4株乳酸菌對模擬胃腸環(huán)境的耐受性及生長特性研究

云月英，徐 娟，張小利

（內(nèi)蒙古科技大學 生命科學與技術學院，內(nèi)蒙古 包頭 014010）

乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細菌的通稱[1]。其大多無毒無害，可作為發(fā)酵劑廣泛應用于食品工業(yè)中，且在促進人體健康方面發(fā)揮著重要作用，如調(diào)節(jié)腸道菌群[2]、降膽固醇[3]、抗腫瘤[4]、抗氧化[5]、免疫調(diào)節(jié)[6]等。因此，乳酸菌常被用作益生菌篩選的候選菌群。人體胃腸道的極端環(huán)境在很大程度上會影響乳酸菌的活性，只有對低pH值和一定濃度的膽鹽環(huán)境具有耐受性的菌株，才能在人體胃腸道中存活，進而發(fā)揮其生理功能[7-8]。

本實驗對來源于自然發(fā)酵肉制品中的4株乳酸菌的耐酸性、膽鹽耐受性、模擬消化環(huán)境耐受性及在MRS培養(yǎng)基中的生長特性進行評價，以期為其作為益生性肉品發(fā)酵劑開發(fā)的候選菌株提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳酸菌菌株：篩選自內(nèi)蒙古自然發(fā)酵肉制品，編號為M12、M18、M21和M23[9]。

牛膽鹽（生化試劑）：天津風船化學試劑科技有限公司；胃蛋白酶（3 000 U/g）、胰蛋白酶（250 U/g）：美國Amresco公司。

MRS肉湯培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

人工模擬胃液：NaCl0.2g/100mL、胃蛋白酶0.35g/100mL，用HCl調(diào)整pH值為3.0，過濾除菌備用[10]。

人工模擬腸液：a液為重碳酸鈉1.1 g/100 mL、NaCl 0.2 g/100 mL、胰蛋白酶0.1 g/100 mL，用NaOH調(diào)整pH為8.0，過濾除菌備用。b液為牛膽鹽1.8 g/100mL，用NaOH調(diào)整pH為8.0，過濾除菌備用。將a液和b液以2∶1（V/V）混合即為人工模擬腸液[10]。

1.2 儀器與設備

PSX智能型恒溫恒濕培養(yǎng)箱：寧波萊?？萍加邢薰?；SW-CJ-2FD潔凈工作臺：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；F200顯微鏡：上海長方光學儀器廠；R20BC臺式高速冷凍離心機：湖南凱達科學儀器有限公司；YXQ-LS-30SII立式壓力滅菌器：上海東亞壓力容器制造有限公司；JA5003電子分析天平：上海超平科技儀器有限公司；UV-7504單光束-可見分光光度計：上海欣茂儀器有限公司；CX-AG050厭氧罐：上海川翔生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株耐酸性的測定[11]

將待測菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24 h，3 000 r/min、4℃離心10 min收集菌體，加入等體積滅菌生理鹽水洗滌2次，同樣條件下離心，菌體懸浮于等體積滅菌生理鹽水中制成供試菌液。供試菌液以4%（V/V）的接種量分別接入pH值為2.0、3.0、3.5的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)3 h。利用菌落平板計數(shù)法分別于0 h和3 h進行活菌計數(shù)，存活率計算公式如下：

式中：N0為0 h活菌數(shù)，CFU/mL；N1為3 h后的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.3.2 菌株膽鹽耐受性的測定[12-13]

供試菌液以4%（V/V）的接種量分別接種于含0.3g/100mL、0.5 g/100 mL、1.0 g/100 mL牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h。利用菌落平板計數(shù)法分別于0 h和24 h進行活菌計數(shù)，計算存活率。

1.3.3 菌株人工模擬胃腸液耐受性的測定[14]

取l mL供試菌液接入9 mL無菌的人工模擬胃液中，混勻后，37℃、150r/min條件下培養(yǎng)2h。利用菌落平板計數(shù)法分別于0 h和2 h進行活菌計數(shù)，計算存活率。然后取1 mL經(jīng)人工胃液處理后的菌液，接種于9 mL無菌的人工模擬腸液中，37℃、100 r/min培養(yǎng)10 h。利用菌落平板計數(shù)法分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h進行活菌計數(shù)。

1.3.4 菌株生長特性的研究[15-16]

菌株24 h生長曲線和pH值的測定：將待測菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24 h，以不接種的MRS液體培養(yǎng)基為空白對照，每2 h于波長600 nm處測定菌液OD值，并測定其pH值。

不同溫度生長情況：將待測菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基，分別于10℃、20℃、30℃、40℃條件下連續(xù)培養(yǎng)24 h，以不接種的MRS液體培養(yǎng)基為空白對照，于波長600 nm處測定OD600nm值。

2 結果與分析

2.1 菌株的耐酸性

人體胃液的pH值通常為3.0左右，乳酸菌活菌體要想順利通過胃液，必須對低pH值環(huán)境具有一定的耐受性[17]。從圖1可以看出，不同菌株對酸的耐受程度不同。在pH值為3.5的環(huán)境中，4株菌的生長情況良好，存活率均＞50%；當pH值為3.0時，菌株M18的存活率迅速下降，僅為5.4%，其余菌株的存活率仍在50%以上；當pH值降至2.0后，菌株M12和M23仍可存活，表現(xiàn)出較強的耐酸性能。

