人參皂苷Rg5通過下調(diào)Bcl-2蛋白促進(jìn)食管癌Eca-109細(xì)胞凋亡

張道明,張 奇,劉林林,任 輝

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130041)

食管癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，具有較高的致死率，每年導(dǎo)致超過40萬人死亡,是消化系統(tǒng)中僅次于胰腺癌的難治性惡性腫瘤[1]。目前的主要治療方法包括手術(shù)治療，放療，化療和靶向治療。手術(shù)切除仍是其主要治療方法，但5年總生存率僅為30%左右，其中約20%-50%歸因于鱗狀細(xì)胞癌[2]。傳統(tǒng)的化療藥物對(duì)于食管癌的治療作用不理想，近幾十年隨著順鉑和氟尿嘧啶類衍生物、奈達(dá)鉑、希羅達(dá)、伊立替康等新藥的應(yīng)用，為食管癌的化療提供了更多的可選擇方案，在臨床應(yīng)用中起到了一定積極作用。

近年來中藥在惡性腫瘤防治方面的價(jià)值得到認(rèn)可。有學(xué)者根據(jù)不同癥型配置個(gè)體的中藥湯劑應(yīng)用于患者的輔助治療中，起到了增加療效、減輕副作用、改善生存質(zhì)量等作用[3,4]。目前已經(jīng)上市的中藥有參一膠囊、康萊特注射液、消癌平、鴉膽子油等，在臨床應(yīng)用中也取得了可喜的療效。人參皂苷Rg5是從人參中分離出來的新型人參皂苷，在腫瘤治療中具有巨大潛力。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)觀察其對(duì)于食管癌細(xì)胞的影響并研究相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和藥物選取食管癌高分化鱗狀細(xì)胞Eca-109進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。人參皂苷Rg5購至上海源葉生物科技有限公司，分子式為C42H70O12，經(jīng)純度驗(yàn)證為99.3%。

1.2主要試劑和儀器RPMI 1640培養(yǎng)基購于Hyclone 公司，胎牛血清購至NQBB公司。CCK8 試劑盒來自日本同仁化學(xué)研究所，Annexin V/FITC凋亡試劑盒購于康潤(rùn)生物試劑有限公司。彩色預(yù)染蛋白質(zhì)marker和RIPA裂解液使用全式金生物試劑有限公司，BCA蛋白定量試劑盒購至索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品。兔抗人C-caspase 3，9、C-parp多克隆抗體以及Bax、Bcl-2多克隆抗體來自美國Cell Signaling Technology公司。酶標(biāo)抗兔二抗來自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)在100 mm的培養(yǎng)皿中用含有1%的青霉素鏈霉素雙抗和10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)，在37℃含5%二氧化碳的恒溫箱中培育。傳代時(shí)首先棄去培養(yǎng)基，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗2次，加入2 ml 0.25%的胰酶，在37℃恒溫箱中消化3-5分鐘，待可觀察到細(xì)胞與細(xì)胞之間有針孔樣縫隙時(shí)棄去胰酶，加入4 ml培養(yǎng)基，用槍頭吹打重懸細(xì)胞。收集細(xì)胞于離心管中，離心后棄去上清，重新加入6 ml培養(yǎng)基，按照1∶2—1∶4 比例傳代于新培養(yǎng)皿中。

