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    微生物脂肪酶資源挖掘研究進(jìn)展

    2018-04-24 12:01:52蔡海鶯王珍珍趙敏潔毛建衛(wèi)馮鳳琴
    食品科學(xué) 2018年7期
    關(guān)鍵詞:脂肪酶突變體底物

    蔡海鶯,王珍珍,張 婷,趙敏潔,李 楊,毛建衛(wèi),馮鳳琴,*

    脂肪酶亦稱?;视退饷?,在自然界中主要催化三酰甘油酯的水解,還可在非水相條件下催化酯化、酯交換、醇解和酸解等反應(yīng)[1-2]。脂肪酶目前在酶制劑中銷量第三,僅次于糖酶和蛋白酶,其催化多樣性和底物專一性等特征使其在糧油生產(chǎn)、食品工業(yè)、日用化學(xué)工業(yè)、油脂化學(xué)工業(yè)、農(nóng)業(yè)化學(xué)工業(yè)、造紙工業(yè)、洗滌劑工業(yè)以及藥物合成等許多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。脂肪酶可由動(dòng)物、植物和微生物(包括霉菌、酵母及細(xì)菌)等各類生物細(xì)胞表達(dá),它既可以從動(dòng)物或植物的組織中提取,也能通過(guò)微生物發(fā)酵培養(yǎng)得到,而目前微生物是工業(yè)脂肪酶的主要來(lái)源[2]。另外,自從米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor miehei lipase,RML)的3D結(jié)構(gòu)在1990年得到解析后(圖1)[3],微生物脂肪酶的結(jié)構(gòu)研究已經(jīng)比較透徹,它具有一些典型的結(jié)構(gòu)及特征[1]:微生物脂肪酶結(jié)構(gòu)屬于典型的α/β水解酶折疊類;活性中心由催化三聯(lián)體Ser-His-Asp/Glu組成;具有特殊氧陰離子洞結(jié)構(gòu),幫助維持酶-底物中間體的穩(wěn)定;許多脂肪酶還具有蓋子結(jié)構(gòu),與脂肪酶的界面激活相關(guān)。

    圖1 α/β水解酶折疊結(jié)構(gòu)示意圖(RML)Fig. 1 Schematic diagram of folded structure of α/β hydrolase (RML)

    隨著微生物脂肪酶工業(yè)化應(yīng)用的不斷發(fā)展,市場(chǎng)對(duì)酶制劑的各項(xiàng)性質(zhì)和指標(biāo)提出了更高的要求,如最適溫度和pH值、較高的溫度穩(wěn)定性和酸堿耐受性、理想的催化活性和反應(yīng)專一性、非常規(guī)溶劑(有機(jī)溶劑、離子液體等)的耐受性等。微生物脂肪酶基因和蛋白相關(guān)資源信息已經(jīng)非常豐富,但適合食品、藥品和能源等工業(yè)應(yīng)用的脂肪酶制劑品種依然較少,研究者仍然在為新型和理想的脂肪酶制劑資源的挖掘而努力。研究的重點(diǎn)主要包括:1)通過(guò)環(huán)境篩選和宏基因組等方法不斷挖掘新的具有優(yōu)良特性的脂肪酶;2)通過(guò)誘變等傳統(tǒng)的微生物遺傳育種方法改良脂肪酶生產(chǎn)菌株;3)構(gòu)建重組工程菌株在模式微生物中異源表達(dá)脂肪酶基因,以提高脂肪酶表達(dá)效率;4)優(yōu)化產(chǎn)脂肪酶菌株的發(fā)酵表達(dá)工藝以及下游分離純化工藝,提高酶的表達(dá)量和得率;5)利用定向進(jìn)化和理性設(shè)計(jì)等分子生物學(xué)手段對(duì)酶蛋白進(jìn)行改造,改善脂肪酶的理化性質(zhì)和催化性質(zhì);6)通過(guò)酶固定化以及改善酶催化反應(yīng)條件提高脂肪酶的催化效率和利用效率。

    1 產(chǎn)脂肪酶微生物篩選

    與其他水解酶類相比,脂肪酶催化的反應(yīng)類型和條件更加多樣化,而不同類型脂肪酶的應(yīng)用嚴(yán)格受限于其活性、專一性、最適溫度和pH值、溫度和酸堿穩(wěn)定性、溶劑耐受性等酶學(xué)性質(zhì),所以篩選到合適的脂肪酶及其編碼基因是脂肪酶研發(fā)的重要基礎(chǔ)。脂肪酶在自然界分布廣泛,由于篩選技術(shù)和體系的完善和成熟,從環(huán)境篩選產(chǎn)脂肪酶微生物已經(jīng)相對(duì)容易。但是要獲得具有理想催化性質(zhì)和理化性質(zhì)的脂肪酶,往往還依賴于高效的篩選方法和針對(duì)性的微生物樣品來(lái)源。

    1.1 產(chǎn)脂肪酶微生物的環(huán)境篩選

    產(chǎn)脂肪酶微生物幾乎無(wú)處不在,考慮到自然界對(duì)產(chǎn)脂肪酶微生物的天然富集作用,脂肪酶的表達(dá)主要受環(huán)境因子的調(diào)節(jié),產(chǎn)脂肪酶微生物需要以油脂和脂肪酸作為碳源生長(zhǎng),因此常用的微生物篩選來(lái)源包括油脂加工廠、乳制品工廠以及附近被油脂污染的土壤和水域等。

