng)7 d后，丙酮固定，先后進(jìn)行山羊血清避光封閉20 min、一抗4℃過(guò)夜孵育、二抗室溫孵育2 h、DAPI復(fù)染后，抗淬滅的封片劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照?？贵w濃度如下：GFAP(1∶50)、AQP-4(1∶200)、mGluR5(1∶200)一抗，山羊抗兔/小鼠二抗(1∶200)。陰性對(duì)照使用PBS代替一抗。

1.3.4 圖像分析

應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)細(xì)胞免疫熒光結(jié)果進(jìn)行圖像分析[12]。每組取3個(gè)樣本，每個(gè)樣本在鏡下(200×)隨機(jī)選取3個(gè)非重疊視野，計(jì)算每個(gè)視野的積分光密度值(integrated optical density,IOD)。以9個(gè)視野中免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞的平均IOD代表目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。

1.3.5 RT-qPCR

逆轉(zhuǎn)錄RT-qPCR方法參考文獻(xiàn)[10]。細(xì)胞原代培養(yǎng)7 d后，提取總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。GFAP、AQP-4及mGluR5引物由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成。引物序列見(jiàn)表1。

表1 上下游引物序列

PCR 反 應(yīng)體系構(gòu)成(20 μl)：SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，無(wú)核酸酶的水 7 μl，模板 cDNA 1 μl，上、下游引物各1 μl。PCR反應(yīng)共40個(gè)循環(huán)，條件如下：95℃預(yù)熱10 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s。使用LightCycler480實(shí)時(shí)PCR儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，LightCycler480 1.5.0軟件分析熒光信號(hào)，以 β-actin 為內(nèi)參，GFAP/β-actin，AQP-4/β-actin 及mGluR5/β-actin分別表示星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP、AQP-4及mGluR5的mRNA表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示。星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP、AQP-4及mGluR5在蛋白水平和mRNA水平的比較均采用單因素方差分析及最小顯著性差異法(least-significant difference,LSD)。顯著性水平α=0.05。每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)

GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物[13]，GFAP細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果表明，SFM、DMEM+FBS及SFM+FBS中的細(xì)胞免疫熒光染色均為陽(yáng)性，證實(shí)為星形膠質(zhì)細(xì)胞。星形膠質(zhì)細(xì)胞在SFM中細(xì)胞折光性強(qiáng)，細(xì)胞核和胞體較小，細(xì)胞突起細(xì)長(zhǎng)；在DMEM+FBS及SFM+FBS中，細(xì)胞折光性弱，呈多角扁平形，細(xì)胞突起短小，細(xì)胞核和胞體較大。見(jiàn)圖1。

2.2 GFAP、AQP-4蛋白表達(dá)

不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP和AQP-4蛋白水平有非常高度顯著性差異(P＜0.001)，mGluR5水平無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。DMEM+FBS和SFM+FBS中GFAP和AQP-4蛋白水平均顯著低于SFM(P＜0.001)。見(jiàn)圖2、表2。

2.3 GFAP、AQP-4 mRNA表達(dá)

不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP和AQP-4 mRNA水平有非常高度顯著性差異(P＜0.001)，mGluR5 mRNA水平無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。DMEM+FBS和SFM+FBS中GFAP和AQP-4的mRNA水平均顯著低于SFM(P＜0.001)。見(jiàn)表3。

圖1 各組GFAP免疫熒光染色(200×，bar=50 μm)

圖2 各組GFAP、AQP-4及mGluR5免疫熒光染色(200×，bar=50 μm)

表2 不同血清培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP、AQP-4和mGluR5蛋白水平比較

表3 不同血清培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP、AQP-4和mGluR5 mRNA水平比較

3 討論

腦外傷后首先出現(xiàn)BBB破壞所致的血管源性腦水腫，然后出現(xiàn)繼發(fā)性的細(xì)胞毒性腦水腫[14]。在BBB功能障礙的病理情況下，滲出到血管外的血清是否對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP-4表達(dá)有影響，目前并不清楚。本研究利用培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)、GFAP及AQP-4表達(dá)水平在無(wú)血清及有血清培養(yǎng)基中均不一致，同時(shí)設(shè)立的對(duì)照實(shí)驗(yàn)顯示，無(wú)血清培養(yǎng)基添加FBS引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化、GFAP及AQP-4表達(dá)變化與有血清培養(yǎng)基相似，即星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)由胞體小突起長(zhǎng)變?yōu)榘w大突起短，同時(shí)GFAP及AQP-4表達(dá)降低，說(shuō)明FBS直接改變星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)、降低GFAP及AQP-4的表達(dá)。許多研究表明，在血管源性腦水腫中，星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP-4表達(dá)減少促進(jìn)腦水腫的形成[14-15]；本研究結(jié)果提示，腦外傷后BBB功能障礙引起的AQP-4表達(dá)降低，促進(jìn)外傷性腦水腫的進(jìn)展。