1.4CCK8檢測(cè)細(xì)胞抑制率將Eca-109細(xì)胞重懸后將濃度調(diào)節(jié)至4×104/ml，以每孔100 μl的量接種于96孔板中，恒溫孵育箱中孵育24小時(shí)。設(shè)置人參皂苷Rg5藥物濃度為：16 μmol/L、8 μmol/L、4 μmol/L、2 μmol/L、1 μmol/L、0.5 μmol/L；每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)副孔并且設(shè)置不加藥物的對(duì)照組和不含細(xì)胞的空白組。恒溫孵育24小時(shí)后在每孔加入10 μl CCK8試劑，孵育2-4小時(shí)。之后在酶標(biāo)儀上450 nm處讀取吸光度OD值。細(xì)胞抑制率計(jì)算公式：細(xì)胞抑制率=(對(duì)照組OD-加藥組OD)/(對(duì)照組OD-空白組OD)×100%。并利用SPSS軟件計(jì)算人參皂苷Rg5的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.5AnnexinV/FITC雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡設(shè)置以下分組：對(duì)照組(不加藥)、低濃度組(5 μmol/L Rg5)、中濃度組(10 μmol/L Rg5)和高濃度組(20 μmol/L Rg5)。藥物作用24小時(shí)后收集細(xì)胞，用已稀釋的1×緩沖液將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)大約(1-5)×106/ml，并取100 μl置入流式管中，加入5 μl Annexin V/FITC充分混合，避光孵育5分鐘之后加入10 μl 20 μg/ml的PI和400 μl的PBS，立刻通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.6Westernblot法檢測(cè)蛋白變化按照同上分組處理細(xì)胞，24小時(shí)后收集細(xì)胞，進(jìn)行總蛋白提取并使用BCA法確定蛋白濃度進(jìn)行定量。進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，之后通過濕轉(zhuǎn)的方法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，使用5%脫脂奶粉封閉2小時(shí)。加入C-caspase3、C-caspase9、C-parp、Bcl-2、Bax對(duì)應(yīng)的稀釋多克隆抗體，4℃過夜孵育。洗膜后加入二抗搖床孵育1小時(shí)。再次洗膜后通過顯色儀器進(jìn)行ECL顯影。Imagine J軟件測(cè)量條帶灰度值，并以目的蛋白和β-actin積分光密度比值作為蛋白相對(duì)量進(jìn)行比較。

1.7統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行表示。 統(tǒng)計(jì)處理使用SPSS 22.0軟件。單因素方差分析比較組間差異，兩組比較運(yùn)用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)結(jié)果P<0.05即有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1人參皂苷Rg5抑制Eca-109細(xì)胞增殖結(jié)果得出人參皂苷Rg5抑制Eca-109細(xì)胞增殖，并呈劑量依賴性。通過SPSS軟件計(jì)算，人參皂苷Rg5的IC50為8.74 μmol/L，如圖1。

圖1 人參皂苷Rg5對(duì)食管癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

2.2人參皂苷Rg5促進(jìn)Eca-109細(xì)胞凋亡通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡得出：空白組細(xì)胞凋亡率為(3.87±2.24)%，且Rg5低濃度組為(11.37±3.52)%，中濃度組為(23.68±3.18)%，高濃度組為(32.17±4.54)%，均高于對(duì)照組(P<0.05)?？傻贸鋈藚⒃碥誖g5可促進(jìn)Eca-109細(xì)胞凋亡，并與藥物劑量正向相關(guān)，如圖2和表1。

表1 各組細(xì)胞凋亡率

注：*表示與對(duì)照組相比，P<0.05；

2.3人參皂苷Rg5導(dǎo)致caspase家族蛋白變化通過蛋白印跡法分析結(jié)果提示處理后細(xì)胞中剪切活化的caspase 3、9表達(dá)量隨著藥物濃度升高而升高，同時(shí)caspase家族的下游效應(yīng)蛋白C-parp也明顯增多，如圖3。

圖2 各組細(xì)胞凋亡流式圖

注：*表示與對(duì)照組相比，P<0.05；

2.4人參皂苷Rg5導(dǎo)致細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)下降Western blot法檢測(cè)蛋白結(jié)果提示，Bcl-2家族中的促凋亡蛋白Bax沒有明顯變化，抑制凋亡蛋白Bcl-2降低，因此人參皂苷Rg5導(dǎo)致 Bcl-2/Bax比值下降，且統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異(P<0.05)，如圖4。

