AG9/AB9與牛血清白蛋白相互作用的德拜休克爾極限理論分析及其焓熵補償

曹麗君，程正軍*，蔣曉慧

（西華師范大學化學化工學院，四川省化學合成與污染控制重點實驗室，四川 南充 637009）

血清白蛋白是生物體循環(huán)系統(tǒng)中最豐富的和多功能的可溶性血清蛋白成分。它能維持血液膠體滲透壓，調節(jié)血液pH值，有助于內源和外源分子（如藥物、脂肪酸、類固醇和金屬離子）的運輸、分布和新陳代謝[1-2]。牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）因其與人血清白蛋白有大約76%的結構同源性和大約88%的序列同源性，以及成本低、易于純化、較穩(wěn)定和不同尋常的配體結合特性而被廣泛選作模型來評估配體與蛋白質之間的相互作用[2-4]。在結構上，BSA是由583 個氨基酸殘基組成的單一的多肽鏈，被分為3 個結構域（Ⅰ～Ⅲ），每個域包含2 個子域（A和B）[5]。子域ⅡA和ⅢA分別被叫作Sudlow’s位點Ⅰ和Ⅱ，常常是外源和內源性配體在BSA上的結合位點[6]。當食品色素進入血液循環(huán)系統(tǒng)后，它與血清白蛋白結合，導致其在血液中的分布和自由濃度受到顯著影響；因此，探討食品色素與蛋白質之間的結合特性對獲得食品色素的重要信息（如生物活性、藥理學和毒理學行為等）十分重要。近幾年，Bourassa等[7]探索了白藜蘆醇、染料木黃酮和姜黃色素與BSA之間的結合作用，結果表明這3 種多元酚-BSA復合物是通過親水和疏水相互作用形成的，結合位點主要位于蛋白質子域Ⅰ和Ⅱ中的Trp-212和Trp-134附近。Mills等[8]的研究闡明了蛋白質轉移自由能符合焓熵補償（enthalpy entropy compensation，EEC）。而目前，酸性綠9（acid green 9，AG9）和酸性藍9（acid blue 9，AB9）（圖1）與蛋白質的相互作用鮮有報道，因此，有必要探索AG9/AB9與蛋白質之間的相互作用。鹽是生物體中重要的物質成分，本研究在模擬生理條件（pH 7.4）下，探討不同鹽濃度（離子強度）下AG9/AB9與BSA之間的結合，運用德拜休克爾極限理論對其進行定量分析，并從熱力學角度闡述這兩個結合過程中發(fā)生的焓熵補償。

圖1 AG9（A）和AB9（B）的結構Fig. 1 Structures of AG9 (A) and AB9 (B)

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BSA（純度98%）購于羅克公司，使用時沒有進一步純化，儲備液用磷酸鹽緩沖液（0.05 mol/L，pH 7.4）配制。

AG9 東京化工股份有限公司；AB9 阿拉丁化工股份有限公司；所有試劑均為分析純，使用時沒有進一步純化，所有溶液儲存在4 ℃條件下。整個實驗過程使用二次蒸餾水。

1.2 儀器與設備

Cary Eclipse熒光分光光度計 美國瓦里安公司；UV-3600近紅外-紫外-可見分光光度計 日本島津公司；微量進樣器 上海安亭公司。

1.3 方法

熒光光譜激發(fā)和發(fā)射狹縫寬均設置為5 nm，激發(fā)波長選定為280 nm。BSA濃度固定為5.0 μmol/L，AG9/AB9的濃度從0 μmol/L增加到10.32 μmol/L。采用50 μL或100 μL微量進樣器進行所有熒光滴定實驗，滴定實驗在含有（c（NaCl）為0.03、0.08、0.15 mol/L）或者不含鹽或乙醇（5%和10%）的5 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.4）中進行，它們的熒光數據均在300～500 nm波長范圍內進行掃描。

紫外-可見吸收光譜通過配備s-1700電子控溫裝置的UV-3600近紅外-紫外-可見分光光度計在298 K下進行測定。檢測改變BSA濃度（0～12 μmol/L）時離子強度即鹽濃度（c（NaCl）為0、0.03、0.08、0.15 mol/L）對AG9/AB9（8 μmol/L）吸收光譜的影響。

