ApoC3基因高表達(dá)對(duì)小鼠急性胰腺炎嚴(yán)重程度的影響

姚瑤 林堃 莊璐 滿曉華 金晶 吳洪玉 龔燕芳 紀(jì)保安 黃浩杰 李兆申

近年來(lái)高三酰甘油血癥(hypertriglyceridemia,HTG)作為誘發(fā)急性胰腺炎(AP)的重要致病因素越來(lái)越受到重視。HTG型AP患者合并肝、腎、肺等其他重要臟器損傷的概率大大增加，可能導(dǎo)致重癥急性胰腺炎，預(yù)后較差，且復(fù)發(fā)率也更高[1-3]。載脂蛋白C(apolipoprotein C,ApoC)是血漿中一種水溶性低分子量蛋白質(zhì)，在脂蛋白代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其中ApoC3含量最為豐富。ApoC3高表達(dá)可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的脂蛋白酯酶活性及肝臟對(duì)富含三酰甘油的脂蛋白殘?bào)w的攝取，導(dǎo)致HTG[4]。目前有研究[5]證明ApoC3轉(zhuǎn)基因小鼠的血漿三酰甘油水平明顯高于同齡野生型小鼠。本研究以ApoC3轉(zhuǎn)基因小鼠建立HTG模型，采用雨蛙素腹腔注射法誘發(fā)AP，探討ApoC3基因與血漿三酰甘油水平及AP之間的相互關(guān)系，為研究AP的發(fā)生機(jī)制提供方向。

材料與方法

一、材料與試劑

雄性C57BL/6J小鼠由第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，雄性ApoC3轉(zhuǎn)基因小鼠由北京大學(xué)心血管研究所提供。所有小鼠均為8～10周齡，體重約20 g，在12 h/12 h光照周期下飼養(yǎng)于第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，自由進(jìn)食及飲水。血漿三酰甘油測(cè)定試劑盒購(gòu)于北京中生北控生物科技公司。RNA Trizol提取液、Reverse Transcript試劑盒、SYBR?Green PCR試劑盒均購(gòu)于TAKARA公司。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

二、動(dòng)物分組及模型制備

12只C57BL/6J小鼠和12只ApoC3轉(zhuǎn)基因小鼠均隨機(jī)分為對(duì)照組及AP組，每組6只。采用腹腔注射雨蛙素50 μg/kg體重10次、每次間隔1h的方法建立小鼠AP模型，以腹腔注射生理鹽水小鼠作為對(duì)照組。于第1次注射雨蛙素24 h后處死小鼠，取胰腺組織，置10%甲醛溶液固定。

三、血清三酰甘油及膽固醇水平測(cè)定

C57BL/6J和ApoC3轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M小鼠在處死前行眶靜脈取血，肝素抗凝，3 000 r/min離心15 min，取血清，測(cè)定血清三酰甘油及膽固醇水平，按試劑盒說(shuō)明書操作。

四、胰腺組織病理學(xué)檢查

取固定的胰腺組織行常規(guī)病理學(xué)檢查，根據(jù)高倍鏡下觀察到的胰腺組織水腫、出血、壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等情況評(píng)估炎癥的嚴(yán)重程度[6]。

五、胰腺組織炎癥因子表達(dá)檢測(cè)