    脂肪酶區(qū)別其他水解酶類的一個(gè)顯著特征是許多脂肪酶的催化合成反應(yīng)要求在非水相條件進(jìn)行,這對(duì)脂肪酶穩(wěn)定性方面提出了更高要求。Ogino等[4]認(rèn)為從有機(jī)溶劑耐受性較高的微生物中篩選到的酶,更可能具有有機(jī)溶劑耐受性,他們將采集的微生物樣品在含20%有機(jī)溶劑的培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)后,最終篩選到來(lái)源于Pseudomonas aeruginosa LST-03菌株的具有一定有機(jī)溶劑耐受性的脂肪酶。此后,陸續(xù)有各種具有高穩(wěn)定性和耐受性的脂肪酶被篩選獲得的報(bào)道,產(chǎn)脂肪酶微生物樣品來(lái)源也擴(kuò)展到一些極端環(huán)境(表1),如熱溫泉、火山、海底和冰川等[5]。Stathopoulou等[6]從希臘愛(ài)琴海的圣托里尼火山區(qū)域分離到101 株細(xì)菌,其中9 株菌株能分泌胞外脂肪酶,進(jìn)一步的酶失活實(shí)驗(yàn)表明這些脂肪酶大部分具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。

    表1 極端環(huán)境產(chǎn)脂肪酶微生物篩選Table 1 Lipase-producing microorganisms from extreme environments

    1.2 產(chǎn)脂肪酶微生物篩選方法

    產(chǎn)脂肪酶微生物的篩選方法必須具有快速、簡(jiǎn)潔,并適合大規(guī)模篩選的特點(diǎn)。由于脂肪酶催化反應(yīng)和底物的多樣性,脂肪酶活性可以通過(guò)多種方法檢測(cè)。產(chǎn)脂肪酶微生物的篩選方法均由脂肪酶酶活力檢測(cè)方法發(fā)展而來(lái),常見(jiàn)的篩選方法有透明圈法、變色圈法和熒光圈法。透明圈篩選法原理是利用微生物分泌的脂肪酶水解該菌落周圍培養(yǎng)基中乳化的甘三酯底物產(chǎn)生甘油和對(duì)應(yīng)脂肪酸,使原本不透明的甘三酯底物轉(zhuǎn)化為透明產(chǎn)物,從而形成以菌落為中心的透明圈[17-18]。變色圈法和熒光圈法與透明圈法原理相似,不同的是還需在培養(yǎng)基中添加能與水解產(chǎn)物游離脂肪酸反應(yīng)的顯色指示劑,如羅丹明B、維多利亞藍(lán)等。羅丹明B陽(yáng)離子能與水解產(chǎn)物脂肪酸形成熒光物質(zhì),在紫外光照射下顯示熒光,從而達(dá)到產(chǎn)脂肪酶微生物篩選的目的[19]。

    隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,對(duì)脂肪酶進(jìn)行蛋白工程改造的研究越來(lái)越成熟,也出現(xiàn)了許多脂肪酶高通量篩選方法,如Jaeger等[20]以對(duì)硝基苯酚酯(常用的包括丁酸酯和棕櫚酸酯等)為底物,篩選能拆分R和S型底物的立體選擇性脂肪酶。雖然理論上脂肪酶催化水解和酯化互為可逆反應(yīng),但是脂肪酶的水解活性和合成活性并非對(duì)等的,水解活性高的脂肪酶在非水相溶劑中展示的合成活性不一定高。因此,傳統(tǒng)的以水解活性為依據(jù)的篩選方法對(duì)于篩選具有酯化合成能力的脂肪酶存在一定在風(fēng)險(xiǎn)。基于脂肪酶在各種合成反應(yīng)中的重要地位,研究者建立了一系列非水相中脂肪酶酯催化合成能力篩選和評(píng)估方法。Furutani等[21]通過(guò)測(cè)試24 種反應(yīng)體系中脂肪酶活力,發(fā)現(xiàn)這些脂肪酶酯化合成活力能以體積分?jǐn)?shù)50%正己烷溶劑條件下水解油脂底物的活性來(lái)表征。Goujard等[22]建立了分光光度法測(cè)定脂肪酶轉(zhuǎn)酯活性,通過(guò)硬脂酸乙烯酯和醇在非水相條件下的轉(zhuǎn)酯反應(yīng),在200 nm紫外光下測(cè)定吸光度檢測(cè)硬脂酸乙烯酯底物的消耗量,換算脂肪酶的轉(zhuǎn)酯活性。這些不斷涌現(xiàn)的新脂肪酶活力測(cè)定和篩選方法,對(duì)新型脂肪酶的發(fā)掘、制造和應(yīng)用有非常重要的作用,同時(shí)也推動(dòng)了脂肪酶的蛋白工程改造和分子改造研究。

    1.3 宏基因組文庫(kù)篩選

    由于地球上微生物種類多樣,目前大部分種類很難分離和培養(yǎng),在很多環(huán)境中,多達(dá)99%的微生物種類很難以標(biāo)準(zhǔn)化方式培養(yǎng),包括許多極端環(huán)境的微生物。因此,以傳統(tǒng)的平板分離法分離具有解脂活性的產(chǎn)脂肪酶微生物將會(huì)丟失許多脂肪酶資源。宏基因組是指特定環(huán)境中全部微小生物基因組DNA的總和,又稱為環(huán)境基因組[23-24]。隨著宏基因組和微生態(tài)相關(guān)技術(shù)的發(fā)展,研究者能夠突破環(huán)境微生物分離和培養(yǎng)的瓶頸,極大限度地增加了環(huán)境微生物脂肪酶資源的利用潛能。

