生姜梨酒的研制及香味成分分析

田學(xué)梅，鄧 杰，2，鐘姝霞，曾智娟，衛(wèi)春會，2*，黃治國，2，黃喬韻

（1.四川理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000；2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 自貢 643000；3.四川源坤國科質(zhì)量檢驗(yàn)有限公司，四川 成都 610000）

果酒是以水果為原料經(jīng)過破碎、壓榨取汁、發(fā)酵和調(diào)配等工藝釀造而成的低度飲料酒[1-2]。在我國，果酒僅占飲料酒的1%左右，與世界人均年消費(fèi)量相差甚遠(yuǎn)。雖然國家正加大力度發(fā)展果酒產(chǎn)業(yè)，但除葡萄果酒外其他果酒的市場占有率極低。

梨在中國分布較廣，被營養(yǎng)學(xué)家譽(yù)為“功能食品”；姜是重要的烹飪調(diào)味料之一。梨味甘性涼，姜味辣性溫，將其復(fù)合釀造成生姜梨酒既汲取了梨中的營養(yǎng)物質(zhì)，富含豐富的維生素和氨基酸；又汲取了生姜中的姜油酮和辛辣成分，可增強(qiáng)人體內(nèi)分泌，提高免疫功能。生姜梨酒的研制還提高了我國梨和生姜資源的利用率，拓寬了梨酒釀造的方向，具有較好的市場前景。

目前，因頂空-固相微萃?。╤ead-space solid phase microextraction，HS-SPME）技術(shù)結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-massspectrometry，GC-MS）分析具有敏感、快速、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)[3-4]，已被廣泛應(yīng)用于食品的風(fēng)味物質(zhì)研究[5]?？得鼷惖萚6-7]均以固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析果酒及果醋中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，而對梨酒尚未有報(bào)道。

本研究以梨和生姜為原料，對生姜梨酒的釀造工藝進(jìn)行研究與優(yōu)化，并對其香氣成分進(jìn)行分析，旨在研制出健康、優(yōu)質(zhì)，符合消費(fèi)者口味的生姜梨酒，豐富果酒的種類及選擇，促進(jìn)梨果的深加工利用及梨酒市場的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梨、生姜和白砂糖：市售；葡萄酒果酒酵母：釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

抗壞血酸、偏重亞硫酸鉀、葡萄糖、檸檬酸、殼聚糖（分析純）：成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975B氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司；HT300A固相微萃取儀：意大利HTA公司；1500型全波長酶標(biāo)儀：美國Thermo公司；LS55型熒光分光光度計(jì)：美國Perkin Elmer公司；MJ-25BM05C型榨汁機(jī)：廣東美的精品電器有限公司；WYT-ⅡA型手持式糖量計(jì)折射儀：成都格納絲商貿(mào)有限公司；DM3000型正置生物顯微鏡：德國Leica公司；XMT-100C型恒溫培養(yǎng)箱：重慶市永生實(shí)驗(yàn)儀器廠；Bioflo310發(fā)酵罐：德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 生姜梨酒生產(chǎn)工藝流程

1.3.2 操作要點(diǎn)

原料預(yù)處理：挑選成熟度高，無霉變，外表無損傷的梨為宜，挑選時(shí)盡量選擇萼洼較深的，萼洼深的梨含水量及含糖量都比較高；生姜挑選無霉變的老姜，用清水清洗去泥，然后削皮切片備用。用清水清洗梨，然后削皮，剔除果眼，去芯，切成長寬約2 cm的方塊，于護(hù)色液（0.2%檸檬酸+0.1%抗壞血酸）中浸泡5 min，對果肉進(jìn)行護(hù)色，防止果汁褐變；向果汁中添加90 mg/L偏重亞硫酸鉀，進(jìn)行SO2處理，殺菌或抑制雜菌活動(dòng)。

成分調(diào)整：梨汁發(fā)酵的糖度應(yīng)調(diào)整在20%～22%為宜，具體應(yīng)由成品酒酒精度的要求而定，為了使最終發(fā)酵酒酒精度滿足需求，可以添加一定量的白砂糖來調(diào)節(jié)糖度，分別利用乳酸和碳酸鈣來調(diào)節(jié)pH，使之成為酵母適宜生長的環(huán)境。

