HPLC-ELSD法同時(shí)測(cè)定酵母發(fā)酵液中的多元醇

王曉丹，白曉燕，朱國(guó)軍，雷安亮，陳美竹，邱樹(shù)毅*

（1.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州珍酒釀酒有限公司，貴州 遵義 563000）

絕大多數(shù)白酒均呈甜味，甜味是一種讓人感覺(jué)比較愉悅的口感，尤其在酒精度高的白酒中，微甜味可以使酒體更加綿柔醇厚。這種甜味主要來(lái)自于醇類(lèi)[1]。多元醇是酒醅中的酵母菌在生成酒精的同時(shí)通過(guò)發(fā)酵還原糖所產(chǎn)生的，在酒中可起緩沖作用，使白酒更加豐滿(mǎn)醇厚[1-2]。白酒中的多元醇種類(lèi)繁多，主要包括丙三醇、阿拉伯糖醇、核糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇、山梨醇、甘露醇、半乳糖醇、麥芽糖醇等，甜度隨羥基數(shù)增多而增強(qiáng)[2]。由于多元醇沸點(diǎn)高，屬于難揮發(fā)性醇類(lèi)，不易隨蒸餾進(jìn)入酒中，在蒸餾酒醅時(shí)，一小部分多元醇會(huì)隨著水蒸氣被帶入酒中，因此白酒中多元醇含量極低，定量分析的難度較大[3]。

目前，白酒中多元醇的檢測(cè)方法主要有：薄層層析法、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（high performance liquid chromatography-evaporativelight-scattering detector，HPLCELSD）[4]、液質(zhì)聯(lián)用法[5]、毛細(xì)管氣相色譜法[6]、離子色譜積分脈沖安培法[7-8]等。氣相色譜法由于其高分辨率、高靈敏度、低檢測(cè)限等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用。但多元醇具有高極性、強(qiáng)親水性以及低揮發(fā)性的特性，氣相色譜法測(cè)定時(shí)，必須將糖醇衍生化為易揮發(fā)且穩(wěn)定的衍生物，操作繁瑣而復(fù)雜，容易帶來(lái)誤差[9]。離子色譜法雖然靈敏度較好，但是受環(huán)境溫度的影響大，且由于糖類(lèi)在電極表面能將某些分子氧化或還原，因而該方法準(zhǔn)確性受限[10]。高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法具有基線(xiàn)穩(wěn)定、分離效果良好，結(jié)果準(zhǔn)確、樣品處理簡(jiǎn)單、測(cè)定速度快等優(yōu)點(diǎn)，因此在本研究中選用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法對(duì)酵母發(fā)酵液中多元醇進(jìn)行測(cè)定。

由于白酒釀造中，多元醇不易隨蒸餾進(jìn)入酒中，本研究建立一種高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法對(duì)酵母菌發(fā)酵液中多元醇種類(lèi)及含量進(jìn)行測(cè)定，以課題組前期從醬香型大曲和酒醅中分離的酵母菌株為研究對(duì)象，測(cè)定酵母菌產(chǎn)多元醇類(lèi)物質(zhì)的能力。以期找到在白酒釀造中對(duì)多元醇產(chǎn)生能力較強(qiáng)的酵母菌，為后期白酒中多元醇的提高奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

絲孢酵母（Trichosporon coremiiforme）（FBKL2.0118、FBKL2.0307、FBKL2.0315）、婁德酵母（Lodderomyceselongisporus）FBKL2.00130、庫(kù)德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）FBKL2.0310分離篩選于醬香型大曲和酒醅中并保藏于貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

D-阿拉伯糖醇（純度≥98%）、D-核糖醇（純度≥98%）、赤蘚糖醇（純度≥99%）：上海源葉生物科技有限公司；木糖醇（純度≥99.5%）、山梨糖醇（純度≥98%）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

酵母膏胨葡萄糖瓊脂（yeast extract peptone dxtrose，YEPD）培養(yǎng)基：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌20 min。

酵母種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，酵母粉10g，蛋白胨20 g，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌20 min。

酵母發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖200 g，酵母粉10 g，蛋白胨20 g，蒸餾水1 000 mL，115℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

Milli-Q Academic密理博超純水儀：密理博（上海）貿(mào)易有限公司；Agilent1260高效液相色譜儀、Agilent G4260B蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、SPEC18固相萃取小柱（200 mg，3 mL）、Agilent Hi-plexCa液相色譜柱（7.7 mm×300 mm，8μm）：安捷倫科技（中國(guó)）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

精確稱(chēng)取D-阿拉伯糖醇、D-核糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇及山梨糖醇標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g于10 mL容量瓶中，用二次蒸餾水分別配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，并用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾。準(zhǔn)確稱(chēng)取D-阿拉伯糖醇、D-核糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇及山梨糖醇標(biāo)準(zhǔn)品各0.500 0 g于50 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL的多元醇混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液，用蒸餾水稀釋成質(zhì)量濃度分別為8.0 mg/mL、6.0 mg/mL、4.0 mg/mL、2.0 mg/mL、1.0 mg/mL、0.8mg/mL、0.6mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，并用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾。