    利用宏基因組篩選脂肪酶的方法主要包括兩種:基于功能的脂肪酶篩選和基于DNA序列的篩選?;诠δ艿闹久负Y選需要對(duì)收集的樣品宏基因組DNA進(jìn)行宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建。構(gòu)建的文庫(kù)經(jīng)異源表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)后,在平板上對(duì)其功能性進(jìn)行篩選鑒定,對(duì)有脂肪酶活性的克隆進(jìn)一步分析,以獲得該脂肪酶的編碼基因。Glogauer等[25]從高油脂污水中提取宏基因組DNA,通過(guò)以甘三酯為底物的功能性篩選平板建立的文庫(kù)中篩選了500 000 個(gè)克隆,獲得了32 株具有脂肪酶基因的克隆。Yan Wei等[26]從熱溫泉提取宏基因組DNA,通過(guò)人工染色體載體構(gòu)建基因文庫(kù),在獲得的68 352 個(gè)克隆中篩選到具有能表達(dá)三丁酸甘油酯水解活性的新型脂肪酶基因lip-1。然而,基于功能的篩選方法缺點(diǎn)顯而易見(jiàn),即活性克隆比例通常在1/10 000水平,篩選效率十分低下且耗時(shí)耗力[27]。另外,異源表達(dá)系統(tǒng)還可能導(dǎo)致許多脂肪酶基因因低表達(dá)或不能功能性表達(dá)而被遺漏。

    基于DNA序列的宏基因組篩選方法主要是指根據(jù)脂肪酶基因高度同源序列設(shè)計(jì)合適的簡(jiǎn)并引物,用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增出潛在的脂肪酶編碼序列。脂肪酶保守區(qū)域包括Ser親核肘以及氧陰離子洞等脂肪酶特有結(jié)構(gòu)。然而,基于序列的篩選同樣具有許多問(wèn)題,如只能得到部分脂肪酶基因,需要染色體步移和熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR等輔助手段獲得全長(zhǎng)。并且該方法要求合適的PCR條件,復(fù)雜多樣的模板以及引物模板的低匹配程度都可能導(dǎo)致PCR無(wú)法獲得理想產(chǎn)物,也意味著很難發(fā)現(xiàn)具有不同序列結(jié)構(gòu)的新脂肪酶家族基因。對(duì)構(gòu)建文庫(kù)的功能性篩選和基于生物信息學(xué)分析的篩選是兩種優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)的宏基因組技術(shù)手段。隨著測(cè)序技術(shù)和基因注釋的不斷豐富和完善,人們從宏基因組文庫(kù)中獲得新的脂肪酶基因概率也不斷提高。

    2 脂肪酶生產(chǎn)微生物菌株遺傳改良

    一般情況下,微生物自身的生存和代謝調(diào)控都遵循經(jīng)濟(jì)的原則,即以最小的消耗獲得有利于自身發(fā)展的最大效益,但這并不符合人們對(duì)其作為細(xì)胞工廠高效表達(dá)目的產(chǎn)物的定位。通過(guò)誘變這一傳統(tǒng)的微生物遺傳育種方法能夠改良脂肪酶生產(chǎn)菌株,實(shí)現(xiàn)酶產(chǎn)量的大幅提高。誘變育種的原理是通過(guò)造成遺傳物質(zhì)DNA的損傷而達(dá)到生物突變,常用的誘變方法包括物理誘變法(紫外線、等離子體、X射線、γ射線和其他射線處理等)、化學(xué)誘變法(烷化劑、吖啶、亞硝酸、疊氮化物和甲基磺酸乙酯等)以及二者組合的復(fù)合誘變。如Mahadik等[28]采用紫外線處理誘變產(chǎn)脂肪酶黑曲霉菌株,使其產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高了7 倍。

    傳統(tǒng)的誘變方法是通過(guò)微生物基因組DNA的突變提高目的蛋白脂肪酶活力和表達(dá)量,其可能機(jī)理主要包括:1)突變促進(jìn)了微生物細(xì)胞生長(zhǎng),縮短了細(xì)胞分裂周期,去掉了不利的代謝通路;2)突變提高了細(xì)胞對(duì)蛋白(胞外酶)的分泌效率;3)降低了細(xì)胞對(duì)蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平的阻遏,使目的蛋白不受某些轉(zhuǎn)錄因子的負(fù)面調(diào)節(jié);4)突變導(dǎo)致部分蛋白酶(尤其是胞外蛋白酶)的活力降低甚至失活,使目的蛋白有效積累;5)直接作用于目的蛋白的突變,使表達(dá)量或比酶活力提高,如提高啟動(dòng)子效率或改善酶的立體結(jié)構(gòu)和催化性質(zhì)。趙興秀等[29]采用紫外線誘變、微波誘變和紫外微波復(fù)合誘變多種方式處理出發(fā)菌株H3,結(jié)果表明,經(jīng)微波輻射40 s和紫外線照射80 s復(fù)合誘變后篩選到的菌株M3產(chǎn)酶活力最高(61.6 U/mL),比出發(fā)菌株H3提高了46.85%。賈佳等[30]用亞硝基胍對(duì)初始菌株黑曲霉G27原生質(zhì)體進(jìn)行誘變,經(jīng)過(guò)初篩、復(fù)篩和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)獲得2 株脂肪酶活力顯著提高的突變菌株P(guān)316和P388,酶活力分別達(dá)394.3 U/mL和385.1 U/mL。盡管越來(lái)越多的突變方法和篩選體系被發(fā)明和完善,傳統(tǒng)誘變的方法對(duì)于酶產(chǎn)量的提高仍然是低效的,因?yàn)榕c酶表達(dá)相關(guān)的基因只是微生物基因組中成千上萬(wàn)基因中的少數(shù)幾個(gè)。因此,傳統(tǒng)誘變更適合用于與未知的、復(fù)雜的代謝途徑相關(guān)的代謝產(chǎn)物或表觀性狀的遺傳改良。然而,對(duì)質(zhì)粒等小DNA分子進(jìn)行誘變能提高改良效率,可作為定向進(jìn)化的輔助手段。另外,Zhang Xue等[31]利用常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)處理脂肪酶蛋白的研究表明,經(jīng)過(guò)ARTP處理的脂肪酶的活力有所升高,進(jìn)一步通過(guò)圓二色光譜分析發(fā)現(xiàn),經(jīng)處理后的脂肪酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化;表明誘變可直接作用于生物活性物質(zhì),通過(guò)對(duì)酶結(jié)構(gòu)的改變改善酶的催化性質(zhì),為酶工程提供了新的研究方向。