主發(fā)酵：將種子液按8%～10%的比例加入發(fā)酵液，搖勻，密封，靜置發(fā)酵，溫度控制在28～30℃，直至發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵期間，每天振蕩1次，使發(fā)酵液溫度均勻，并每隔1 d對糖度和酒精度進(jìn)行測定。

后發(fā)酵：將過濾換罐后的生姜梨酒置于陰涼通風(fēng)處（15～20℃）進(jìn)行后發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為8 d左右。

滅菌、陳釀：后發(fā)酵結(jié)束后，將生姜梨酒以65℃滅菌30 min，滅菌后靜置冷卻至室溫。過濾后轉(zhuǎn)入經(jīng)刷洗和殺菌處理后的貯酒容器中進(jìn)行陳釀，陳釀期間品溫控制在6～8℃，陳釀時(shí)間為15 d左右。新酒在陳釀期間需進(jìn)行換罐，使清酒與酒腳及時(shí)分離，防止酒腳給原酒帶來異味。

澄清：采用自然沉淀法。將果酒置于密閉容器中，再冷藏一段時(shí)間保持靜止?fàn)顟B(tài)，待果酒中的懸浮物逐漸沉降下來后，將果酒上清液轉(zhuǎn)移到新的容器，以得到澄清透明的果酒。

1.3.3 試驗(yàn)方法設(shè)計(jì)[11-12]

（1）單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

生姜與梨比例的確定：將生姜與梨汁按照1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50的質(zhì)量比進(jìn)行配比，初始糖度為20%，接種8%種子液到生姜梨汁配比的發(fā)酵液中，置于28～30℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后酒精度和感官評定來確定最適比例。

初始糖度的確定：取適量梨汁加入白砂糖，調(diào)整初始糖度分別為18%、19%、20%、21%、22%，接種8%種子液到不同初始糖度的發(fā)酵液中，置于28～30℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后以酒精度和感官評定來確定最適初始糖度。

酵母接種量的確定：調(diào)整發(fā)酵液含糖量為20%，分別接種6%、7%、8%、9%、10%種子液，置于28～30℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后以酒精度和感官評定來確定最適酵母接種量。

初始pH的確定：調(diào)整發(fā)酵液含糖量為20%，接種8%種子液，分別調(diào)整pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，置于28～30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后以酒精度和感官評定來確定最適初始pH值。

發(fā)酵時(shí)間的確定：調(diào)整發(fā)酵液含糖量為20%，接種8%種子液，發(fā)酵時(shí)間分別控制為6 d、7 d、8 d、9 d、10 d，置于28～30℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后以酒精度、殘?zhí)橇亢透泄僭u定來確定最佳發(fā)酵時(shí)間。

（2）正交試驗(yàn)優(yōu)化

基于單因素試驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)計(jì)L9（33）正交試驗(yàn)，研究酵母接種量、初始糖度、初始pH值對生姜梨酒品質(zhì)的影響，以酒精度作為評價(jià)指標(biāo)，同時(shí)結(jié)合感官評定確定最佳發(fā)酵條件。正交試驗(yàn)因素水平如表1所示。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

1.3.4 測定方法

（1）果酒理化指標(biāo)的測定

酒精度、總酸和還原糖的測定均參考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用試驗(yàn)方法》[13]。

（2）GC-MS香氣成分測定

氣相色譜條件：毛細(xì)管色譜柱為DB-WAX，規(guī)格為（60 mm×250μm×0.25μm）；手動(dòng)無分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度為230℃；程序升溫：40℃保持1 min，然后5℃/min升溫至180℃，保持1 min，再8℃/min升溫至230℃，保持7 min；載氣：高純度氦氣，流速為1 mL/min。

質(zhì)譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍20～50 amu，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，接口溫度230℃，溶劑延遲3 min。

（3）感官評分標(biāo)準(zhǔn)

參考類似果酒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)[14-15]，制定生姜梨酒感官質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，如表2所示。

表2 生姜梨酒感官品評標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of ginger pear wine

