牛板筋中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè)研究

賈冰凝

摘 要：?jiǎn)魏思?xì)胞增生李斯特氏菌是一種重要的食源性致病菌，對(duì)食品安全和人類健康具有危險(xiǎn)性。本文通過(guò)對(duì)牛板筋中單增李斯特菌檢測(cè)的微生物法、全自動(dòng)微生物鑒定儀法和熒光PCR法這3種方法進(jìn)行研究，得出結(jié)論：3種方法結(jié)果具有較高一致性，其中熒光PCR法快速、高效，在食品安全抽檢和監(jiān)測(cè)工作中值得應(yīng)用和推廣。

關(guān)鍵詞：?jiǎn)卧隼钏固鼐?牛板筋 檢測(cè)方法 檢出率

中圖分類號(hào)：TS202 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791（2018）11（a）-0-03

單增李斯特菌是一種常見(jiàn)的食源性致病菌，可導(dǎo)致新生兒、孕婦、老年人及免疫力低下等敏感人群發(fā)生腦膜炎、流產(chǎn)、敗血癥、死胎、胃腸炎等，嚴(yán)重?fù)p害健康，死亡率達(dá)到30%左右。食物是李斯特菌傳播的主要途徑[1]，且該菌在污染的食物中，可于低溫保藏時(shí)緩慢生長(zhǎng)，達(dá)到引起感染所需的劑量[2]。

牛板筋是指牛背部?jī)蓧K連接全身運(yùn)動(dòng)肌肉的主大筋，因?yàn)樗贸?，有嚼勁，所以受到很多人的喜?ài)，近年來(lái)大量出現(xiàn)在燒烤餐飲市場(chǎng)。以前各家燒烤店通常自己購(gòu)進(jìn)牛板筋原料，進(jìn)行手工穿串，現(xiàn)場(chǎng)烤制。隨著夜市生活的繁榮，牛板筋的需求量逐年增大，加工過(guò)程逐漸發(fā)展成為產(chǎn)業(yè)化。由于有的生產(chǎn)企業(yè)在加工、儲(chǔ)存、運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)質(zhì)量控制不嚴(yán)格，造成供應(yīng)燒烤市場(chǎng)的牛板筋受到單增李斯特菌污染，加之烤制過(guò)程不能夠充分滅菌，導(dǎo)致存在較大的食品安全隱患。因此，加強(qiáng)對(duì)此類食品及其原料的市場(chǎng)抽檢監(jiān)測(cè)，預(yù)防食品安全事故發(fā)生，顯得尤為重要。

食品中單增李斯特菌的檢測(cè)方法通常有：微生物法、全自動(dòng)微生物鑒定儀法和熒光PCR法3種方法，本文通過(guò)研究近幾年運(yùn)用熒光PCR法的檢測(cè)實(shí)際，并與其他兩種方法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較分析，找出各種方法的特點(diǎn)，為開(kāi)展食品及其原料的市場(chǎng)抽檢監(jiān)測(cè)提出建議。

1 材料和方法（實(shí)驗(yàn)部分）

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

近幾年委托、監(jiān)督、國(guó)抽送檢的牛板筋肉制品。

1.2 試劑與儀器

（1）標(biāo)準(zhǔn)菌：?jiǎn)卧隼钏固鼐鶤TCC19115；英諾克李斯特菌ATCC33090；伊氏李斯特菌ATCC19119；斯氏李斯特菌ATCC35967；金黃色葡萄球菌ATCC25923；馬紅球菌ATCC6939；阪崎腸桿菌ATCC25944；腸炎沙門氏菌ATCC14082；大腸埃希氏菌ATCC25922；志賀氏菌ATCC51572；銅綠假單胞菌ATCC27853均由本中心微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

（2）培養(yǎng)基和試劑；LB、PALCAM、李斯特顯色培養(yǎng)基、TSA-YE、血平板、多種微量生化鑒定管軍購(gòu)自青島海博，科馬嘉李斯特顯色培養(yǎng)基購(gòu)自上海申工，GP（革蘭式陽(yáng)性）鑒定卡（法國(guó)生物梅里埃公司）、DNA提取試劑盒、PCR試劑均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司