    在模式微生物中異源重組表達(dá)脂肪酶基因,是提高脂肪酶表達(dá)效率和降低生產(chǎn)成本的另一個(gè)有效手段。重組表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)脂肪酶具有多種優(yōu)勢(shì):重組表達(dá)系統(tǒng)大多具有高效表達(dá)脂肪酶的能力;重組表達(dá)的宿主遺傳背景清晰,易于分子改造;模式生物的表達(dá)體系成熟,易于培養(yǎng)和調(diào)控,發(fā)酵周期較短,培養(yǎng)成本低;很多表達(dá)系統(tǒng)如酵母和絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)具有很強(qiáng)的分泌能力,能將脂肪酶分泌到胞外,易于下游的分離純化和制劑化(固定化)等操作等。目前,多種重組表達(dá)系統(tǒng)被用于脂肪酶的異源表達(dá),其中多種商業(yè)化脂肪酶也來(lái)源于重組宿主,如諾維信公司的RML主要來(lái)源于米曲霉表達(dá)系統(tǒng)。另外,GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中批準(zhǔn)的3 種用于食品工業(yè)的脂肪酶制劑添加劑[32]可由特定重組表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn),如南極假絲酵母脂肪酶基因可由黑曲霉宿主表達(dá),尖孢鐮刀菌脂肪酶基因可由Aspergillus oryzae重組表達(dá)。脂肪酶的克隆和重組表達(dá)方面的研究更是不勝枚舉。徐蘇煒等[33]將編碼RML的基因克隆到pPIC9K載體中,轉(zhuǎn)化到Pichia pastoris GS115菌株,G418梯度篩選獲得了分泌表達(dá)RML的重組畢赤酵母工程菌,以橄欖油為底物時(shí),發(fā)酵上清液酶活力最大可達(dá)102 U/mL。苗長(zhǎng)林等[34]通過(guò)反轉(zhuǎn)錄-PCR擴(kuò)增出RML結(jié)構(gòu)基因,并轉(zhuǎn)化到P. pastoris GS115菌株進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果表明,重組子發(fā)酵液經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析獲得了與預(yù)期分子質(zhì)量大?。s39 kDa)一致的蛋白表達(dá)特異條帶,用NaOH溶液滴定法測(cè)其活力,酶活力可達(dá)84 U/mL。另外,Zheng Yayun等[35]從Thermomyces lanuginosus HSAUP0380006克隆了該菌株的脂肪酶基因,構(gòu)建了該基因在P. pastoris的重組表達(dá)工程菌,通過(guò)甲醇誘導(dǎo)表達(dá),發(fā)酵上清液水解橄欖油酶活力最高可達(dá)61 U/mL。

    另外,在基因工程菌異源表達(dá)中,多種基因表達(dá)的優(yōu)化方法被用于進(jìn)一步提高脂肪酶基因的表達(dá)水平,包括:提高基因拷貝數(shù),替換成強(qiáng)啟動(dòng)子,表達(dá)框中加入增強(qiáng)子,加信號(hào)肽使酶分泌到胞外,共表達(dá)分子伴侶和前導(dǎo)肽,對(duì)基因序列(如密碼子、密碼子對(duì)等)進(jìn)行優(yōu)化、融合表達(dá)和共表達(dá),選擇合適的工程菌宿主(如蛋白酶缺陷型菌株)和優(yōu)化發(fā)酵工藝以及下游分離純化工藝提高酶的表達(dá)量和得率等。這些優(yōu)化方法并非獨(dú)立存在,相反,將它們有機(jī)結(jié)合才可能實(shí)現(xiàn)酶異源表達(dá)的最大化。如楊江科等[36]探討了脂肪酶前導(dǎo)肽以及密碼子優(yōu)化對(duì)脂肪酶表達(dá)以及性質(zhì)的影響,采用重疊延伸PCR技術(shù)將基因中8 個(gè)低頻密碼子替換為高頻密碼子后,在搖瓶條件下發(fā)酵72 h,發(fā)現(xiàn)經(jīng)密碼子優(yōu)化后的成熟米根霉脂肪酶(mature Rhizopus oryzae lipase,m-ROL)活力和蛋白質(zhì)含量分別達(dá)到132.7 U/mL和50.4 mg/mL,而初始m-ROL和含前導(dǎo)肽米根霉脂肪酶(pro-ROL)活力和蛋白質(zhì)含量分別僅為28.7 U/mL和14.4 mg/L、29.6 U/mL和14.1 mg/L。

    3 脂肪酶的蛋白質(zhì)工程

    目前能用于工業(yè)化的微生物脂肪酶的種類還十分有限。利用蛋白質(zhì)工程的方法對(duì)現(xiàn)有脂肪酶蛋白進(jìn)行分子定向改造,來(lái)改善脂肪酶的理化性質(zhì)和催化性質(zhì),是拓寬酶工程研究領(lǐng)域和獲得理想酶制劑的重要手段之一。分子改造的方法主要分為定向進(jìn)化、理性設(shè)計(jì)和二者相結(jié)合的半理性設(shè)計(jì)[37]。