尸檢及動(dòng)物模型中均發(fā)現(xiàn)，腦外傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)水腫、肥大等形態(tài)改變[16]。我們的離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)基中添加血清后星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞體及細(xì)胞核均變大，細(xì)胞突起變短，這與腦外傷后腦組織標(biāo)本中所見(jiàn)的星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)相似。Foo等[17]及Zhang等[18]也報(bào)道，血清引起培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)同樣的變化。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞主要的中間絲蛋白[19]，在維持星形膠質(zhì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮重要作用[20]。本研究還發(fā)現(xiàn)血清降低星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP的表達(dá)。本研究結(jié)果提示，在BBB破壞的病理情況下，血清蛋白是引起星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)及功能改變的因素之一。

AQP-4在外傷性腦水腫中發(fā)揮重要作用。Kiening等[14]報(bào)道，在外傷性腦水腫模型中檢測(cè)到AQP-4表達(dá)減少。Papadopoulos等[15]發(fā)現(xiàn)AQP-4基因敲除促進(jìn)血管源性腦水腫模型的進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加血清引起AQP-4表達(dá)降低。前期實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞劃痕損傷降低培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的AQP-4表達(dá)[21]，因此我們的離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，腦外傷的直接損傷以及BBB破壞導(dǎo)致的血清蛋白漏出均直接導(dǎo)致AQP-4表達(dá)降低。在外傷性血管源性腦水腫中，組織內(nèi)多余的水來(lái)自于BBB通透性增加，而非AQP-4介導(dǎo)的水轉(zhuǎn)運(yùn)，因此，血管源性腦水腫中AQP-4的減少導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)水平衡能力下降，無(wú)法將組織內(nèi)多余的水排出，加重腦水腫[15]。但是也有研究發(fā)現(xiàn)，在外傷性腦水腫模型中AQP-4表達(dá)增加[22-23]?，F(xiàn)有實(shí)驗(yàn)中觀察到的AQP-4表達(dá)變化不同，一方面可能與腦外傷模型的種類(lèi)、損傷嚴(yán)重程度和損傷時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)，另一方面可能與腦外傷后腦組織分泌多種炎癥因子和凝血因子[24-25]、機(jī)體微環(huán)境發(fā)生復(fù)雜變化有關(guān)[26]。本研究在離體水平模擬研究BBB破壞后血清對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP-4表達(dá)的影響，但是血清成分復(fù)雜，具體何種成分降低AQP-4表達(dá)仍有待進(jìn)一步研究。

mGluR5是腦內(nèi)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的代謝型受體中的一種亞型，在星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元上均有表達(dá)[27]。蔡英等[9]在液壓打擊顱腦損傷模型中發(fā)現(xiàn)，腦外傷引起mGluR5表達(dá)減少。前期研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞上mGluR5參與谷氨酸引起AQP-4表達(dá)變化的調(diào)節(jié)[28]，但是本研究未觀察到血清對(duì)mGluR5表達(dá)的影響。目前mGluR5與AQP-4表達(dá)的關(guān)系及其在外傷性腦水腫中的作用研究很少，還有待深入探討。

綜上所述，本研究在無(wú)血清培養(yǎng)基中添加血清，部分模擬了腦外傷后BBB功能障礙的情況，發(fā)現(xiàn)血清直接改變星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和GFAP表達(dá)，并引起AQP-4的表達(dá)降低，因此可能促進(jìn)血管源性腦水腫的發(fā)展，為更好地理解AQP-4在外傷性腦水腫中的作用提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。最新研究發(fā)現(xiàn)促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)可以通過(guò)恢復(fù)BBB結(jié)構(gòu)和功能的完整性、阻止AQP-4表達(dá)降低而發(fā)揮治療外傷性腦水腫的作用[29]。因此，以BBB及AQP-4為治療靶點(diǎn)的研究將為外傷性腦水腫的臨床治療提供新的線(xiàn)索及方法。

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