1.3.2 樣品處理

大數(shù)據(jù)常用的數(shù)據(jù)分析處理技術(shù)包括云計(jì)算和Mapreduce系統(tǒng)、數(shù)據(jù)庫(kù)、可視化技術(shù)等。云計(jì)算是大數(shù)據(jù)分析處理技術(shù)的核心原理，也是大數(shù)據(jù)分析應(yīng)用的基礎(chǔ)平臺(tái)。Mapreduce系統(tǒng)提出簡(jiǎn)化了數(shù)據(jù)的計(jì)算過(guò)程，避免了大量數(shù)據(jù)傳輸。數(shù)據(jù)庫(kù)則是為用戶(hù)提供了各種數(shù)據(jù)以及獲取數(shù)據(jù)的方式，可視化技術(shù)即運(yùn)用計(jì)算機(jī)圖形學(xué)和圖像處理技術(shù)，將分析出來(lái)的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為圖形或圖像形式，與用戶(hù)進(jìn)行交互處理。這一技術(shù)極大地方便了通過(guò)數(shù)據(jù)及時(shí)掌握生產(chǎn)的內(nèi)在變化[1]。隨著數(shù)據(jù)處理軟件的不斷更新升級(jí)，越來(lái)越多的多樣化功能軟件將被應(yīng)用在工業(yè)生產(chǎn)的大數(shù)據(jù)動(dòng)態(tài)分析中，自動(dòng)為用戶(hù)展現(xiàn)最直觀的結(jié)果。

參照白小燕等[11]的方法，將酵母菌株經(jīng)YEPD培養(yǎng)基活化后接種到酵母種子培養(yǎng)基中，在30℃、160 r/min條件下擴(kuò)大培養(yǎng)24 h即為種子培養(yǎng)液，種子培養(yǎng)液按照5%的接種比例接種到裝液量為50 mL/250 mL的酵母發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、160 r/min搖瓶培養(yǎng)5 d后獲得發(fā)酵液。

吸取5 mL發(fā)酵液于試管中，65℃水浴10 min后轉(zhuǎn)移到離心管中，10 000 r/min離心10 min，獲得上清液并經(jīng)C18固相萃取小柱凈化，再用0.22μm水系濾膜過(guò)濾后，待高效液相色譜儀分析。

1.3.3 高效液相色譜條件

色譜條件：Agilent Hi-plexCa色譜柱（7.7 mm×300 mm，8 μm）；流動(dòng)相：純水；流速：0.5 mL/min；柱溫：70℃；進(jìn)樣量：4μL；檢測(cè)器：蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）；霧化溫度為60℃；蒸發(fā)溫度為60℃；增益：2；氮?dú)猓兌葹?9.999%）為載氣。采用5種多元醇標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰保留時(shí)間對(duì)發(fā)酵液中多元醇進(jìn)行定性；用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種多元醇標(biāo)準(zhǔn)品及樣品高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果

由圖1可知，HPLC-EISP法可以檢測(cè)到酵母發(fā)酵體系中的主要成分葡萄糖和甘油，同時(shí)還可以測(cè)到D-阿拉伯糖醇、D-核糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇和山梨醇這五種多元醇，因此說(shuō)明此方法能夠準(zhǔn)確分析酵母發(fā)酵多元醇的代謝成分的變化。從多元醇標(biāo)準(zhǔn)品得到各多元醇的保留時(shí)間為：葡萄糖13.329 min，D-核糖醇16.869 min，赤蘚糖醇19.568 min，甘油20.349，D-阿拉伯糖醇23.143 min；木糖醇28.103 min，山梨醇29.223 min。將酵母發(fā)酵液和多元醇標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比可得，酵母FBKL2.0118發(fā)酵液中含有D-核糖醇和D-阿拉伯糖醇；酵母FBKL2.0315發(fā)酵液中含有赤蘚糖醇；酵母FBKL2.0310發(fā)酵液中含有甘油、D-阿拉伯糖醇、木糖醇和山梨醇，且由于殘?zhí)橇窟^(guò)高，葡萄糖已經(jīng)超出檢測(cè)限，出現(xiàn)平頭峰；酵母FBKL2.0073發(fā)酵液中含有D-阿拉伯糖醇；酵母FBKL2.0307發(fā)酵液中含有D-阿拉伯糖醇和山梨醇。進(jìn)一步優(yōu)化D-阿拉伯糖醇、D-核糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇和山梨醇五種多元醇檢測(cè)方法。

2.2 回歸方程、線(xiàn)性范圍和檢出限

配制不同質(zhì)量濃度的5種多元醇混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在相同試驗(yàn)條件下進(jìn)行測(cè)試分析，根據(jù)測(cè)得的峰面積（Y）和相對(duì)應(yīng)的多元醇質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到5種多元醇標(biāo)準(zhǔn)品的線(xiàn)性回歸方程和相關(guān)系數(shù)R；以信噪比等于3（S/N=3）為標(biāo)準(zhǔn)[12]，得到5種多元醇的檢出限，結(jié)果如表1所示。由表1可知，5種多元醇的相關(guān)系數(shù)R在0.996～0.999之間，表明在各自線(xiàn)性范圍內(nèi)5種多元醇的質(zhì)量濃度與峰面積均具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。5種多元醇檢出限在0.045～0.058mg/mL之間，表明該方法能夠?qū)崿F(xiàn)多元醇含量的測(cè)定。