    3.1 脂肪酶定向進(jìn)化

    定向進(jìn)化是指模擬自然選擇的進(jìn)化機(jī)制,通過(guò)分子生物學(xué)手段在體外快速建立含大量目的蛋白編碼基因的突變體文庫(kù),并通過(guò)高通量的定向篩選方法,快速得到符合人類應(yīng)用價(jià)值的蛋白突變體[38-39]。定向進(jìn)化與自然進(jìn)化都遵循試錯(cuò)法的策略,通過(guò)不斷的實(shí)驗(yàn)嘗試獲得符合預(yù)期的突變體。由于定向進(jìn)化不需要獲得蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)以及催化位點(diǎn)等結(jié)構(gòu),因此只須對(duì)蛋白氨基酸序列做隨機(jī)突變,這是蛋白質(zhì)工程的重要研究手段。定向進(jìn)化的核心步驟主要包括兩部分,即構(gòu)建具有多樣性的突變體文庫(kù)和高通量的篩選方法。

    隨著基因工程手段的豐富,構(gòu)建突變體文庫(kù)的方法也越來(lái)越多。常用的包括:易錯(cuò)PCR、DNA改組、交錯(cuò)延伸過(guò)程、隨機(jī)引導(dǎo)重組、截?cái)酄钅0逯亟M延伸等[40]。但是每種方法都有自身的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn),在構(gòu)建突變體文庫(kù)時(shí),只有根據(jù)蛋白基因、篩選目的和實(shí)驗(yàn)條件等綜合考慮,選擇適合自己實(shí)驗(yàn)的突變方法,獲得多樣化且突變率或重組率合適的基因突變體文庫(kù),才能通過(guò)高通量篩選方法獲得定向進(jìn)化的酶突變體。

    同樣,建立高通量的篩選方法,從海量的突變基因文庫(kù)中快速、靈敏、高效地獲得符合需要的突變體,也是酶定向進(jìn)化獲得成功的關(guān)鍵因素。由于篩選方法會(huì)因篩選蛋白和篩選目的的變化而不同,因此高通量的篩選方法的缺乏一直限制著定向進(jìn)化的進(jìn)一步應(yīng)用。但隨著定向進(jìn)化和蛋白質(zhì)工程相關(guān)技術(shù)的飛速發(fā)展,酶突變體文庫(kù)高通量篩選方法也不斷出現(xiàn),如細(xì)胞表面展示技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、核糖體展示技術(shù)以及細(xì)菌和酵母胞外表達(dá)篩選方法。篩選形式也漸漸從靈敏度較低和不能定量檢測(cè)的平板觀察法轉(zhuǎn)移到更加靈敏、可靠、高效且適于自動(dòng)化的微孔板篩選法和流式細(xì)胞儀篩選。利用定向進(jìn)化技術(shù)構(gòu)建脂肪酶突變體庫(kù)和高通量的篩選方法已十分成熟,也已獲得大量活性、熱穩(wěn)定性、溶劑耐受性或底物選擇性改良的脂肪酶突變體。Liebeton等[41]用易錯(cuò)PCR對(duì)Pseudomonas aeruginosa脂肪酶進(jìn)行迭代隨機(jī)突變,獲得的最佳突變體含5 個(gè)突變氨基酸,對(duì)篩選底物2-甲基月桂酸對(duì)硝基苯酚酯的手性選擇性提高了23.45 倍。Zhang Ningyan等[42]同樣通過(guò)易錯(cuò)PCR的迭代隨機(jī)突變方法對(duì)南極假絲酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B,CALB)進(jìn)行定向進(jìn)化,篩選得到的兩個(gè)脂肪酶突變體23G5和195F1在70 ℃溫度下的半衰期較野生CALB提高了20 倍。酶的定向進(jìn)化技術(shù)成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)酶結(jié)構(gòu)的改造,從而改造了酶的催化功能和性質(zhì),使酶的應(yīng)用成本顯著降低,應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。然而,考慮到每種酶蛋白往往有幾百個(gè)氨基酸,每種氨基酸可能被其他19 種氨基酸替代,而酶的定向進(jìn)化是建立在隨機(jī)突變和重組的基礎(chǔ)上進(jìn)行篩選;因此,定向進(jìn)化往往需要建立巨大的突變文庫(kù),篩選過(guò)程需要大量的人力資源和時(shí)間,且能篩選到的陽(yáng)性突變體非常少。

    3.2 脂肪酶理性設(shè)計(jì)

    與定向進(jìn)化的非理性設(shè)計(jì)策略不同,理性設(shè)計(jì)是根據(jù)已知脂肪酶的三維結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理,分析酶結(jié)構(gòu)和功能間的構(gòu)效關(guān)系,并針對(duì)性地替換或修飾某些氨基酸殘基,以精確調(diào)控蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu),從而獲得具有預(yù)期催化性質(zhì)和理化性質(zhì)的酶蛋白。理性設(shè)計(jì)需要許多與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能相關(guān)的信息作為設(shè)計(jì)理論基礎(chǔ)和指導(dǎo),可簡(jiǎn)單分為基于實(shí)驗(yàn)的理性設(shè)計(jì)、基于酶保守序列的理性設(shè)計(jì)、基于計(jì)算機(jī)輔助和從頭設(shè)計(jì)的理性設(shè)計(jì)。