（3）儀器設(shè)備：超低溫冰箱（松下冷鏈大連有限公司）低溫培養(yǎng)箱（德國(guó)BINDER）、VITEK2全自動(dòng)微生物生化鑒定儀（法國(guó)生物梅里埃公司）、小型恒溫槽（日本HAITEC公司）、高速冷凍離心機(jī)（日本HAITEC公司）、核酸蛋白分析儀（美國(guó)熱電）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)（德國(guó)Epperdorf公司和美國(guó)伯樂(lè)公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

（1）傳統(tǒng)微生物法。

①增菌分離；抽樣和送樣按照GB 4789.1-2010、GB 29921-2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中致病菌限量》二級(jí)采樣，n=5，c=0，m=0[3]，檢測(cè)方法按照GB 4789.30-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》進(jìn)行。25g樣品+225mL LB1，均質(zhì)，30℃，24h前增菌，取1mL LB1至10mL LB2中，30℃，24h后增菌，取LB2增菌液劃線PALCAM和李斯特顯色培養(yǎng)基36℃，24h+24h進(jìn)行分離培養(yǎng)，若污染較嚴(yán)重，PALCAM和法國(guó)科馬嘉李斯特顯色培養(yǎng)基24h內(nèi)即可觀察[4]。

②初篩：挑取現(xiàn)色板上典型或可疑菌落接種木糖、鼠李糖，并同時(shí)劃線TSA-YE平板，36℃，18h-24h培養(yǎng)，然后選擇木糖陰性、鼠李糖陽(yáng)性的純培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定。

③生化鑒定：染色鏡檢、動(dòng)力試驗(yàn)、生化鑒定、溶血試驗(yàn)、協(xié)同溶血試驗(yàn)均按照GB4789.30-2016執(zhí)行并結(jié)果判定。

（2）全自動(dòng)微生物鑒定儀法：制備0.6左右麥?zhǔn)蠞舛染鷳乙海═SA-YE平板上菌落），GP鑒定卡，上機(jī)測(cè)試。結(jié)果查對(duì)VITEK2鑒定細(xì)菌目錄。

（3）實(shí)時(shí)熒光PCR法。

①模板DNA的制備（兩種）。

第一，利用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）。吸取1.5mL LB1增菌液至2mLEP管中，離心，棄上清液，若沉淀量少，再次吸取1.5mL LB1增菌液，離心，棄上清液，以下步驟按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取，核酸蛋白分析儀測(cè)定DNA含量，260/280=1.8～2.0間，且核酸濃度得量在30～50ng/μL最為合適。濃度若高，需稀釋。

第二，水煮裂解法（菌落PCR）。

取TSA-YE上菌落，制成2.0麥?zhǔn)蠞舛染鷳乙?，?.5mL至2.0mLEP管中，12000r/min離心5min，棄上清，加50μL滅菌ddH2O或TE溶液，旋渦震蕩混勻，置小型恒溫槽70℃加熱10min， -20℃保存?zhèn)溆茫ㄒ陨喜僮骶赑2實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行）。

②引物、探針的設(shè)計(jì)和合成。

根據(jù)SN/T 1870-2007《食品中致病菌檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)PCR法》中公布的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測(cè)所用引物和探針序列[5]，委托大連寶生物工程有限公司合成。

③實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系。

反應(yīng)體系25μL：PCR Mix12.5μL，上游引物（10μmol）1μL，下游引物（10μmol）1μL，探針（10μmol）1μL，模板DNA（10～50ng）2μL，無(wú)菌水補(bǔ)至25μL。

反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性30s，94℃變性 5s、58.2℃延伸40s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

同時(shí)設(shè)陽(yáng)性、陰性及空白對(duì)照，空白對(duì)照為無(wú)菌水。結(jié)果及判斷執(zhí)行SN/T 1870-2007。

將1.2小節(jié)中（1）所列標(biāo)準(zhǔn)菌提取的基因組DNA，按照上式的反應(yīng)體系進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示，只有單增李斯特氏菌為陽(yáng)性，Ct：17.23，18.32，其余10種菌：英諾克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、馬紅球菌、阪崎腸桿菌、腸炎沙門氏菌、大腸埃希氏菌、志賀氏菌、銅綠假單胞菌均為陰性，說(shuō)明該方法特異性較好。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果