表1 5種多元醇標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程、線(xiàn)性范圍及檢出限Table 1 Regression equation,linear range and limit of detection of 5 polyhydric alcohols

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of precision tests

采用HPLC-ELSD法對(duì)5種多元醇的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（1.0 mg/mL）平行測(cè)定6次，記錄色譜峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relativestandard deviation，RSD），判斷該檢測(cè)方法的精密度[13-15]，結(jié)果如表2所示。由表2可知，5種多元醇含量檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均在1.22%～4.53%之間，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)方法精密度良好。

2.4 方法的回收率試驗(yàn)

用菌株FBKL2.0310制備相同酵母發(fā)酵液2份，其中一份發(fā)酵液作為本底，另一份發(fā)酵液添加一定量的5種多元醇溶液進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，設(shè)置3個(gè)水平，每個(gè)水平重復(fù)進(jìn)樣6次，采用HPLC-ELSD法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算回收率和RSD值[16-17]，結(jié)果如表3所示。由表3可知，5種多元醇的平均回收率在96.73%～100.46%之間，RSD值為0.22%～3.31%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確度較高，可以用于實(shí)際酵母發(fā)酵液的檢測(cè)。

表3 樣品加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of samples adding standard recovery rates tests

2.5 穩(wěn)定性和重現(xiàn)性試驗(yàn)

取5種多元醇的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（1.0 mg/mL），放置于4 ℃冰箱中，分別于0、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h時(shí)取樣，進(jìn)行多元醇含量測(cè)定，測(cè)得標(biāo)品中D-阿拉伯糖醇、D-核糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇、山梨醇的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）（n=6）分別為2.28%、1.75%、1.99%、1.88%、2.84%和2.10%。表明該方法對(duì)于5種多元醇在24 h內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定性較好。

按樣品發(fā)酵液制備方法平行操作，取菌株FBKL2.0310制備的發(fā)酵液6份，平行進(jìn)樣3次，測(cè)得發(fā)酵液中D-阿拉伯糖醇、D-核糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇、山梨醇的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.03%、1.36%、0.40%、1.87%和0.37%，表明本方法重現(xiàn)性良好。

2.6 酵母菌株發(fā)酵液中多元醇定量分析

本課題組前期從醬香型大曲和酒醅中篩選到利用葡萄糖產(chǎn)生糖醇能力較強(qiáng)的酵母菌株FBKL2.0130、FBKL2.0118、FBKL2.0307、FBKL2.0310、FBKL2.0315，并以這5株酵母菌作為發(fā)酵菌株，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中于30℃、160 r/min搖瓶培養(yǎng)5 d得到發(fā)酵液，利用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法對(duì)5株酵母發(fā)酵液中多元醇進(jìn)行測(cè)定，將測(cè)得各多元醇峰面積代入相應(yīng)的回歸方程得到各多元醇的含量，定量結(jié)果如表4所示。由表4可知，菌株FBKL2.0130產(chǎn)D-阿拉伯糖醇能力最強(qiáng)（12.05 g/L），并且產(chǎn)多元醇總量最多（13.03 g/L）；菌株FBKL2.0118產(chǎn)D-核糖醇和D-阿拉伯糖醇；菌株FBKL2.0307產(chǎn)D-阿拉伯糖醇和山梨糖醇；菌株FBKL2.0310能夠產(chǎn)D-阿拉伯糖醇、木糖醇和山梨糖醇，菌株FBKL2.0315僅可以產(chǎn)赤蘚糖醇。

表4 不同酵母發(fā)酵液中多元醇含量Table 4 Polyhydric alcohols contents in different yeast fermentation broth

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相色譜-蒸發(fā)光散射（HPLC-ELSD）同時(shí)檢測(cè)酵母發(fā)酵液中D-阿拉伯糖醇、D-核糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇、山梨醇的方法。結(jié)果表明，5種多元醇在0.8～6.0 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與色譜峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系（相關(guān)系數(shù)R均≥0.996）；精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均＜5%，回收率為96.73%～100.46%，重現(xiàn)性和樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性的RSD均＜1.90%，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。菌株FBKL2.0130產(chǎn)D-阿拉伯糖醇能力最強(qiáng)（12.05g/L）；且產(chǎn)多元醇總量最多（13.03g/L）。

本實(shí)驗(yàn)以醬香型白酒釀造過(guò)程中大曲和酒醅分離的酵母為研究對(duì)象，運(yùn)用本方法能夠在30 min內(nèi)同時(shí)測(cè)定到酵母發(fā)酵液中的D-阿拉伯糖醇、D-核糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇、山梨醇，為白酒的風(fēng)格特征的凸顯和品質(zhì)的保證提供了科學(xué)依據(jù)和保證。

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