    基于實(shí)驗(yàn)的理性設(shè)計(jì)并無(wú)統(tǒng)一策略,設(shè)計(jì)能否改善酶蛋白主要取決于對(duì)酶構(gòu)效關(guān)系的掌握程度,主要方法包括特定位點(diǎn)(如活性中心、底物結(jié)合位點(diǎn)等)的突變和脂肪酶蓋子結(jié)構(gòu)改造等。Secundo等[43]基于對(duì)脂肪酶蓋子結(jié)構(gòu)功能的了解,對(duì)褶皺假絲酵母脂肪酶和假單胞菌的蓋子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造,獲得了酶活性和底物特異性變化的突變體。同時(shí)在枯草芽孢桿菌脂肪酶A脂肪酶中插入蓋子結(jié)構(gòu),使其酶活性、特異性、立體選擇性和穩(wěn)定性都發(fā)生改變。

    基于酶蛋白保守序列和保守結(jié)構(gòu)的理性設(shè)計(jì)是通過(guò)搜索和比對(duì)同源性酶的保守序列,從而對(duì)影響蛋白的關(guān)鍵殘基進(jìn)行預(yù)測(cè)和改造。隨著生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)中蛋白序列及結(jié)構(gòu)信息的增多,基于序列和結(jié)構(gòu)信息的理性設(shè)計(jì)的應(yīng)用也越來(lái)越有效,通過(guò)比較不同來(lái)源同工酶的序列和結(jié)構(gòu)信息,能針對(duì)性地改造酶的催化特性和理化特性。有人提出假設(shè),酶的保守序列比非保守序列更有利于酶的穩(wěn)定性,因此將不影響蛋白活性的非保守氨基酸替換成保守氨基酸有利于提高酶的穩(wěn)定性。

    較基于實(shí)驗(yàn)和序列的傳統(tǒng)理性設(shè)計(jì)方法,計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)更加高效、合理,并具有廣泛適用性,已成為酶理性設(shè)計(jì)的主要研究方向。計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)是通過(guò)引入計(jì)算機(jī)算法對(duì)酶、配基、底物和溶劑分子等體系進(jìn)行分析、計(jì)算、模擬,在此基礎(chǔ)上精確預(yù)測(cè)和調(diào)控關(guān)鍵殘基,從而根據(jù)需要對(duì)酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行理性設(shè)計(jì)和改造。計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)同樣需要了解和利用酶的催化機(jī)理和規(guī)律,包括酶活性中心的底物結(jié)合口袋與底物的鎖鑰模型、酶催化等過(guò)渡態(tài)中間體理論等;研究還發(fā)現(xiàn)進(jìn)入底物口袋的通道形狀和大小對(duì)酶的活性和底物專一性有顯著影響。這些規(guī)律都能為酶的理性設(shè)計(jì)提供依據(jù),有助于在模擬結(jié)果中選擇最合適的突變體。Takwa等[44]通過(guò)理性設(shè)計(jì)對(duì)CALB的底物口袋進(jìn)行改造;發(fā)現(xiàn)底物口袋增大的突變體Q157A和Q157A/I189A/L278A有利于提高大體積底物丙交酯開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)速率,催化反應(yīng)活性提高了90 倍。Ema等[45]根據(jù)酶與底物過(guò)渡態(tài)結(jié)合模擬的結(jié)果,對(duì)洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶的手性選擇性進(jìn)行改造,通過(guò)修飾酶與R和S型底物的空間位阻獲得手性選擇性E值大于200的突變體I287F/I290A。Marton等[46]通過(guò)對(duì)脂肪酶CALB進(jìn)入活性中心的通道進(jìn)行改造,發(fā)現(xiàn)影響底物通道大小和形狀的氨基酸殘基的定點(diǎn)突變(L278V、I189A和A282L),都能影響脂肪酶對(duì)仲醇類底物的偏好性。理性設(shè)計(jì)的方向還包括德拜-沃勒因子對(duì)蛋白穩(wěn)定性的設(shè)計(jì),高級(jí)結(jié)構(gòu)中各種作用力對(duì)結(jié)構(gòu)的影響等。酶的計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)歷史并不長(zhǎng),目前已成功改造出許多高效的酶突變體。隨著生物信息學(xué)各類計(jì)算機(jī)算法和組合涌現(xiàn),酶工程將進(jìn)入信息時(shí)代。

    從頭設(shè)計(jì)成是新酶設(shè)計(jì)的一種手段,可以設(shè)計(jì)出自然界不存在的酶蛋白,甚至創(chuàng)造出能催化自然界不存在的反應(yīng)的酶[47-48]。從頭設(shè)計(jì)的基本思路如下:根據(jù)量子力學(xué)算法,設(shè)計(jì)酶和底物過(guò)渡態(tài)結(jié)構(gòu)并建立理論活性中心的模型;通過(guò)軟件從數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出現(xiàn)存的可能容納該理論活性中心的蛋白結(jié)構(gòu)骨架;將理論活性中心的關(guān)鍵殘基引入到篩選到的匹配蛋白骨架宿主中;進(jìn)一步根據(jù)催化反應(yīng)機(jī)理和過(guò)渡態(tài)理論,通過(guò)對(duì)相關(guān)氨基酸殘基的改造優(yōu)化活性中心和蛋白骨架在電子分布和立體結(jié)構(gòu)上的相容性;通過(guò)Rosetta energy經(jīng)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)設(shè)計(jì)酶進(jìn)行排序,選擇排名靠前的進(jìn)行基因克隆、重組表達(dá)以及功能和活性鑒定,獲得從頭設(shè)計(jì)的新酶;最后還能通過(guò)定向進(jìn)化等手段來(lái)進(jìn)一步改善設(shè)計(jì)酶的活性和穩(wěn)定性等。華盛頓大學(xué)Jiang Lin等[47]通過(guò)從頭設(shè)計(jì)獲得了能催化雙烯加成反應(yīng)的新酶;耶魯大學(xué)的Alexandrova等[49]也成功設(shè)計(jì)出能催化Kemp消除反應(yīng)的新酶。脂肪酶所屬的α/β水解酶包含多種酶類,為新脂肪酶的設(shè)計(jì)提供了有利的現(xiàn)實(shí)條件。

