HPLC法檢測黑曲霉發(fā)酵液中5-羥甲基糠醛的研究

張 素，吉玉玉，肖 洋，陳家祥，徐 策，李 祝*

（1.貴州省煙草公司畢節(jié)市公司，貴州 畢節(jié) 551700；2.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.貴州省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測院，貴州 貴陽 550003）

5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethyl-furfural，5-HMF），也稱5-羥甲基-2-呋喃甲醛，是葡萄糖、果糖等單糖化合物在高溫或弱酸等條件下脫水產(chǎn)生的醛類化合物[1-2]，其分子中含有活潑基團(tuán)醛基和羥甲基，可作為許多化學(xué)品的反應(yīng)中間體，有望成為新的平臺化合物[3]。目前5-羥甲基糠醛的制備方法主要是生物質(zhì)水解法[4]，還可通過降解植物纖維素制備[5]。于能江[6]從頭孢霉屬（Cephalosporium sp.）GH10的發(fā)酵物中分離鑒定出5-HMF，陳楠等[7]以蜜環(huán)菌發(fā)酵液為原料優(yōu)化5-HMF的提取工藝皆能證明微生物發(fā)酵液產(chǎn)5-HMF，但都未對其含量進(jìn)行精確的測定。國內(nèi)外針對牛乳、果汁、蜂蜜、谷類食物、酒類和藥物中5-HMF的檢測方法進(jìn)行了大量的報(bào)道，主要包括紫外分光光度法[8]、衍生化分光光度法[9]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法等[10-11]。紫外分光光度應(yīng)用在乳制品中，由于含有多種蛋白質(zhì)等成分會對分析結(jié)果有影響；衍生化分光光度法需先生成衍生化產(chǎn)物后再進(jìn)行測定，耗時較長且操作較繁瑣[12]。高效液相色譜法因具有樣品用量少、方法操作簡單并且能夠準(zhǔn)確對單一組分進(jìn)行定性和定量等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用[11]。本實(shí)驗(yàn)以黑曲霉（Aspergillus niger）發(fā)酵液為原料，以滅菌后的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基為空白對照，用高效液相色譜法對5-HMF含量進(jìn)行測定，對于探索黑曲霉發(fā)酵液中存在物質(zhì)具有一定的參考作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

黑曲霉（Aspergillusniger）xj：貴州大學(xué)真菌資源研究所分離，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC NO：M206021。

1.1.2 試劑

甲醇、乙腈（均為色譜純）：天津富宇試劑公司；無水乙醇、冰乙酸（均為分析純）：天津恒興試劑公司；超純水：實(shí)驗(yàn)室自制；5-HMF對照品（純度為99.9%）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent-1100型高效液相色譜儀（配有四元梯度泵，二極管陣列檢測器，在線真空脫氣機(jī)）：美國Agilent公司；ME203T電子分析天平：瑞士梅特勒托利多公司；Exceed-E超純水機(jī)：成都康寧實(shí)驗(yàn)專用純水設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜條件參照劉超等[13]測定糠醛的方法。色譜條件：Spheriorb C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm），以乙睛∶0.1%乙酸水（冰乙酸調(diào)）=15∶85（V/V）為流動相，柱溫30℃；流速1 mL/min，檢測波長λ=277 nm，進(jìn)樣量10μL。

1.3.2 發(fā)酵液浸膏及培養(yǎng)基的處理

將黑曲霉發(fā)酵液浸膏10 g用150 mL沸水進(jìn)行抽提8 h、10 000 r/min離心15min取上清液。上清液用300 mL乙醚萃?。ǚ?次進(jìn)行，萃取后得到200 mL乙醚），將得到乙醚自然揮干，再用6 mL甲醇溶解后12 000 r/min離心2 min取上清液，經(jīng)0.45μm濾膜過濾后進(jìn)行HPLC分析[13]。將滅菌后的10 g馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基同樣方法處理。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品適量，制成1 mg/mL的體積分?jǐn)?shù)為90%甲醇溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量，分別稀釋為1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照1.3.1的條件進(jìn)樣。以5-HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)制作5-HMF標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系的考察

圖1 5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of 5-hydroxymethyl-furfural

以5-HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)制作5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。由圖1可知，5-HMF標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=51.628x+72.335，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，5-HMF質(zhì)量濃度在1～50μg/mL范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系，能夠滿足樣品測試要求。

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取20μg/mL的5-HMF對照品溶液，按1.3.1節(jié)高效液相色譜條件連續(xù)進(jìn)樣8針，得到對照品峰面積，精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1可知，5-HMF質(zhì)量濃度測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standaral deviation，RSD）值為0.71%，結(jié)果表明該方法精密度高。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of precision experiments

2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

平行取同一批次發(fā)酵液6份，按1.3.3節(jié)制備供試品溶液6份，按1.3.1節(jié)色譜條件進(jìn)樣，得到對照品峰面積，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知，5-HMF含量測定結(jié)果RSD值為0.98%，表明該檢測方法重復(fù)性良好。

表2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of repeatability experiments

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取已知含量的發(fā)酵液9份，分別按照低、中、高3種濃度水平加入對照品溶液適量，按1.3.3節(jié)中方法處理后，各濃度水平平行測定3次，結(jié)果見表3。由表3可知，樣品平均加標(biāo)回收率在87.12%～90.78%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of adding standard recovery rate experiments

2.5 樣品中5-羥甲基糠醛含量高效液相色譜檢測

5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖見圖2。由圖2可知，5-HMF的保留時間為2.436 min。

圖2 5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of 5-hydroxymethyl-furfural standard substance

