藍莓酵素發(fā)酵工藝優(yōu)化

劉 鑫，朱 丹，牛廣財*，魏文毅，張 琪，樊秋元

（1.黑龍江八一農墾大學 食品學院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農墾大學 生命科學技術學院，黑龍江 大慶 163319）

藍莓（Vaccinium spp.）又名越橘、藍漿果，屬杜鵑花科越橘屬多年灌木果樹[1]，有較強的保健功效，常被譽為“水果之王”[2]。果實中不僅含脂肪、蛋白質、碳水化合物、維生素及諸多微量元素[3]等營養(yǎng)成分，花青素、多酚類物質、黃酮類物質及熊果酸含量也很高[4]。具有保護視力、抗氧化、治療心腦血管疾病、增強記憶力等保健功能[5-8]。

酵素是指使用酵母菌、乳酸菌和醋酸菌等有益微生物發(fā)酵果蔬及可食性藥材而得到的固體或者液體食品，富含大量的脂肪酶、淀粉酶、超氧化物歧化酶、乳酸、醋酸及少量乙醇等代謝產物[9-10]。通常酵素產品含有氨基酸、維生素、β-胡蘿卜素、功能性低聚糖、有機酸和多酚等多種營養(yǎng)成分[11-14]。益生菌的代謝反應直接影響酵素產品的品質，故對益生菌的選擇及其發(fā)酵方式的研究具有重要意義，目前已從自然發(fā)酵的酵素中分離出乳酸菌[15]、酵母菌[16-17]、醋酸菌[18]等多種益生菌，杜麗平等[19]采用聚合酶鏈式反應的變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術分析木瓜酵素自然發(fā)酵過程微生物的變化規(guī)律，研究認為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和畢赤酵母（Pichia pastoris）為發(fā)酵優(yōu)勢菌種。果蔬等經過益生菌的發(fā)酵含有蛋白酶、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、脂肪酶、淀粉酶等多種功效酶，蛋白酶可降解食物中蛋白質利于人體吸收，并對人體中凋亡的細胞具有清除的作用[20]。超氧化物歧化酶是體內天然的超氧自由基清除因子，具有抗衰老、抗氧化的多種保健功能。劉敏等[21]對多種蔬菜水果為原料制備的酵素產品進行了研究，結果表明蛋白酶活力、纖維素酶活力、脂肪酶活力均比較高，并具有良好的抗氧化性。楊培青等[22]對藍莓果渣酵素的工藝進行了研究，經干酪乳桿菌（Lactobacilluscasei）與酵母菌復合發(fā)酵獲得了酵素產品，使資源得到了有效利用。戰(zhàn)偉偉等[23]以藍靛果、椰子為原料，經雙歧桿菌（Bifidobacterium）與酵母菌發(fā)酵后得到了一種新型的復合酵素。本研究以藍莓為原料，植物乳桿菌（L.plantarum）與酵母菌作為發(fā)酵菌種制備藍莓酵素，以蛋白酶活力及SOD酶活力為評價指標，探究藍莓酵素最佳的制備工藝條件，以期為改進藍莓酵素的加工工藝提供理論依據(jù)，對藍莓資源的高效利用具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍莓：黑龍江省大慶市農貿市場；安琪牌葡萄酒專用高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）：中科院微生物研究所；白砂糖：黑龍江北方糖業(yè)股份有限公司；SOD酶活力檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯乙酸（均為分析純）：天津市大茂化學試劑廠；干酪素（分析純）：天津市化學試劑供銷公司；L-酪氨酸（分析純）：北京奧博星生物技術有限責任公司；福林酚試劑、酚酞（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；Pectinex XXL果膠酶（酶活10 000 U/mL）：諾維信（中國）生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

WS108型手持糖度計：上海測維光電技術有限公司；HWS24電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；EX324電子分析天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；TD5Z低速平衡離心機：金壇市城西春蘭試驗儀器廠；UV-1100紫外可見分光光度計：上海凌析達儀器有限公司；HR7633打漿機：飛利浦家庭電器（珠海）有限公司；MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋：杭州亞旭生物科技有限公司；DRP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海森信實驗儀器有限公司；