（4）數(shù)據(jù)處理

通過GC-MS分析檢測得出生姜梨酒風(fēng)味物質(zhì)的總離子流色譜圖，采用數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行譜庫美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national instituteof standardsand technology，NIST）8.0檢索及相關(guān)文獻(xiàn)分析，對相應(yīng)的風(fēng)味物質(zhì)成分進(jìn)行鑒定。

利用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（采用一般線性模型單因素DunCan法），檢測結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±SD）表示，所得數(shù)據(jù)在Origin8.0中編輯作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 生姜梨汁酒生產(chǎn)工藝的單因素試驗(yàn)

2.1.1 生姜梨汁比的確定

本試驗(yàn)對比了不同的生姜梨汁質(zhì)量比，通過對成品酒感官評定對比，結(jié)果見表3。

表3 姜梨原料比對酒感官的影響Table 3 Effect of ginger and pear mass ratio on sensory evaluation of the wine

由表3可知，當(dāng)生姜的比例較高時(shí)，生姜梨酒顏色為橙黃色、渾濁，當(dāng)生姜梨汁質(zhì)量比為1∶30時(shí)，果酒呈米黃色，清澈透明，口感較佳，香氣充足，為最佳比例。

2.1.2 初始糖度對生姜梨酒品質(zhì)的影響

初始糖度對生姜梨酒酒精度的影響見圖1。由圖1可知，初始糖度在18%～20%時(shí)，酒精度隨初始糖度的增加而增大，在達(dá)到最大值后，隨著糖度的繼續(xù)增加，酒精度逐漸降低。這是由于高濃度的糖所產(chǎn)生的滲透壓對酵母的活性有抑制作用，所以在糖度過高時(shí)酒精度反而降低。綜合考慮發(fā)現(xiàn)，在初始糖度為20%時(shí)，酒精度為10.04%vol，所得的生姜梨酒清澈透明，梨香突出，梨香、姜香舒適諧調(diào)，酒體豐滿醇厚，柔和，效果最好。

圖1 初始糖度對生姜梨酒酒精度的影響Fig.1 Effect of initial sugar content on alcohol content of ginger pear wine

2.1.3 酵母接種量對生姜梨酒品質(zhì)的影響

接種量對生姜梨酒酒精度的影響見圖2。由圖2可知，酒精的產(chǎn)出量隨酵母接種量的增加而增大，由于接種量過多酵母相互抑制生長，導(dǎo)致產(chǎn)酒量減少，因此酵母的接種量到達(dá)8%后，酒精產(chǎn)量隨酵母的接種量增大而減小。接種量為8%時(shí)，發(fā)酵酒酒精度最高（達(dá)10.8%vol），且生姜梨酒金黃透明、果香濃郁、酒體豐滿。故確定最佳酵母接種量8%。

圖2 酵母接種量對生姜梨酒酒精度的影響Fig.2 Effect of yeast inoculum on alcohol content of ginger pear wine

2.1.4 初始pH值對生姜梨酒品質(zhì)的影響

發(fā)酵液的酸堿程度對酵母的生長和代謝產(chǎn)物的形成具有一定的影響。不同的酵母有其最適宜的生長范圍。過高或者過低都會抑制酵母體內(nèi)酶的活性，使得酵母細(xì)胞的代謝受到阻礙，從而影響到酒精的產(chǎn)量。初始pH值對生姜梨酒酒精度的影響見圖3。如圖3可知，當(dāng)初始pH值過低時(shí)，酵母產(chǎn)生酒精的量較少，此時(shí)發(fā)酵液中的還原糖沒有有效的轉(zhuǎn)換為酒精。當(dāng)pH值為4.5時(shí)，酒精的產(chǎn)量相對較高。當(dāng)pH值為5.0時(shí)，酒精的產(chǎn)量下降。經(jīng)感官嘗評后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH＜4.0時(shí)，發(fā)酵酒的口感粗糙，味道略帶酸澀；當(dāng)pH值為4.5時(shí)，生姜梨酒發(fā)酵酒色澤微黃、清澈透明、梨香姜香舒適協(xié)調(diào)、口感細(xì)膩。因此確定初始pH值為4.5。