注：*表示與對(duì)照組相比，P<0.05；

3 討論

人參是中國珍貴的中草藥，人參皂苷是其發(fā)揮藥理作用主要的成分。相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)人參皂苷通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。據(jù)報(bào)道，人參提取物JRS-15可通過線粒體途徑促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的凋亡[5]。人參皂苷Rg3誘導(dǎo)人膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡作用和MEK信號(hào)通路調(diào)控有關(guān)[6]。本實(shí)驗(yàn)通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg5對(duì)于食管癌細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制生長(zhǎng)的作用，同時(shí)對(duì)于食管癌細(xì)胞有明顯的促凋亡作用。

Bcl-2家族蛋白在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡等生物學(xué)行為有重要作用，根據(jù)功能和結(jié)構(gòu)的不同主要分為促凋亡蛋白Bax、Bad、Bid等和抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x等，其中Bcl-2和Bax的相對(duì)含量決定著細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)與否。正常情況下，兩者結(jié)合為異源二聚體，Bax抑制細(xì)胞凋亡進(jìn)程。當(dāng)細(xì)胞接受到凋亡信號(hào)刺激后，Bax表達(dá)量增高，Bcl-2表達(dá)量受到抑制，同時(shí)Bax聚集到線粒體膜上形成同源二聚體，導(dǎo)致氧化磷酸化破壞、線粒體膜通透性降低和DNA合成障礙等生化行為，同時(shí)參與caspase家族生物學(xué)活動(dòng)[7]。到本實(shí)驗(yàn)中，我們將被不同濃度的人參皂苷Rg5處理過的細(xì)胞進(jìn)行蛋白提取并進(jìn)行Western blot方法檢測(cè)蛋白，結(jié)果提示人參皂苷Rg5處理后細(xì)胞中剪切活化的caspase 9、3和C-parp表達(dá)量明顯升高，同時(shí)Bcl-2家族中的促凋亡蛋白Bax沒有明顯變化而Bcl-2表達(dá)量明顯降低。這說明人參皂苷Rg5對(duì)于食管癌細(xì)胞的促凋亡作用和Bcl-2家族蛋白中抑制凋亡蛋白Bcl-2的下調(diào)有關(guān)。

綜上所述，人參皂苷Rg5處理食管癌細(xì)胞Eca-109后可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，并且凋亡相關(guān)蛋白C-caspase 9、C-caspase3和C-parp表達(dá)升高，進(jìn)一步證實(shí)了凋亡行為的發(fā)生。同時(shí)凋亡的發(fā)生和下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2有關(guān)。后續(xù)將進(jìn)行其他類型腫瘤的作用以及相關(guān)機(jī)理的研究，為人參皂苷Rg5作為新型抗腫瘤藥物的可行性提供更多理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]李 克，于 萍，朱遠(yuǎn)鋒，等.中國南方沿海食管癌高發(fā)區(qū)危險(xiǎn)因素研究：吸煙作用[J].腫瘤，2002，22(2)：96.

[2]Zhang SW,Zheng RS,Zuo TT,et al.Mortality and survival analysis of esophageal cancer in China [J].Chin J Oncol,2016,38 (9):709.

[3]宋國平,李雯燕,郭平華,等.自擬滋陰解毒方治療食管癌放射損傷58例[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2008,15(3):74.

[4]趙 軍,陳桂珍,蒙家祥,等.艾迪注射液聯(lián)合同步放化療治療食管癌[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2011,19(11):2211.

[5]Sun C,Guo XX,Zhu D,et al.Apoptosis is induced in cancer cells via the mitochondrial pathway by the novel xylocydine-derived compound JRS-15[J].International Journal of Molecular Sciences,2013,14(1):850.

[6]Choi YJ,Lee HJ,Kang DW et al.Ginsenoside Rg3 induces apoptosis in the U87MG human glioblastoma cell line through the MEK signaling pathway and reactive oxygen species[J].Oncology Reports,2013，30(3):1362.

[7]Schafer B,Quispe J,Choudhary V,et al.Mitochondrial outer membrane proteins assist Bid in Bax-mediated lipidic pore formation [J].Mol Biol Cell,2009,20 (8):2276.