低場(chǎng)核磁共振技術(shù)測(cè)定石花菜對(duì)酸奶水分遷移及超微結(jié)構(gòu)的影響

林圣楠，李天驕，田永奇，陳雅霜，李夢(mèng)嬌，朱 豐，林向陽(yáng)*

（福州大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108）

水分是酸奶的重要成分，水分的存在狀態(tài)對(duì)于酸奶產(chǎn)品質(zhì)量的好壞起到了重要的作用。酸奶發(fā)酵和儲(chǔ)藏過(guò)程其實(shí)就是水與蛋白質(zhì)大分子和鈣等物質(zhì)相互作用的過(guò)程，這一過(guò)程涉及水分存在狀態(tài)的變化、水分的分布與遷移、水分與蛋白質(zhì)的結(jié)合與解析等[1-3]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)于低場(chǎng)核磁共振技術(shù)（nuclear magnetic resonance，NMR）測(cè)定奶制品的報(bào)道不絕于耳，但對(duì)石花菜酸奶中水分遷移特性及微結(jié)構(gòu)的研究罕見(jiàn)報(bào)道。萬(wàn)婕[4]采用核磁共振技術(shù)研究發(fā)酵及儲(chǔ)藏過(guò)程中酸奶的水分變化。結(jié)果表明，經(jīng)高壓處理的膳食纖維酸奶持水性更強(qiáng)，乳清不易析出。王兆龍[5]將核磁共振技術(shù)應(yīng)用在抗性淀粉酸牛奶中，結(jié)果表明，酸奶pH值與結(jié)合較緊密的水分子質(zhì)子密度線性相關(guān)。HINRICHSR等[6]利用核磁共振考察酸奶凝膠體系。LUCAST等[7]利用核磁共振評(píng)價(jià)配方中乳化劑的性質(zhì)、蛋白質(zhì)對(duì)脂肪的影響并通過(guò)測(cè)量橫向弛豫時(shí)間和縱向弛豫時(shí)間來(lái)研究液態(tài)和冷凍條件下的冰淇淋，此方法論證了在冷凍狀態(tài)下核磁共振依然可以測(cè)定氫質(zhì)子的結(jié)合狀態(tài)。BOTLAN D L等[8]通過(guò)對(duì)比示差掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）和低場(chǎng)核磁共振及其核磁成像技術(shù)（magnetic resonance imaging，MRI）測(cè)量乳脂肪固相脂肪指數(shù)比發(fā)現(xiàn)，NMR比DSC造成的誤差更低。DEAN RL等[9]將差示掃描量熱法與核磁共振結(jié)合，考察奶中氫質(zhì)子分布結(jié)合情況，結(jié)果表明，兩種方法相結(jié)合使不同的水-蛋白質(zhì)的反應(yīng)的區(qū)分更明顯。

利用核磁共振技術(shù)在食品研究上的優(yōu)勢(shì)，研究石花菜酸奶的弛豫參數(shù)，從而分析對(duì)比其與酸奶在發(fā)酵及儲(chǔ)藏過(guò)程中的水分狀態(tài)、水分遷移及水分分布具有重大意義。本實(shí)驗(yàn)利用低場(chǎng)核磁共振及其成像技術(shù)對(duì)比了石花菜酸奶發(fā)酵及冷藏后熟過(guò)程的水分遷移特性，從分子角度闡述了添加石花菜對(duì)酸奶水分遷移的影響；并采用環(huán)境掃描電鏡對(duì)石花菜酸奶和酸奶的超微形貌特征進(jìn)行觀察分析，從微觀角度分析了影響酸奶結(jié)構(gòu)及持水特性的因素。本試驗(yàn)采用低場(chǎng)核磁共振技術(shù)測(cè)定石花菜酸奶加工以及儲(chǔ)藏過(guò)程中弛豫時(shí)間和質(zhì)子密度的變化，結(jié)合核磁共振成像（MRI）獲得酸奶在各過(guò)程中高清晰度圖像，并采用環(huán)境掃描電鏡（environment scanning electron microscope，ESEM）對(duì)石花菜酸奶超微形貌特征進(jìn)行觀察分析，以確定酸奶最佳發(fā)酵時(shí)間及冷藏后熟時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石花菜：青島海悠悠商貿(mào)有限公司；高蛋白脫脂高鈣奶粉：內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司；白砂糖（食品級(jí)）：廈門(mén)古龍食品有限公司；HOWARU乳雙歧桿菌HN019：杜邦丹尼斯克公司；厭氧產(chǎn)氣袋、圓底立式培養(yǎng)袋、氧氣指示劑：青島雅各化學(xué)試劑銷(xiāo)售有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CJM-SC-A型高能納米沖擊磨：秦皇島太極環(huán)納米制品有限公司；MINIMR核磁共振分析儀（23 MHz，0.56 T）：上海紐邁電子科技有限公司；FM200實(shí)驗(yàn)室高剪切分散乳化機(jī)：上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司；KQ-300VDE型三頻數(shù)控超聲波清洗器；昆山市超聲儀器有限公司；BC/BD-217CH冷柜：河南新飛電器有限公司；BS110S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；VF-12型廣州匯利醒發(fā)箱：佛山市南海港洋機(jī)電設(shè)備有限公司；XL30 ESEM-TMP型環(huán)境掃描電鏡：荷蘭Philips-FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 石花菜酸奶的制備