所有實驗重復3 次。

2 結果與分析

2.1 不同鹽濃度下BSA與AG9/AB9之間的結合特性

熒光猝滅技術是熒光團和猝滅劑之間相互作用信息的來源[9-10]，故該技術可以用來評估AG9/AB9與BSA之間的結合特性。在不同鹽濃度（c（NaCl）為0、0.03、0.08、0.15 mol/L）和不同溫度（293、298、304、310 K）條件下，隨著AG9/AB9濃度的增加，BSA的內源熒光強度逐漸減弱，并且它們的最大發(fā)射波長有微弱的藍移，c（NaCl）為0 mol/L時兩體系熒光圖譜見圖2。表明BSA-AG9/AB9復合物可能形成，且BSA中色氨酸殘基周圍微環(huán)境隨著AG9/AB9的加入而發(fā)生改變[11]。

由于猝滅劑（AG9/AB9）在熒光團（BSA）的激發(fā)和發(fā)射波長處有吸收，故需要校正所有最大波長處對應的熒光強度。以減弱甚至消除兩種食品色素導致的內濾效應。校正因子η通過公式（1）[12]計算。

式中：Ax0為熒光團在激發(fā)波長處的吸光度；Ay0為熒光團在發(fā)射波長處的吸光度；Axi＝Ax0+ΔAxi，為熒光團和猝滅劑在激發(fā)波長處的總吸光度；Ayi＝Ay0+ΔAyi，為熒光團和猝滅劑在發(fā)射波長處的總吸光度。

圖2 BSA-AG9（A）和BSA-AB9（B）體系的熒光猝滅光譜圖Fig. 2 Fluorescence quenching spectra of BSA-AG9 (A) and BSA-AB9 (B) systems

修正的Stern-Volmer方程給出如式（2）。

式中：（F0/F）m為未加入AG9/AB9和加入AG9/AB9時檢測到的熒光強度之比；η為校正系數；KSV為Stern-Volmer（S-V）猝滅常數；Kq為雙分子猝滅速率常數；τ0是不存在AG9/AB9時BSA熒光團的平均壽命，通常對于大多數熒光蛋白分子τ0為10-8s[13]；[Q]為AG9/AB9的濃度/（μmol/L）。

F0/F對[Q]作S-V圖（圖3），校正的熒光數據通過公式（2）進行分析。所有KSV值與溫度呈負相關，它們的Kq值比猝滅劑與生物分子的最大散射碰撞猝滅常數高（2.0×1010L/（mol·s））[14-15]，表明BSA-AG9/AB9體系的猝滅機制是靜態(tài)猝滅而不是動態(tài)猝滅[16-17]。此外，隨著AG9/AB9的加入，BSA的共振光散射（resonance light scattering，RLS）光譜強度增強（圖4），可再次確認這兩體系的靜態(tài)猝滅機制[18]。

圖3 BSA-AG9（A）和BSA-AB9（B）體系修正的S-V圖Fig. 3 Corrected S-V plots for the quenching of BSA by AG9 (A) or AB9 (B)

圖4 BSA-AG9（A）和BSA-AB9（B）體系的RLS圖譜Fig. 4 RLS spectra of BSA-AG9 (A) and BSA-AB9 (B) systems

結合常數（K）、結合位點數（n）通過式（3）計算。

式中：F0和F分別是未加入和加入AG9/AB9后的熒光強度；K是體系結合常數；n為結合位點數；[Q]為AG9/AB9的濃度/（μmol/L）。

從表1的數據可以看出，這兩個體系的n值近似等于1，表明AG9/AB9在BSA上存在一個結合位點。為了進一步確認AG9/AB9在BSA上存在特定的結合位點，考察這兩個體系在pH 7.4條件下的乙醇位點競爭取代實驗。若結合位點被乙醇替代，則其周圍的微環(huán)境會發(fā)生改變[19]，即乙醇將影響外源分子在子域ⅡA的結合[20]。BSA-AG9/AB9體系的K值隨著乙醇體積分數的增加而明顯減小，說明AG9/AB9在BSA上特定的結合位點位于色氨酸殘基（子域ⅡA）。相同條件下結合常數K遵循下列順序：KAG9＞KAB9，表明BSA-AG9體系的結合親和力比BSA-AB9的強。同時，較大的K值表明BSA與AG9/AB9在低溫下的結合作用較強，BSA-AG9/AB9復合物在高溫下更不穩(wěn)定。

注：R1和R2分別是K值和Van’t Hoff圖的相關系數。

為了進一步確認AG9/AB9與BSA間的化學計量和結合親和力，分別記錄不同濃度BSA在AG9/AB9-NaCl體系中的吸收光譜（圖5），采用公式（4）分析對應的吸收光譜數據[19,21]。