應(yīng)用Trizol試劑提取胰腺組織總RNA，按RT-PCR試劑盒說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄合成cNDA，再以cNDA為模板，按照SYBR Premix EX Taq試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。IL-1β上游引物為5′-AGAGCATCCAGCTTCAAATCTC-3′，下游引物為5′-CAGTTGTCTAATGGGAACGTCA-3′；IL-6上游引物為5′-GTTGCCTTCTTGGGACTGATG-3′，下游引物為5′-ATTGCCATTGCACAACTCTTT-3′；α-SMA上游引物為5′-ATGACCCAGATTATGTTTGAGACC-3′，下游引物為5′-CCAGAGTCCAGCACAATACCA-3′；TNF-α上游引物為5′-TTAGAAAGGGGATTATGGCTCA-3′，下游引物為5′-ACTCTCCCTTTGCAGAACTCAG-3′；內(nèi)參RPS6上游引物為5′-GATGATGTCCGCCAGTATGTT-3′，下游引物為5′-TTGTTCTTCTTAGTGCGTTGC-3′。每個(gè)組織樣本做2個(gè)復(fù)孔，通過(guò)LightCycler 480 system用最大二階導(dǎo)數(shù)法的高置信度算法獲得Ct值。以RPS6為對(duì)照，用相對(duì)定量分析法計(jì)算各炎癥因子mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、小鼠血清三酰甘油和膽固醇含量

ApoC3轉(zhuǎn)基因小鼠的血清三酰甘油水平為(3.434±0.931)mmol/L，膽固醇含量為(2.553±0.178)mmol/L，明顯高于C57BL/6J小鼠的三酰甘油水平[(0.766±0.120)mmol/L]及膽固醇含量[(1.996±0.08)mmol/L]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.245，P=0.03；t=2.494，P=0.026)。

二、小鼠胰腺組織病理學(xué)表現(xiàn)

肉眼見(jiàn)對(duì)照組的C57BL/6J小鼠和ApoC3轉(zhuǎn)基因小鼠胰腺均呈淡粉紅色，薄片狀，顏色均勻一致，光澤度好，無(wú)水腫及出血。AP組C57BL/6J小鼠胰腺呈淡粉紅色，輕度水腫，稍有出血，與周圍臟器部分粘連，AP組ApoC3轉(zhuǎn)基因小鼠胰腺顏色晦暗，水腫明顯，可見(jiàn)片狀出血，與胰腺周圍臟器有粘連。

光鏡下見(jiàn)AP組C57BL/6J小鼠胰腺輕度水腫，局灶性腺泡細(xì)胞壞死，小葉間隙增寬，小葉間及壞死灶內(nèi)有炎細(xì)胞浸潤(rùn)；AP組ApoC3轉(zhuǎn)基因小鼠胰腺明顯水腫，小葉間隙增寬、結(jié)構(gòu)紊亂，腺泡細(xì)胞局限性或廣泛性壞死，小葉間及壞死灶內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。對(duì)照組C57BL/6J和ApoC3轉(zhuǎn)基因小鼠胰腺形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)完好，未見(jiàn)明顯病理改變(圖1)。

圖1 各組小鼠胰腺組織的病理學(xué)改變(HE ×200)。1A：C57BL/6J小鼠對(duì)照組；1B：ApoC3轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)照組；1C：C57BL/6J小鼠AP組；1D：ApoC3轉(zhuǎn)基因小鼠AP組

三、小鼠胰腺組織炎癥因子mRNA的表達(dá)

AP組ApoC3轉(zhuǎn)基因小鼠胰腺組織IL-1β、IL-6、α-SMA mRNA表達(dá)量顯著高于C57BL/6J小鼠AP組(1.72±0.07比0.78±0.09、1.58±0.09比0.87±0.04、0.83±0.05比0.44±0.04)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，而TNF-α mRNA表達(dá)量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.70±0.09比0.65±0.08，P>0.05)。對(duì)照組ApoC3轉(zhuǎn)基因小鼠與C57BL/6J小鼠IL-1β(0.80±0.10比0.65±0.09)、IL-6 (0.93±0.09比0.89±0.11)、TNF-α(0.76±0.09比0.69±0.10)、α-SMA(0.58±0.07比0.61±0.08)mRNA表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。