石花菜的前處理：將干凈的石花菜經(jīng)高能納米沖擊磨粉碎得到石花菜粉末，然后在石花菜粉中加入蒸餾水，在90℃、80 kHz條件下超聲120 min，充分浸提出石花菜中的營(yíng)養(yǎng)成分，并趁熱抽濾得石花菜瓊膠溶液[10]。

以蔗糖添加量11%、石花菜瓊膠溶液添加量20%、雙歧桿菌接種量1.5%，于高蛋白脫脂高鈣奶粉配制的濃度為12.5%的復(fù)原乳中，并置于45℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵，4℃條件培養(yǎng)冷藏后熟24 h[10]。利用核磁共振技術(shù)分別測(cè)定發(fā)酵0、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、36 h、48 h時(shí)石花菜酸奶中的水分遷移行為。

1.3.2 酸奶的制備

以蔗糖添加量11%、雙歧桿菌接種量1.5%于高蛋白脫脂高鈣奶粉配制的濃度為12.5%的復(fù)原乳中，并置于45℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵，4℃條件培養(yǎng)冷藏后熟24 h。利用核磁共振技術(shù)分別測(cè)定發(fā)酵0、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、36 h、48 h時(shí)酸奶中的水分遷移行為。

1.3.3 核磁共振試驗(yàn)及其參數(shù)設(shè)定

稱取約2.500 g樣品放入玻璃試管（口徑18 mm），而后將樣品管置于NMR探頭中（保持溫度32℃），使用CPMG序列測(cè)試橫向弛豫時(shí)間T2，其中接收機(jī)帶寬是SW=200 kHz，采樣起始點(diǎn)控制參數(shù)RFD=0.080 ms，重復(fù)采樣時(shí)間間隔TW=4 000.000 ms，模擬增益RG1=20.0 db，90°和180°脈寬分別是P90=20.00μs，P180=39.00μs，采樣點(diǎn)數(shù)TD=207 830，數(shù)字增益DRG1=3，數(shù)據(jù)半徑DR=1，累加掃描次數(shù)NS=8，回波個(gè)數(shù)NECH=5 000。試驗(yàn)測(cè)3份平行。

反演所得的圖譜獲得弛豫時(shí)間T2和質(zhì)子密度M2。弛豫時(shí)間T2表征水分流動(dòng)性大小，當(dāng)弛豫時(shí)間T2越大，水流動(dòng)性越大，水分結(jié)合越松，質(zhì)子密度M2表征弛豫時(shí)間下水分的含量[11-14]。