1.3 試驗方法

1.3.1 藍莓酵素加工工藝流程及操作要點

操作要點：

（1）酶解

藍莓清洗破碎之后經Pectinex XXL果膠酶酶解，果膠酶添加量為1.6 mL/kg，置于50℃水浴中酶解2 h。

（2）調糖

在藍莓果汁中直接添加白砂糖調整糖度，在室溫條件下利用手持糖度儀進行糖度測定，調整糖度至18%。

（3）菌種活化

酵母菌活化：將安琪牌活性干酵母用10倍蒸餾水溶解，30～35℃恒溫水浴鍋中活化30 min備用；植物乳桿菌活化：將斜面保藏的植物乳桿菌在MRS肉湯培養(yǎng)基中活化，兩次繼代培養(yǎng)后，37℃條件下靜置培養(yǎng)48 h，備用。

（4）殺菌

采用巴氏殺菌的方式對藍莓果汁進行殺菌，85℃殺菌15 min后冷卻至室溫。

（5）接種

向處理后的藍莓果汁中，按試驗要求的比例接入活化后的植物乳桿菌或酵母菌。

（6）發(fā)酵

接種后的藍莓果汁，在試驗要求的溫度和時間等條件下進行靜置發(fā)酵，發(fā)酵結束后測定蛋白酶活力與SOD酶活力。

1.3.2 植物乳桿菌發(fā)酵單因素試驗

（1）發(fā)酵時間的確定

調整發(fā)酵初始糖度為18%，殺菌冷卻后接入3%的植物乳桿菌，37 ℃條件下發(fā)酵1 d、2 d、3 d、4 d，測定蛋白酶活力與SOD酶活力確定植物乳桿菌發(fā)酵藍莓酵素的最佳發(fā)酵時間。

（2）發(fā)酵溫度的確定

將發(fā)酵初始糖度調整為18%，藍莓殺菌處理后接入3%的植物乳桿菌，發(fā)酵溫度確定為33℃、35℃、37℃、39℃、41℃，發(fā)酵時間為2 d，根據(jù)蛋白酶與SOD酶活力大小確定植物乳桿菌發(fā)酵藍莓酵素的最佳發(fā)酵溫度。

（3）接種量的確定

將發(fā)酵初始糖度調節(jié)為18%，分別接入2%、3%、4%、5%、6%的植物乳桿菌，37℃條件下發(fā)酵2 d，測定蛋白酶與SOD酶活力，根據(jù)酶活力大小確定植物乳桿菌最佳的接種量。

1.3.3 植物乳桿菌發(fā)酵正交試驗

在植物乳桿菌發(fā)酵藍莓酵素單因素試驗的基礎上，以發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度以及接種量3個因素為考察對象，以蛋白酶活力與SOD酶活力為評價指標，確定植物乳桿菌發(fā)酵藍莓酵素的最佳工藝條件。

表1 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation technology optimization

1.3.4 藍莓酵素的發(fā)酵方式

通過探究酵母菌與植物乳桿菌復合菌種的發(fā)酵，研究確定乳酸發(fā)酵與酵母發(fā)酵的先后順序，通過以下三種方式進行，測定發(fā)酵液的蛋白酶與SOD酶活力，依據(jù)酶活力高低選取最佳發(fā)酵方式。

發(fā)酵方式1：先進行乳酸發(fā)酵，接入4%的植物乳桿菌，在39℃條件下發(fā)酵1d，后接入0.15%的酵母菌，28℃條件下發(fā)酵3 d。

發(fā)酵方式2：先接入0.15%的酵母菌，28℃條件下發(fā)酵3 d，后進行乳酸發(fā)酵，接入4%的植物乳桿菌，在39℃條件下發(fā)酵1 d。

發(fā)酵方式3：同時接入4%植物乳桿菌與0.15%酵母菌，在34℃條件下發(fā)酵4 d。

1.3.5 檢測指標及測定方法：

蛋白酶活力測定方法參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》，采用福林酚法測定蛋白酶活力；SOD酶活力的測定：藍莓酵素液離心取上清液，根據(jù)SOD酶試劑盒說明書進行酶活力的測定；可溶性固形物含量的測定：采用折光計法；總酸的測定參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》；總花色苷含量的測定：花色苷pH=1時在波長520nm處有最大吸收峰，利用花色苷結構特性，在pH=4.5時結構轉變?yōu)椴闋柾问蕉鵁o吸收峰，采用pH示差法測定藍莓酵素中總花色苷含量[24]。