討 論

HTG主要由富含三酰甘油脂蛋白(triglyceride-rich lipoproteins, TRLs)的代謝障礙引起[7]。ApoC3抑制水解TRLs的三酰甘油的脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase, LPL)活性引起血漿三酰甘油水平升高[8]。近年來(lái)有研究報(bào)道該基因的變異與動(dòng)脈粥樣硬化、脂肪肝、糖尿病、腹主動(dòng)脈瘤等HTG相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系[9-11]。臨床重癥急性胰腺炎患者通常有起病急、發(fā)病快、并發(fā)癥多、死亡率高的特點(diǎn)，據(jù)臨床統(tǒng)計(jì)有相當(dāng)一部分患者合并HTG，但其具體發(fā)病機(jī)制尚未闡述清楚[12]。

本研究通過(guò)雨蛙素腹腔注射法構(gòu)建ApoC3轉(zhuǎn)基因小鼠HTG型AP，結(jié)果顯示，與C57BL/6J小鼠相比，ApoC3轉(zhuǎn)基因小鼠的AP病理改變更加明顯，炎癥因子IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)水平均顯著升高，表明ApoC3轉(zhuǎn)基因小鼠在雨蛙素誘導(dǎo)后發(fā)生的AP更加嚴(yán)重。

[1] Sans MD, DiMagno MJ, D′Alecy LG, et al. Caerulein induced acute pancreatitis inhibits protein synthesis through effects on eIF2B and eIF4F [J]. Am J Physio Gastrointest Liver Physiol, 2003, 285(3): G517-G528.

[2] Wang Y, Sternfeld L, Yang F, et al. Enhanced susceptibility to pancreatitis in severe hypertriglyceridaemic lipoprotein lipase deficient mice and agonist-like function of pancreatic lipase in pancreatic cells [J]. Gut, 2009, 58(3): 422-430.

[3] Tonsi AF, Bacchion M, Crippa S, et al. Acute pancreatitis at the beginning of the 21st century: the state of the art[J]. World J Gastroenterol, 2009, 15(24): 2945-2959.

[4] Zheng C. Updates on apolipoprotein CIII: fulfilling promise as a therapeutic target for hypertriglyceridemia and cardiovascular disease[J]. Curr Opin Lipidol, 2014, 25(1):35-39.

[5] Yao Z, Wang Y. Apolipoprotein C-III and hepatic triglyceride-rich lipoprotein production[J]. Curr Opin Lipidol, 2012, 23(3):206-212.

[6] Singh VK, BU Wu, TL Bollen, et al. A prospective evaluation of the bedside index for severity in acute pancreatitis score in assessing mortality and intermediate markers of severity in acute pancreatitis[J]. Am J Gastroenterol, 2009, 104(4): 966-971.

[7] Alato-Setala K, Fisher EA, Chen X,et al. Mechanism of hypertriglyceridemia in human apolipoprotein (apo)cIII transgenic mice[J]. J Clin Incest, 1992, 90(5):1889-1990.

[8] Pollin TI, Damcott CM,Shen HQ,et al. A null mutation in human APOC3 confers a favorable plasma lipid profile and apparent cardioprotection [J].Science,2008,322(7):1702-1705.

[9] Reaven GM, Mondon CE, Chen YD, et al. Hypertriglyceridemic mice transgenic for the human apolipoprotein C-III gene are neither insulin resistant nor hyperinsulinemic [J]. J Lipid Res, 1994, 35(5): 820 824.

[10] Wyler Ballmoos MC, Haring B, Sacks FM. The risk of cardiovascular events with increased apolipoprotein CIII: a systematic review and meta-analysis [J].J Clin Lipidol, 2015, 9(4):498-510.

[11] Crosby J, Peloso GM, Auer PL, et al. Loss-of-function mutation in APOC3, triglycerides, and coronary disease [J]. N Engl J Med, 2014, 371(1):22-31.

[12] Navina S, Acharya C, Delany JP, et al. Lipotoxicity causes multisystem organ failure and exacerbates acute pancreatitis in obesity[J]. Sci Transl Med,2011, 3(107):107ra110.