1.3.4 低場(chǎng)核磁共振測(cè)定核磁共振成像試驗(yàn)及參數(shù)設(shè)定

采用多層自旋回波序列（multi-slice echo，MSE）進(jìn)行質(zhì)子加權(quán)成像，Y軸為選層梯度，X軸為相位梯度，Z軸為讀出梯度，90°和180°軟脈沖均為1 200μs，重復(fù)采樣時(shí)間D0為1 000.000 ms，半回波時(shí)間D4為0.100 ms，選層梯度脈沖（90°）對(duì)應(yīng)的補(bǔ)償梯度GA1為13.5%，選層梯度脈沖（180°）對(duì)應(yīng)的補(bǔ)償梯度脈沖GA2為80.0%，相位編碼脈沖的幅度GA3為35.0%，頻率編碼方向的補(bǔ)償梯度脈沖的幅度GA4為57.0%，頻率編碼脈沖的幅度GA5為30.0%[11-14]。

1.3.5 環(huán)境掃描電鏡試驗(yàn)及參數(shù)設(shè)定

取一定量酸奶、石花菜酸奶樣品置于-18℃冷柜中預(yù)凍7 h，后置于-80℃超低溫冰箱中冷凍4 h，取出后立即凍干24 h。再將凍干后的樣品噴金，抽真空后在15.0 V加速電壓下進(jìn)行掃描電鏡測(cè)試[15]。

1.3.6 樣品數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)采用Excel軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 石花菜酸奶核磁共振分析

本課題利用核磁共振儀對(duì)酸奶及石花菜酸奶發(fā)酵及貨架期的自旋-自旋弛豫時(shí)間進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，軟件擬合后得到2個(gè)峰。酸奶橫向弛豫時(shí)間范圍T21（57.223 68～75.646 33 ms）較小，質(zhì)子密度M21也較小，說(shuō)明T21水分子可能是形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)孔隙中所束縛的不易流動(dòng)的水，氫鍵結(jié)合力度較強(qiáng)，也可能是與蛋白質(zhì)等大分子結(jié)合較緊密的那部分水，橫向弛豫時(shí)間范圍T22（200.923 3～464.158 88 ms）比T21高，且質(zhì)子密度M22也較高，說(shuō)明T22水分子結(jié)合較為疏松，流動(dòng)性較高[16-20]。由峰比例可以看出，T21與T22的峰比例為0.015 39∶0.984 6，T21結(jié)果不顯著（P＞0.05），因此，以研究T22峰面積變化為主。以T22及該組分水對(duì)應(yīng)的質(zhì)子密度M22為主要指標(biāo)，結(jié)合質(zhì)子密度成像結(jié)果和環(huán)境掃描電鏡成像分析酸奶發(fā)酵凝乳結(jié)構(gòu)的變化，對(duì)石花菜酸奶和酸奶水分遷移特性進(jìn)行比較。

圖1 石花菜酸奶橫向弛豫時(shí)間分布Fig.1 Transverse relaxation time distribution of Gelidium amansii yoghurt

2.2 不同發(fā)酵時(shí)間石花菜酸奶及酸奶的核磁共振數(shù)據(jù)變化

酸奶發(fā)酵后水分子與蛋白質(zhì)分子交聯(lián)形成凝膠空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。發(fā)酵及貯藏時(shí)間是決定酸奶品質(zhì)的關(guān)鍵因素，時(shí)間過(guò)短，乳酸產(chǎn)生較少，pH尚未降低到等電點(diǎn)，酪蛋白未能完全解離與疏水鍵、氫鍵和靜電斥力等形成三維凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，造成酸奶膠黏性降低，未能形成凝乳結(jié)構(gòu)。而發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，菌利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)后產(chǎn)生代謝產(chǎn)物累積，造成酸環(huán)境紊亂，凝膠結(jié)構(gòu)被破壞，酸奶分層，乳清析出。所以，探索酸奶最適發(fā)酵時(shí)間具有重要意義，不同發(fā)酵及貯藏時(shí)間酸奶的橫向馳豫時(shí)間結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，兩種酸奶橫向弛豫時(shí)間T22總體都是先增加后減少。這可能是因?yàn)榘l(fā)酵過(guò)程使得酸奶體系組分遷移，水分流動(dòng)性增加。奶中的酪蛋白膠束解離后利用疏水鍵、氫鍵和靜電斥力等形成三維凝膠網(wǎng)絡(luò)，因此水分子在水與水之間的快速交換含蛋白質(zhì)和游離水，酸奶體系組分遷移，促使之前與蛋白質(zhì)等大分子結(jié)合較緊密的組分獲得一定流動(dòng)性[11-14]。當(dāng)酸奶冷藏后期，弛豫時(shí)間降低，主要是因?yàn)樾纬赡榫W(wǎng)絡(luò)，大部分自由水被束縛在凝膠網(wǎng)絡(luò)微孔中，水分流動(dòng)性減小，持水性增強(qiáng)。