圖3 初始pH值對生姜梨酒酒精度的影響Fig.3 Effect of initial pH value on alcohol content of ginger pear wine

2.1.5 發(fā)酵時(shí)間對生姜梨酒品質(zhì)的影響

發(fā)酵時(shí)間對生姜梨酒酒精度的影響見圖4。由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，酒精度呈現(xiàn)先增加后平穩(wěn)的趨勢，根據(jù)感官評定發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵時(shí)間的長短會影響生姜梨酒的風(fēng)味。第7天時(shí)，酒精度達(dá)到了9.78%vol，生姜梨酒的香味較濃，但酒體不夠協(xié)調(diào)；第8天，酒精度達(dá)到9.94%vol，生姜與梨的香氣較濃，口感醇厚，酒體協(xié)調(diào)；第9天時(shí)，酒精度不再上升，口感較醇厚，但甜味不夠，澀味較明顯。如果發(fā)酵時(shí)間不夠，會使酒精度不夠，影響果酒的風(fēng)味；但發(fā)酵時(shí)間過長，酵母菌的自溶現(xiàn)象會對生姜梨酒風(fēng)味產(chǎn)生較大的影響，外界微生物污染生姜梨酒的機(jī)會更大。綜合考慮，發(fā)酵時(shí)間確定為8 d。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對生姜梨酒酒精度的影響Fig.4 Effect of fermentation time on alcohol content of ginger pear wine

2.2 正交試驗(yàn)

本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)L9（33）正交試驗(yàn)[16-18]，以生姜梨酒的酒精度為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，固定發(fā)酵時(shí)間為8 d，選擇了初始糖度、酵母接種量、初始pH值為考察因素，研究其對生姜梨酒品質(zhì)的影響，結(jié)合感官評定確定較優(yōu)生姜梨酒發(fā)酵工藝條件，結(jié)果與分析見表4。

表4 生姜梨酒發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

由表4的試驗(yàn)結(jié)果可以分析出，比較A（酵母接種量）、B（初始糖度）、C（初始pH值）3個(gè)因素的極差R，3個(gè)因素對生姜梨酒發(fā)酵影響的主次順序?yàn)锽＞A＞C，即初始糖度＞酵母接種量＞初始pH值，試驗(yàn)最優(yōu)組合為A2B3C1，結(jié)合感官評定選取最優(yōu)條件為酵母接種量為8%、初始糖度為21%、初始pH值為4.0。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得出，生姜梨酒發(fā)酵最佳工藝條件為初始糖度21%、生姜梨汁質(zhì)量比1∶30、酵母接種量8%、初始pH值為4.0、發(fā)酵時(shí)間8 d。按照此最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證并測相應(yīng)指標(biāo)。結(jié)果表明，在該工藝條件下，生姜梨酒的酒精度為10.81%vol，殘?zhí)橇繛?.31 g/L，總酸為4.41g/L，果酒呈米黃色，清澈透明、有光澤，口感純正柔和、綿軟爽口、爽怡醇厚，具有梨的果香及生姜的獨(dú)特香氣。

2.4 生姜梨酒發(fā)酵工藝風(fēng)味物質(zhì)分析結(jié)果

本試驗(yàn)對最適發(fā)酵時(shí)間、初始糖度、初始pH值、酵母接種量和驗(yàn)證試驗(yàn)的果酒樣品進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜分析。由于單因素試驗(yàn)最佳結(jié)果酒樣的發(fā)酵條件相似，因此由表5的物質(zhì)成分結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，5種酒樣中的揮發(fā)性香氣物質(zhì)成分種類大致相似，主要是醇類和酯類，占揮發(fā)性香氣成分的90%以上。