大腸菌群數(shù)測定：參照GB 4789.3—2010《大腸菌群計數(shù)》；金黃色葡萄球菌數(shù)測定：參照GB 4789.10—2010《金黃色葡萄球菌檢驗》；菌落總數(shù)測定：參照GB 4789.2—2010《食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌發(fā)酵單因素試驗

2.1.1 發(fā)酵時間對酶活力的影響

由圖1可知，發(fā)酵前，藍莓鮮果中自帶的SOD酶酶活為21.92 U/g，蛋白酶活力為13.37 U/mL。隨著發(fā)酵時間的進行，SOD酶活力不斷增加，且發(fā)酵的第1天SOD酶活力上升速率很大，第2天酶活力達到最大值86.01 U/g；發(fā)酵進行到第3天，由于發(fā)酵液中總酸不斷上升，抑制了植物乳桿菌的生長及功效酶活力，SOD酶活力有明顯下降趨勢。隨著發(fā)酵的進行，蛋白酶活力不斷上升，在發(fā)酵的第2天蛋白酶活力達到最高值31.28 U/mL；隨著發(fā)酵時間延長，由于發(fā)酵產物的影響，蛋白酶的活力出現(xiàn)了下降的趨勢。因此，植物乳桿菌發(fā)酵藍莓酵素的最適發(fā)酵時間為2 d。

圖1 發(fā)酵時間對藍莓酵素蛋白酶活力與SOD酶活力的影響Fig.1 Effect of fermentation time on protease activity and SOD activity of blueberry enzyme

2.1.2 發(fā)酵溫度對酶活力的影響

由圖2可知，隨發(fā)酵溫度增加，SOD酶活力呈緩步上升的趨勢，39℃條件下，SOD酶活力達到最大值58.28 U/g；發(fā)酵溫度高于39℃，不利于植物乳桿菌生長，SOD酶活力降低。發(fā)酵溫度33℃時，溫度過低不利于乳酸發(fā)酵產生蛋白酶；發(fā)酵溫度＞37℃，蛋白酶活力顯著上升，在39℃時，蛋白酶活力達到最高值39.44 U/mL，發(fā)酵溫度＞39℃，由于溫度過高，蛋白酶活力下降。植物乳桿菌發(fā)酵藍莓酵素的最適發(fā)酵溫度為39℃。

圖2 發(fā)酵溫度對藍莓酵素蛋白酶活力與SOD酶活力的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on protease activity and SOD activity of blueberry enzyme

2.1.3 接種量對酶活力的影響

由圖3可知，接種量增加到3%，SOD酶活力達到最大值86.01 U/g；隨著接種量的不斷增加，植物乳桿菌繁殖速率過快，發(fā)酵液營養(yǎng)物質消耗過快，且有機酸含量過高，使得SOD酶活力降低。蛋白酶活力隨接種量的不斷增加呈現(xiàn)緩慢上升趨勢，接種量達到4%時，蛋白酶活力達到最高值24.48 U/mL，接種量＞4%，蛋白酶活力稍有下降而后趨于穩(wěn)定。根據(jù)兩種功效酶綜合活力高低，植物乳桿菌的最適接種量為3%。

圖3 接種量對藍莓酵素蛋白酶活力與SOD酶活力的影響Fig.3 Effect of inoculum on protease activity and SOD activity of blueberry enzyme

2.2 正交試驗優(yōu)化發(fā)酵工藝條件

由表2極差R值可知，植物乳桿菌發(fā)酵藍莓酵素，蛋白酶活力與SOD酶活力高低的影響因素主次順序均為C＞A＞B，由表3可知，以蛋白酶活力為評價指標，發(fā)酵時間對蛋白酶活力的影響顯著（P＜0.05），發(fā)酵溫度及接種量對蛋白酶活力的影響不顯著（P＞0.05）；由表4可知，以SOD酶活力為評價指標，發(fā)酵時間對SOD酶活力的影響極顯著（P＜0.01），接種量對SOD酶活力的影響顯著（P＜0.05），發(fā)酵溫度對SOD酶活力無顯著性影響（P＞0.05）。根據(jù)正交試驗優(yōu)化的結果可知，最優(yōu)發(fā)酵工藝條件組合為A3B2C1，即發(fā)酵時間為1 d，接種量為4%，發(fā)酵溫度為39℃。在此最佳條件下，蛋白酶活力與SOD酶活力分別為39.44 U/mL和84.17 U/g。