黑曲霉發(fā)酵液樣品中5-HMF含量分析高效液相色譜圖見圖3。由圖3可知，5-HMF的保留時間為2.405 min左右，計(jì)算黑曲霉發(fā)酵液樣品中5-HMF含量為0.127 5 mg/g。

圖3 黑曲霉xj發(fā)酵液樣品中5-羥甲基糠醛含量高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of 5-hydroxymethyl-furfural content in fermentation broth of A.niger xj

PDA培養(yǎng)基樣品中5-HMF含量分析高效液相色譜圖見圖4。由圖4可知，5-HMF的保留時間為2.407min，計(jì)算PDA培養(yǎng)基樣品中5-HMF含量為0.001 8 mg/g。所以黑曲霉發(fā)酵液中5-HMF凈含量為0.125 7 mg/g。

圖4 PDA培養(yǎng)基樣品中5-羥甲基糠醛含量高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of 5-hydroxymethyl-furfural content in PDA medium

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)確定了HPLC快速檢測黑曲霉發(fā)酵液中5-HMF含量的條件：采用Spheriorb C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm），以乙睛∶0.1%乙酸水（冰乙酸調(diào)）=10∶90（V/V）為流動相，柱溫30℃；流速1 mL/min，波長λ=277 nm，進(jìn)樣量10μL。其保留時間為2.436min，回收率為87.12%～90.78%，精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果RSD為0.71%。發(fā)酵液樣品中5-HMF含量為0.125 7 mg/g。

本實(shí)驗(yàn)旨在建立黑曲霉發(fā)酵液中5-HMF含量的檢測方法。通過對發(fā)酵液的分離提取，結(jié)合優(yōu)化的液相色譜條件，5-HMF獲得了良好的分離效果。采用HPLC法準(zhǔn)確、方便，且可對黑曲霉發(fā)酵液中5-HMF的測定提供很好的依據(jù)，重復(fù)性好，實(shí)用性較強(qiáng)，對于探索黑曲霉發(fā)酵液中物質(zhì)有著一定的參考作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]JUBEN N C,GEORGE W H,JAMESA D.Liquid-phase catalytic processing of biomass-derived oxygenated hydrocarbons to fuels and chemicals[J].Angewandte Chem,2007,46(38)：7164-83.

[2]CHHED A,JUBEN N.Production of 5-hydroxymethylfurfural and furfural by dehydration of biomass-derived mono-and polysaccharides[J].Green Chem,2007,9(4)：342-350.

[3]王 軍，張春鵬，歐陽平凱.5-羥甲基糠醛制備及應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].化工進(jìn)展，2008，27（5）：702-707.

[4]KUSTER B M F.5-hydroxymethylfurfural(HMF),a review focusing on itsmanufacture[J].Starch,1990,42(8)：314-321.

[5]吳樹昌，王春雷，高勇軍，等.離子液體中微波輔助的Lewis酸催化纖維素制備 5-羥甲基糠醛[J].催化學(xué)報(bào)，2010，31（9）：1157-1161.

[6]于能江.兩種真菌的次生代謝產(chǎn)物和生物活性研究[D].北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)，2002.

[7]陳 楠，焦連慶，鄭毅男，等.蜜環(huán)菌發(fā)酵液中5-羥甲基糠醛提取工藝優(yōu)化[J].特產(chǎn)研究，2012，34（1）：31-33，46.

[8]李 良，孟淑潔，陳曉云，等.水果蔬菜及其制品中羥甲基糠醛測定的研究[J].遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002（4）：12-14.

[9]TU D,XUE S,MENG C.Simultanous determination of 2-FUR and 5-HMF by deriva-tivespectrophotometry[J].Agr Food Chem,1992,40(6)：1022-1025.

[10]FERRERE,ALEGRIA A.High-performace liquid chromatography determination of Maillard compounds in store-brand and name-brand ultra-high-temperature-treated cows'milk[J].Chromatogr A,2000,881(1-2)：599-606.

[11]MORALESFJ,ROMEROC,JIMENEZ PS.An enhanced liquid chromatographic met-hod for 5-hydroxymethyfurfural determination in UHT milk[J].Chromatographia,1992,33(1/2)：45-48.

[12]ESPINOSA-MANSILLA A,MUNOZ DE LA PANA A,SALINASF.Semiautomatic determination off uranic aldehydesin good and pharmaceutical samplesby astopped-flow injection analysismethod[J].AOAC Int,1993,76(6)：1255-1261.

[13]劉 超，方尚玲，李 習(xí)，等.HPLC法測定產(chǎn)醬香芽孢桿菌發(fā)酵液中糠醛的含量[J].釀酒，2012，39（4）：46-49.

[14]龍光明，裘 璐，馬 麗，等.HPLC測定6種蜂蜜中5-羥甲基糠醛的含量[J].數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志，2012，25（6）：643-645.

[15]王妙飛，張水華，郭新東，等.高效液相色譜法測定醬油中的5-羥甲基糠醛[J].現(xiàn)代食品科技，2008，24（2）：188-190.

[16]梁 多，劉智鈞，肖婉娜.HPLC法同時測定青梅精中梅素和5-羥甲基糠醛[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2017（1）：57-59，65.

[17]周 堅(jiān).HPLC法測定小活絡(luò)丸（大蜜丸）中5-羥甲基糠醛的含量[J].西北藥學(xué)雜志，2013，28（1）：34-35.

[18]張清波，喬 菲，陳曉雪，等.HPLC測定熟地黃中5-羥甲基糠醛的含量[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2001，2（4）：33-34.