圖1 菌株的耐酸性Fig.1 Acid tolerance of strains

2.2 菌株的膽鹽耐受性

膽鹽可通過改變菌體外膜的通透性和對菌體脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的損傷等，影響乳酸菌的存活[18]。由圖2可知，不同濃度的膽鹽對待測菌株的抑制作用存在較大差異，且隨著膽鹽濃度的增加，抑制作用也隨之增強。在膽鹽質(zhì)量濃度為0.3 g/100 mL時，菌株M12和M23的存活率＞50%，M18的存活率為27.82%，M21的存活率為13.59%；當膽鹽質(zhì)量濃度為0.5g/100mL時，菌株M12和M23仍有一定的耐受性，存活率分別為8.10%和5.66%；當膽鹽質(zhì)量濃度達到1.0 g/100 mL時，僅菌株M23存活，存活率為0.27%。綜上所述，菌株M12和M23具有較強的膽鹽耐受性能。

圖2 乳酸菌的膽鹽耐受性Fig.2 Bile salt tolerance of strains

2.3 菌株在模擬胃腸道環(huán)境中的耐受能力

乳酸菌保持較高的數(shù)量和活性通過胃腸道，是發(fā)揮生理功能的關鍵因素，除胃腸道的酸性和膽鹽環(huán)境外，還應考慮胃蛋白酶、胰蛋白酶等對其的影響[19]。通過耐酸耐膽鹽性能的測定，選取耐受性較好的M12和M23為目標菌株，進一步研究其在模擬胃腸液中的生長情況。如圖3所示，菌株M12和M23經(jīng)pH值為3.0的人工模擬胃液處理2 h，存活率可達到68.66%和56.72%，再經(jīng)人工模擬腸液處理10 h，活菌數(shù)仍高于104CFU/mL，對人工模擬胃腸液均顯示出較好的耐受性。

圖3 菌株M12(A)及M23(B)在模擬人工胃腸液中的生長情況Fig.3 Growth characteristics of strains M12(A)and M23(B)in simulated artificial gastrointestinal fluid

2.4 菌株24 h生長曲線及pH值變化

發(fā)酵肉制品在制作過程中不經(jīng)過加熱處理，易受到腐敗菌及致病菌的污染。乳酸菌通過自身的生長繁殖及代謝產(chǎn)生的乳酸和多種有機酸，對其他有害菌具有一定的抑制作用，從而提高產(chǎn)品的安全性和貯藏性[20]。因此，用于發(fā)酵肉制品的乳酸菌應具有較快的增殖速度和產(chǎn)酸速度。

圖4 菌株M12和M23的生長曲線Fig.4 Growth curves of strains M12 and M23

由圖4可知，菌株M12和M23生長曲線的總體趨勢相似，適應環(huán)境能力強，具有較強的增殖能力，經(jīng)歷了約2 h的延滯期，4～14 h內(nèi)菌體濃度快速增加，20 h以后各菌株的生長速率減緩，24 h內(nèi)均已進入穩(wěn)定生長期。

由圖5可知，菌株M12和M23具有較強的產(chǎn)酸能力，培養(yǎng)基的pH值與菌體OD600nm值變化趨勢一致。在培養(yǎng)初期培養(yǎng)基的pH值基本不變，4～14 h內(nèi)隨著菌體數(shù)目的增加，培養(yǎng)基pH值快速降低，由最初的6.2下降至4.6左右，隨著培養(yǎng)時間的延長，待測菌株的增殖速度受到明顯抑制，pH值的下降速率減緩，趨于穩(wěn)定。

圖5 菌株M12和M23的p H值變化Fig.5 Changes of p H value of strains M12 and M23

2.5 菌株在不同溫度下的生長情況

圖6 菌株M12和M23在不同溫度條件下的生長情況Fig.6 Growth characteristics of strains M12 and M23 at different temperature conditions

由圖6可知，菌株M12和M23在肉制品的發(fā)酵溫度范圍內(nèi)均能較好地生長，但不同溫度對其生長情況存在明顯影響，在10～40℃范圍內(nèi)，隨溫度的升高，菌體的OD600nm值均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，20～40℃條件下生長較好，30℃時菌體濃度達到最大值。

3 結論

4株來源于肉制品的受試乳酸菌中菌株M12、M23在pH3.0和含0.3 g/100 mL膽鹽的MRS培養(yǎng)基中存活率較高，均＞50%。菌株M12和M23對人工模擬胃腸道環(huán)境同樣具有較好的耐受性，經(jīng)過人工模擬胃液處理2 h后，存活率均＞50%，經(jīng)人工模擬腸液處理10 h后仍可存活。同時，這2株菌具有較強的增殖及產(chǎn)酸能力，24 h內(nèi)均已進入穩(wěn)定生長期，隨著菌體數(shù)目的增加，培養(yǎng)基pH值快速降低，在肉制品的發(fā)酵溫度范圍內(nèi)均能較好地生長。因此，這2株菌可作為潛在的益生菌菌株應用于肉制品的發(fā)酵，對其潛在的益生功能及安全性有待進一步的研究。

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