    從頭設(shè)計(jì)中的設(shè)計(jì)、優(yōu)化和篩選整套過(guò)程基本上都能在計(jì)算機(jī)上實(shí)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證部分較少,因此可以顯著降低實(shí)驗(yàn)成本。另外,酶的從頭設(shè)計(jì)非常有助于人們理解酶的催化機(jī)制,然而,人工設(shè)計(jì)酶普遍活性不高、設(shè)計(jì)成功率低。目前限制酶從頭設(shè)計(jì)發(fā)展的主要因素是對(duì)酶催化機(jī)制和構(gòu)效關(guān)系等信息的匱乏,隨著量子力學(xué)、分子力學(xué)、分子動(dòng)力學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物化學(xué)等多學(xué)科交叉的酶催化體系科學(xué)的建立,以及計(jì)算機(jī)技術(shù)和算法的飛速發(fā)展,酶的從頭設(shè)計(jì)將越來(lái)越可行。

    盡管理性設(shè)計(jì)獲得了許多成功的案例,但由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性以及相關(guān)生物信息的匱乏,人們對(duì)各種突變效應(yīng)和構(gòu)效關(guān)系尚缺乏一個(gè)有效的解釋機(jī)制,因而完全的理性設(shè)計(jì)成功率往往較低。半理性進(jìn)化是指在計(jì)算機(jī)模擬或?qū)嶒?yàn)結(jié)果的支持下,獲得可能的有益突變位點(diǎn),在定向進(jìn)化的基礎(chǔ)上引入理性設(shè)計(jì)的成分,構(gòu)建壓縮的突變文庫(kù),大大縮小了突變的庫(kù)容量,也避免了定向進(jìn)化策略的突變文庫(kù)量大、陽(yáng)性突率低、篩選效率低下等問(wèn)題[37]。另外,對(duì)于結(jié)構(gòu)信息了解有限的蛋白質(zhì),半理性設(shè)計(jì)結(jié)果更為高效和可靠。Koga等[50]利用組合飽和突變對(duì)Burkhorderia cepacia脂肪酶底物結(jié)合口袋的4 個(gè)位點(diǎn)氨基酸進(jìn)行半理性設(shè)計(jì)改造,篩選到對(duì)應(yīng)選擇性完全改變的突變體,從野生型的S型底物選擇性變?yōu)镽型選擇性。利用計(jì)算機(jī)輔助等理性設(shè)計(jì)方法對(duì)酶進(jìn)行分子改造,無(wú)疑是蛋白質(zhì)工程的重要發(fā)展方向。

    4 脂肪酶固定化和優(yōu)化

    4.1 脂肪酶固定化方法

    酶的催化體系包括催化劑、底物、產(chǎn)物以及反應(yīng)媒介。蛋白質(zhì)工程是對(duì)生物催化劑酶的改良手段之一,其他手段同樣也能對(duì)酶的催化性質(zhì)等進(jìn)行改良,如脂肪酶的固定化、酶的化學(xué)修飾等。固定化對(duì)脂肪酶應(yīng)用非常重要,不僅因?yàn)榕c酶粉比較,固定化酶具有傳質(zhì)效率高,穩(wěn)定性高,有利于酶回收、再利用和產(chǎn)品純化等討論較多的益處[51-52],而且可能顯著增加酶的催化活性,尤其是在非水相系統(tǒng),這可能歸因于脂肪酶固定化能夠改變酶的構(gòu)象,使其處于激活的狀態(tài)[53-54]。最常見(jiàn)的脂肪酶固定化方法有4 類:吸附法、共價(jià)法、包埋法和交聯(lián)法。其中,吸附法因其操作簡(jiǎn)單,能顯著增強(qiáng)脂肪酶活性而在脂肪酶固定化領(lǐng)域應(yīng)用最多[53,55]。吸附法主要通過(guò)物理或化學(xué)過(guò)程將酶裝載到載體顆粒上將酶固定。脂肪酶的吸附固定化載體需要一定的作用力維持,常見(jiàn)的吸附方式包括疏水作用力、離子相互作用等。因?yàn)楣潭ɑd體對(duì)脂肪酶固定化效果起著決定性作用,因此對(duì)脂肪酶吸附法固定化的研究主要集中在固定化材料方面,包括樹(shù)脂類型、顆粒大小、孔徑大小、形狀、機(jī)械強(qiáng)度、親疏水性、官能團(tuán)種類等[56]。共價(jià)法是指酶蛋白分子基團(tuán)和固定化材料表面的基團(tuán)之間以化學(xué)反應(yīng)形成共價(jià)鍵而相互結(jié)合,形成固定化酶的方式[57]。共價(jià)結(jié)合法形成的固定化酶結(jié)合牢固,在劇烈的反應(yīng)條件下也不會(huì)因發(fā)生酶和載體分離而導(dǎo)致酶泄漏或釋放,具有強(qiáng)的穩(wěn)定性且能多次重復(fù)使用[58]。但是酶蛋白分子上的共價(jià)修飾可能引起脂肪酶結(jié)構(gòu)和功能的改變,導(dǎo)致酶活性和催化效率的下降。另外,酶蛋白上能供選擇的被共價(jià)修飾的基團(tuán)非常有限,也阻礙了共價(jià)結(jié)合在脂肪酶固定化上的應(yīng)用。包埋法是在聚合劑的作用下,在聚合物單體聚合成多聚物高分子的過(guò)程中,將酶蛋白包埋在聚合物的固定化方法[59]。由包埋法固定的脂肪酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,酶分子不會(huì)泄漏,但是反應(yīng)體系中底物與酶接觸困難,傳質(zhì)效率很低。交聯(lián)法指通過(guò)雙功能或多功能的交聯(lián)劑(如戊二醛)使酶蛋白通過(guò)共價(jià)鍵間接交聯(lián)的酶固定化方法[60]。交聯(lián)酶屬于無(wú)載體固定化酶,類似的固定化酶還有交聯(lián)酶聚集體以及交聯(lián)酶晶體。因?yàn)闊o(wú)載體固定化酶顆粒主體為酶蛋白,相較于載體固定化酶具有較高的比酶活力;但制作過(guò)程較為繁瑣,且顆粒較小,導(dǎo)致回收困難,通常該方法與其他固定化方法結(jié)合使用[53]。