醇類主要有乙醇、異丁醇、桉葉油醇、異戊醇、正己醇等。在5種酒樣中，主要的醇類物質(zhì)占所有揮發(fā)性組分的比例大致相同，其中乙醇的含量最高，它是酵母菌酒精發(fā)酵的產(chǎn)物，也是賦予酒特殊香氣的主要成分。其次是異戊醇，它主要是以酯的形式存在于植物中。正己醇具有水果的芳香氣味，但在接種量為8%的酒樣中未檢測出正己醇，而其他4個(gè)酒樣中正己醇的含量在1%左右。苯乙醇具有玫瑰的香氣，5種酒樣苯乙醇的相對含量都在10%左右。異丁醇具有刺激性的氣味，隨著濃度的增高對眼睛皮膚、黏膜和上呼吸道的刺激作用越大，最優(yōu)工藝條件組合得到的酒樣中含有的異丁醇較少。高濃度異丁醇對身體有害，相對含量越低，酒的品質(zhì)越好。而正己醇、異戊醇、苯乙醇都能賦予酒具有特殊的香氣，在揮發(fā)性氣體成分中占有一定的含量時(shí)，將會提高酒的品質(zhì)。

表5 5種生姜梨酒酒樣香氣成分含量Table 5 Aromatic components and contents of five kinds of ginger pear wine

酯類主要有乙酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等。揮發(fā)性酯是組成香氣化合物的最重要種類，大多數(shù)酯類具有花、果香氣，在酵母代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)中，酯對酒的風(fēng)味貢獻(xiàn)最大[19-20]。在5種酒樣中，辛酸乙酯相對含量最高，具有白蘭地酒的香味。陳計(jì)巒[21]報(bào)道辛酸乙酯既是梨的特征芳香成分，又是香梨蒸餾酒的主要香氣成分，這說明了在生姜梨酒的釀造過程中保留了鮮梨的特性性香氣成分。同時(shí)，在生姜梨酒中，癸酸乙酯和己酸乙酯的相對含量也較高，癸酸乙酯[22]具有似葡萄酒香氣，己酸乙酯[23]具有強(qiáng)烈的果香和酒香香氣，并有獼猴桃、菠蘿、香蕉的香氣，在驗(yàn)證酒樣中己酸乙酯的相對含量最高，為2.19 mg/L，其他幾個(gè)酒樣中己酸乙酯較少，約為0.45 mg/L；乙酸己酯有梨和獼猴桃香氣，有似梨的酸甜味，而松油醇具有生姜的辛辣味，它們在5種酒樣中的含量相似。

從物質(zhì)的含量來看，與其他4個(gè)酒樣相比，驗(yàn)證試驗(yàn)所得酒樣的香味物質(zhì)中，正己醇、異戊醇、苯乙醇含量適中，己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯的相對含量較高，與最優(yōu)組合所得結(jié)果相符。綜合香氣成分分析結(jié)果，5#酒樣賦予生姜梨果酒香氣的主要酯類物質(zhì)含量明顯要高于單因素條件下的酯類含量，并且5#酒樣的風(fēng)味物質(zhì)成分相對比較豐富，這也證明了通過最佳發(fā)酵工藝條件可獲取更好的口感和風(fēng)味的生姜梨酒。

3 結(jié)論

本研究采用微生物液態(tài)發(fā)酵的方法將生姜與梨有機(jī)地結(jié)合，研制出了一種健康、適合大眾口味的新型復(fù)合型果酒，通過單因素和正交試驗(yàn)，確定了生姜梨酒較優(yōu)的發(fā)酵工藝條件，即初始糖度21%、生姜梨汁質(zhì)量比1∶30、酵母接種量8%、初始pH4.0、發(fā)酵時(shí)間8 d。在此工藝條件下，發(fā)酵溫度控制為25～30℃，生姜梨酒的酒精度達(dá)10.81%vol，成品酒澄清透亮，酒體豐滿，口感醇厚，酸甜適中，并具有濃郁的梨果香、淡淡的生姜香氣和清爽的酒香。

經(jīng)過SPME-GC-MS對比分析單因素的最適結(jié)果和驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步驗(yàn)證了在最佳發(fā)酵工藝條件下能釀造出風(fēng)味和品質(zhì)更佳的生姜梨酒。通過初步SPME-GC-MS的檢測，得到生姜梨酒中含有24種香味物質(zhì)，主體香氣成分有己酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、正己醇、異戊醇、苯乙醇、異丁醇等，它們是影響發(fā)酵型生姜梨酒風(fēng)味、質(zhì)量和特性的主要物質(zhì)，各種香氣成分之間的相互協(xié)調(diào)形成了生姜梨酒的獨(dú)特風(fēng)味。

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