式中：為食品色素的初始濃度/(μmol/L)；KB-H為BSA-AG9/AB9復合物的結合常數/（L/mol）；ΔA和Δε分別為AG9/AB9在最大吸收波長處的吸光度和摩爾吸收系數；l為石英比色皿的寬度/cm；c（BSA）為加入BSA的濃度/（μmol/L）。

在式（4）中，/ΔA對1/c（BSA）的Benesi-Hildebr（B-H）圖見圖5中的插圖?？梢杂^察到B-H圖呈線性，證明在不同的鹽濃度下BSA與AG9/AB9間形成1∶1復合物[19]。KB-H（BSA-AG9）＞KB-H（BSA-AB9），并且在高鹽濃度下，這兩個體系的KB-H值（103～105L/mol）較低，這與上述熒光研究一致。

圖5 BSA濃度逐漸增加時AG9/AB9的吸收光譜與BSA-AG9 （A）和BSA-AB9（B）體系的Benesi-Hildebrand圖Fig. 5 Absorption spectra of AG9 or AB9 with the increase of BSA concentration and Benesi-Hildebrand plots for BSA-AG9 (A) and BSA-AB9 (B) systems

鹽濃度增加時BSA-AG9/AB9體系的S-V圖如圖6（相關參數未列出），可知隨著鹽濃度的增加，BSA的猝滅程度顯著降低，這可能由于較高的鹽濃度能減弱這兩種食品色素的毒性和血清蛋白對它們的吸收。從表1中熱力學參數可以看出（由Van’t Hoff方程擬合圖求得），在較低鹽濃度下，AG9/AB9主要通過靜電力與BSA結合，這可能是食品色素攜帶的磺酸基吸引蛋白質正電荷側鏈的結果。在高鹽濃度下，BSA-AG9/AB9體系的EEC將在2.3節(jié)討論。

圖6 NaCl濃度對BSA-AG9（A）和BSA-AB9（B）體系猝滅的影響Fig. 6 Effect of increasing NaCl concentration on quenching of BSA by AG9 (A) and AB9 (B)

2.2 不同離子強度下結合作用的德拜休克爾極限理論定量分析

以上結果證明AG9/AB9與BSA之間相互作用的化學計量比為1∶1，故蛋白質（BSA）與配體（食品色素）間形成1∶1復合物時存在下列平衡（式（5））。

式中：ZB為蛋白質腔（受體腔）所帶電荷；ZC為配體所帶電荷。

基于德拜休克爾極限理論，真實的吉布斯自由能變化ΔG0I→0（零離子強度時的自由能改變）與離子強度I之間的函數關系如下（式6）[22]。

式中：ZBC2為ZB+ZC的平方；?G0為體系吉布斯自由能變化/（kJ/mol）；R為氣體常數；T為溫度/K；A為吸光度。

對于給定的蛋白質-配體對，--是常數，可以用ξ表示。ξ的大小和符號與平衡時兩種電荷之間的平方差有關。對于水，在293、298、304、310 K下，對應的吸光度A分別為0.522、0.509、0.494、0.480（https://en.wikipedia.org/wiki/Debye-Hückel_theory）。ξ＝（ZB+ZC）2--＝2ZBZC，則公式（6）可以表示為式（7）。

式（7）中不同溫度（293、298、304、310 K）下的B值分別是2 928.48、2 904.28、2 875.44、2 849.09。圖7顯示ΔG0對I1/2擬合有較好的線性關系，表明德拜休克爾極限理論可以用來研究AG9/AB9與BSA間的相互作用。同時，從圖7所觀察到的正的斜率表明BSA-AG9/AB9體系的ξ值為負。實際上，ξ＝2ZBZC，這里AG9/AB9的ZC值的符號是負的（表2），通過公式（7）計算ZB的值為正，這樣ξ值為負，這與上面的結論一致。結果意味著相反電荷之間離子對的形成，即AG9/AB9的負電荷與BSA的凈正電荷結合腔（位點-Ⅰ）相結合，這表明結合位點的局部電荷比蛋白質的整體或表面電荷更重要[22]。

表2 BSA-AG9/AB9體系的德拜休克爾極限理論分析參數Table 2 Parameters from Debye-Hückel theory for BSA-AG9/AB9 system

所有的ΔG0值隨著離子強度的增強而增大（圖7），表明AG9/AB9與BSA間的靜電力或結合親和力隨著鹽濃度的增加而減弱，即相反電荷之間離子對的形成隨著介質離子強度的增加而減弱，這可能是由于化學惰性鹽（電解質）屏蔽了相互作用的電荷[22]。另外，所有Δ值是通過ΔG0對I1/2擬合的截距來計算的，對應的值列于表2。顯然，在相同溫度下，ΔG0I→0的值比ΔG0低，表明鹽的加入會影響實際結合強度。