    4.2 新型脂肪酶固定化技術(shù)

    酶固定化后催化活性降低可能是因?yàn)槊冈诠潭ɑd體上無(wú)序排列和附著使酶的催化活性位點(diǎn)無(wú)法接觸到底物,酶的定向固定化技術(shù)是基于上述假設(shè)提出。酶的定向固定化可使酶蛋白活性中心背離載體的干擾,降低與底物分子結(jié)合的空間位阻,從而提高酶催化效率。Godoy等[61]利用定向固定化技術(shù)獲得定向的固定化Geobacillus thermocatenulatus脂肪酶,這些脂肪酶的對(duì)映體選擇性大幅提高。

    細(xì)胞表面展示技術(shù)也能用于脂肪酶的固定化,不同的是載體是微生物細(xì)胞。細(xì)胞表面展示脂肪酶的研究有許多,還有在同一宿主上共展示不同脂肪酶,以提高催化底物的范圍[37]。表面展示技術(shù)的難點(diǎn)是開(kāi)發(fā)兼容性好的細(xì)胞表面錨定蛋白,將目的蛋白高效地展示在細(xì)胞表面。表面展示的脂肪酶和全細(xì)胞催化在生物柴油的合成等領(lǐng)域的應(yīng)用研究正在開(kāi)展,具有良好的應(yīng)用前景,但離工業(yè)化應(yīng)用還有較大差距。

    4.3 脂肪酶制劑化因素優(yōu)化

    酶固定化和其他制劑化過(guò)程對(duì)酶制劑質(zhì)量也有很大影響,如冷凍干燥過(guò)程中加入酶的保護(hù)劑蔗糖、氨基酸、鹽和多元醇等,可最大程度保持酶的結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定。冷凍保護(hù)劑在凍干過(guò)程中能取代水分子與酶蛋白形成氫鍵以保持酶的構(gòu)象,保護(hù)劑的極性也能對(duì)酶蛋白結(jié)構(gòu)的改變和酶活損失進(jìn)行改善。另外,脂肪酶的界面激活效應(yīng)使酶具有兩種形態(tài),通過(guò)分子印跡的手段能使脂肪酶保持在激活的狀態(tài),因?yàn)榫哂蟹肿佑≯E作用的表面活性劑分子具有兩親基團(tuán),類似于油-水界面,使脂肪酶的蓋子結(jié)構(gòu)從活性中心上方打開(kāi)。而有機(jī)溶劑中的剛性環(huán)境很難讓脂肪酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變換,從而保留了脂肪酶這種有利于催化的活性狀態(tài)。同樣,凍干過(guò)程中的緩沖液的pH值和離子強(qiáng)度也會(huì)影響最終酶制劑的催化效率。脂肪酶在有機(jī)溶劑中的最適pH值與在水相中的基本一致,在制劑化過(guò)程中保持原有的最佳離子化狀態(tài),有利于提高最終催化劑的活性,在非水相剛性環(huán)境中,酶的結(jié)構(gòu)能持續(xù)保持在適合催化的狀態(tài)。

    我國(guó)工業(yè)和信息化部于2016年7月18日發(fā)布《工業(yè)綠色發(fā)展規(guī)劃(2016—2020年)》,意味著我國(guó)對(duì)環(huán)境保護(hù)的重視和舉措又上新的臺(tái)階,因此迫切需要加快綠色工業(yè)制造體系的發(fā)展。酶制劑作為綠色生物催化劑,在食品、藥品、能源、環(huán)保和農(nóng)業(yè)技術(shù)等多個(gè)領(lǐng)域的需求和關(guān)注與日俱增。脂肪酶是酶制劑中效率第三的酶類,但商業(yè)化脂肪酶制劑的進(jìn)一步工業(yè)化應(yīng)用一直受生產(chǎn)和使用成本的限制。本文從新型微生物脂肪酶制劑資源的挖掘出發(fā),綜述現(xiàn)有的脂肪酶研發(fā)途徑和重點(diǎn)方向,主要包括產(chǎn)脂肪酶微生物的環(huán)境篩選、宏基因組篩選挖掘新的具有優(yōu)良特性的脂肪酶、脂肪酶微生物生產(chǎn)菌株的誘變育種和改良、脂肪酶基因在重組工程菌株中的重組表達(dá)和優(yōu)化、蛋白質(zhì)工程方法對(duì)脂肪酶蛋白進(jìn)行改造以及脂肪酶固定化和催化工藝的改良等,對(duì)脂肪酶制劑和其他酶制劑的開(kāi)發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義。

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