表2 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation technology optimization

表3 以蛋白酶活力為評價指標的正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results using protease activity as evaluation index

表4 以SOD酶活力為評價指標的正交試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results using SOD activity as evaluation index

2.3 藍莓酵素發(fā)酵方式比較

圖4 不同發(fā)酵方式對蛋白酶及SOD酶活力的影響Fig.4 Effects of different fermentation methods on protease and SOD activity

由圖4可知，發(fā)酵方式1蛋白酶活力最低，而SOD酶活力較高，由植物乳桿菌發(fā)酵藍莓酵素單因素試驗可知乳酸發(fā)酵可顯著提升SOD酶活力，顯著高于蛋白酶活力上升效果，故先進行乳酸發(fā)酵樣品SOD酶活力較高，然而乳酸發(fā)酵對營養(yǎng)物質的消耗較快不利于酵母菌發(fā)酵的進行，導致蛋白酶活力較低；發(fā)酵方式2蛋白酶活力明顯高于發(fā)酵方式1，而SOD酶活力略低于發(fā)酵方式1，這是由于先進行的酵母菌發(fā)酵產生了酒精（此時酒精度為1.68%vol），一定程度上抑制了植物乳桿菌的生長代謝，致使蛋白酶活力與SOD酶活力較低。發(fā)酵方式3中酵母菌與乳酸菌共同發(fā)酵，兩種菌種很可能形成了一種共生機制，酵母菌分泌出的蛋白酶、脂肪酶及營養(yǎng)因子可促進乳酸發(fā)酵的進行；而乳酸菌代謝的乳酸鹽等物質可作為能源物質為酵母菌所用[25]，故發(fā)酵方式3即酵母菌與乳酸菌共同發(fā)酵是最佳的發(fā)酵方式。與單獨植物乳桿菌發(fā)酵的藍莓酵素蛋白酶活力（39.44 U/mL）和SOD酶活力（84.17 U/g）相比，復合菌種發(fā)酵的藍莓酵素蛋白酶活力為55.76 U/mL，SOD酶活力81.27 U/g。說明復合菌種發(fā)酵的蛋白酶活力明顯高于植物乳桿菌單獨發(fā)酵的樣品，SOD酶活力略低于植物乳桿菌單獨發(fā)酵。因此，復合菌種發(fā)酵藍莓酵素的兩種功效酶綜合活力高于植物乳桿菌單獨發(fā)酵。

2.4 藍莓酵素的品質指標

2.4.1 感官指標

色澤：紫紅色，色澤均勻有光澤；口味：細膩綿柔，微酸不刺激；香氣：有藍莓獨特香味，同時伴有發(fā)酵香氣；組織狀態(tài)：液態(tài)，均勻無結塊，無沉淀及懸浮物。雜質：無外來雜質。

2.4.2 理化指標

可溶性固形物含量為6.0%，總酸含量為7.24 g/L，總花色苷含量為3.06 mg/g，SOD酶活力81.27 U/g，蛋白酶活力55.76 U/mL。

2.4.3 微生物指標

細菌總數(shù)為≤10CFU/mL，大腸桿菌總數(shù)＜3MPN/100mL，致病菌未檢出。

3 結論

研究結果表明，植物乳桿菌單獨發(fā)酵與復合菌種發(fā)酵均可顯著提高藍莓酵素中蛋白酶與SOD酶的活力。經植物乳桿菌單獨發(fā)酵的最優(yōu)工藝為發(fā)酵時間為1d，接種量為4%，發(fā)酵溫度為39℃，該條件下藍莓酵素的蛋白酶活力及SOD酶活力分別為39.44U/mL和84.17U/g。采用同時接入4%植物乳桿菌與0.15%酵母菌，在34℃條件下發(fā)酵4 d，藍莓酵素的蛋白酶活力與SOD酶活力最高，分別達到了55.76 U/mL和81.27 U/g。綜上所述，復合菌種發(fā)酵是制備藍莓酵素的最佳方式。

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