圖7 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）中BSA-AG9/AB9體系中ΔG0對I1/2的圖Fig. 7 Plots of ΔG0 vs. I1/2 for BSA-AG9/AB9 system in 0.05 mol/L phosphate buffer (pH 7.4)

BSA-AG9/AB9體系的德拜休克爾極限理論分析數據見表2。對于某個確定配體，其ZC值已知，如AG9的ZC值為-1，AB9的ZC值為-2；因此，可以估算得到BSA的平均正電荷（ZB）。

2.3 焓熵補償

近年來，少數研究者探討蛋白質-配體相互作用過程中的EEC[23-26]，具體來說就是相互作用體系的熵變被對應的焓變補償而其結合自由能改變很少的現(xiàn)象[27-28]。

在298 K下，BSA-AG9/AB9體系的焓變（?H0）對熵變（T?S0）作圖（圖8）。圖8展現(xiàn)較好的線性關系，表明在這兩個體系中存在EEC[22]。依據熱力學參數ΔH0、ΔS0的符號來確定相互作用過程中存在的主要結合力類型的描述如下：1）正的?H0和?S0值表明疏水相互作用；2）負的?H0和正的?S0值表明水溶液中離子間特定的靜電相互作用；3）負的?H0和?S0與氫鍵和范德華力的形成有關[29]。從這兩個體系的熱力學數據發(fā)現(xiàn)，c（NaCl）＜0.03 mol/L時，BSA-AG9/AB9體系的熵貢獻是正的；而c（NaCl）＞0.03 mol/L時，這兩個體系的熵變均為負值。并且，焓變隨著鹽濃度的增加而增加。這意味著c（NaCl）＜0.03 mol/L時，相互作用由靜電力主導；高于這個鹽濃度時，非靜電力（即氫鍵和范德華力）占主導[30]。通過上面分析可以得到如下結論：當靜電力占主導時，配體與蛋白質的結合沒有對體系局部運動產生較大的束縛，這可以從作用體系具有較低的焓變和正的熵變證明；而當氫鍵和范德華力占主導作用時，蛋白質配體的局部運動可能受阻，這從計算所得較高焓變和負的熵變得證。此外，當c（NaCl）增加到0.08 mol/L時，BSA-AG9體系的靜電力貢獻下降程度較小（?S＝（48.88±0.55）～-（14.30±7.03））；而對BSA-AB9體系，靜電力的貢獻下降程度較大（?S＝（55.66±0.71）～-（40.55±0.66）），這表明與BSA-AB9體系相比，BSA-AG9體系有較強的離子對形成。總之，離子氛（鹽）會屏蔽靜電力，當BSA-AG9/AB9體系中鹽濃度（離子強度）增加到一定程度時，靜電力轉變?yōu)榉庆o電力，使體系結構自由度減弱，結構穩(wěn)定性提高，導致熵的減小。這樣結合焓的增加被熵的減少補償，而體系結合自由能有很小的改變[23]。

圖8 BSA-AG9/AB9體系中ΔH0對TΔS0的圖Fig. 8 Plots of ΔH0 vs. TΔS0 for BSA-AG9/AB9 system

3 結 論

在不同條件下，運用多光譜技術深入研究BSA與兩種食品色素間的相互作用特性。結果表明，AG9/AB9與BSA的結合機制是靜態(tài)猝滅。BSA-AG9/AB9體系在低鹽濃度下結合作用較強，且相同條件下AG9與BSA間的結合親和力較AB9強。位點競爭取代實驗證實這兩種食品色素可能結合在BSA的特定位點Trp殘基上。?G0對I1/2的擬合圖有較好的線性關系，證實了運用德拜休克爾極限理論研究BSA-AG9/AB9體系熒光數據的合理性，通過該圖估算對比其結合親和力，表明較小的結合親和力可以通過加入鹽（增加離子強度）進行調制。當離子強度增加到一定程度，AG9/AB9與BSA相互作用的主導力由靜電力轉變?yōu)榉庆o電力，導致焓和熵相互補償并伴有結合親和力減弱而?G0改變很小的現(xiàn)象，即焓熵補償。顯然，這些方法或理論有助于探討蛋白質-配體間的結合作用，為通過改變外部條件來減少甚至消除食品色素毒性或改善藥效提供依據。

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