我中心自2012年開(kāi)展生肉制品單增李斯特菌檢測(cè)，近幾年加大檢測(cè)范圍，餐飲食品涼拌菜、熟肉制品也增加了此項(xiàng)目檢測(cè)，檢出率逐年增加，尤其牛板筋中檢出率最高。見(jiàn)表2。（樣品數(shù)量為批次，總檢測(cè)數(shù)量為18×5，牛板筋檢出陽(yáng)性數(shù)為1×5，以此類推）。2015年牛板筋檢測(cè)數(shù)量占單增李斯特菌總檢測(cè)樣品數(shù)量的27.8%，而檢出率占總陽(yáng)性率11.1%中一半，即5.55%為牛板筋，如此，2016年的10.7%的2/3，即7.13%為牛板筋，2017年的12.5%的3/5，即7.5%，即相對(duì)陽(yáng)性率也是增加的。

本實(shí)驗(yàn)室為國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)室，一般情況下試驗(yàn)方法選擇為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法，即GB 4789.30-2016微生物法。3年來(lái)，對(duì)3種檢測(cè)方法得出數(shù)據(jù)進(jìn)行了比對(duì)分析，一是檢測(cè)過(guò)程中將典型菌落全部進(jìn)行生化鑒定的同時(shí)，進(jìn)行全自動(dòng)微生物鑒定儀鑒定和熒光PCR測(cè)定。二是選取部分不典型菌落進(jìn)行生化鑒定、全自動(dòng)微生物鑒定儀鑒定和熒光PCR測(cè)定（見(jiàn)表3），得出結(jié)論：3種鑒定方法結(jié)果一致，均準(zhǔn)確可信；熒光PCR與傳統(tǒng)微生物方法相比，其操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確快速、高通量、高敏感[6]，將會(huì)對(duì)食品市場(chǎng)抽檢監(jiān)測(cè)提供更加準(zhǔn)確、快速、高效的技術(shù)檢測(cè)服務(wù)。

從表4可以看出，熒光PCR法耗時(shí)最少，在時(shí)間上占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。其他方法所需的設(shè)備、設(shè)施、人力等資源條件都可以通過(guò)投入和人員引進(jìn)培訓(xùn)來(lái)滿足，達(dá)到完成試驗(yàn)任務(wù)的目的。而時(shí)間是有限的，不可再生，在高速發(fā)展的今天，滿足服務(wù)食品產(chǎn)業(yè)發(fā)展和食品安全監(jiān)管的需求，熒光PCR法耗時(shí)少的優(yōu)勢(shì)是無(wú)可替代的。

2.2 討論

（1）由表2可以看出牛板筋檢出單增李斯特菌的陽(yáng)性率相當(dāng)高，且呈逐年上升趨勢(shì)，檢出陽(yáng)性菌均及時(shí)上報(bào)有關(guān)部門。

（2）生化鑒定中GB 4789.30 5.4.5規(guī)定協(xié)同溶血試驗(yàn)為可選檢測(cè)項(xiàng)目，依據(jù)筆者多年試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，溶血試驗(yàn)有時(shí)結(jié)果不明顯。為保證檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性，及對(duì)客戶負(fù)責(zé)的態(tài)度（剩余樣品和同批次樣品不進(jìn)行微生物項(xiàng)目復(fù)檢[7]），溶血試驗(yàn)和協(xié)同溶血試驗(yàn)應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，并進(jìn)行結(jié)果參照。

（3）因?qū)幭膶傥鞅鼻钒l(fā)達(dá)地區(qū)，食品生產(chǎn)加工企業(yè)數(shù)量少、規(guī)模小，有的質(zhì)量安全意識(shí)不強(qiáng)，質(zhì)量保證條件較差。3年來(lái)檢測(cè)的牛板筋共20批次，100個(gè)樣品，從批次上看，檢測(cè)樣品雖不具有普遍性，但仍發(fā)現(xiàn)同一生產(chǎn)廠家不同批次的產(chǎn)品受到單增李斯特菌污染，說(shuō)明有的生產(chǎn)企業(yè)在加工、儲(chǔ)存、運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)質(zhì)量控制不嚴(yán)格，從而導(dǎo)致微生物污染，帶來(lái)食品安全隱患。因此，加強(qiáng)對(duì)此類食品及其原料的市場(chǎng)抽檢監(jiān)測(cè)，預(yù)防食品安全事故發(fā)生，顯得尤為重要。熒光PCR法是比較快速、高效的方法，將會(huì)對(duì)食品市場(chǎng)抽檢監(jiān)測(cè)提供更加有力的技術(shù)支撐。

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