圖2 酸奶發(fā)酵時(shí)間對(duì)橫向弛豫時(shí)間T22的影響Fig.2 Effect of yogurt fermentation time on transverse relaxation time T22

由圖2可知，石花菜酸奶在0～6 h前橫向弛豫時(shí)間總體大于不添加石花菜發(fā)酵的酸奶，而6～48 h時(shí)，石花菜酸奶的橫向弛豫時(shí)間反而小于酸奶，24 h趨于穩(wěn)定。發(fā)酵初始，由于添加了石花菜瓊膠熱溶液與復(fù)原乳混合，水分流動(dòng)性增加，而在發(fā)酵過(guò)程中，水分子與瓊脂中的疏水主鏈通過(guò)氫鍵結(jié)合，石花菜瓊膠溶液從雙螺旋結(jié)構(gòu)逐漸形成三維網(wǎng)狀的凝膠結(jié)構(gòu)，形成瓊脂聚合物。蛋白質(zhì)酪蛋白膠束與瓊膠分子間相互纏結(jié)形成網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)，三維網(wǎng)狀凝膠結(jié)構(gòu)結(jié)合更加緊密，因此添加石花菜瓊膠的酸奶具有較高的持水能力，體系水分流動(dòng)性較低。貯藏階段，酸奶的橫向弛豫時(shí)間略微增大，主要是由于分子間氫鍵斷裂，同時(shí)凝乳的結(jié)構(gòu)被破壞導(dǎo)致與大分子結(jié)合的水分游離出來(lái)，乳清析出，流動(dòng)性變強(qiáng)，這同時(shí)也說(shuō)明了添加石花菜瓊膠有利于酸奶的持水性和穩(wěn)定性[11-14]。因此，發(fā)酵6 h時(shí)達(dá)到最佳狀態(tài)，此時(shí)橫向弛豫時(shí)間最大。24 h時(shí)石花菜酸奶橫向弛豫趨于穩(wěn)定，將發(fā)酵24 h的石花菜酸奶取出用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

為進(jìn)一步分析在不同發(fā)酵時(shí)間條件下酸奶持水能力的變化，以T22組分的質(zhì)子密度M22作為對(duì)象進(jìn)行研究，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同酸奶發(fā)酵時(shí)間對(duì)質(zhì)子密度M22的影響Fig.3 Effect of different yogurt fermentation time on proton density M22

由圖3可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，質(zhì)子密度M22逐漸下降，說(shuō)明持水性增加。這可能是因?yàn)樗崮淘诎l(fā)酵過(guò)程中，牛乳中的酪蛋白形成三維凝膠網(wǎng)絡(luò)，流動(dòng)性較大的水分子束縛在網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的孔隙中，降低了水分流動(dòng)性，增加持水性。而酸奶質(zhì)子密度M22在48 h時(shí)略微增加，可能是因?yàn)樗崮腆w系中形成的蛋白質(zhì)膠體結(jié)構(gòu)被破壞，乳清析出，造成體系水分流失[11]。

由圖3還可看出，添加石花菜瓊膠發(fā)酵的酸奶水分含量逐漸高于不添加石花菜瓊膠的酸奶，這是因?yàn)槭ú谁偰z與牛乳酪蛋白的相互作用，石花菜瓊膠通過(guò)雙螺旋結(jié)構(gòu)的羥基與相鄰的螺旋或水分子進(jìn)行氫鍵結(jié)合，凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更為緊密。流動(dòng)性較大的水分子被包裹在三維網(wǎng)狀凝膠結(jié)構(gòu)內(nèi)部，內(nèi)部的氫鍵束縛住更多自由水，增強(qiáng)穩(wěn)定性，提高持水性，降低流動(dòng)性。

2.3 石花菜酸奶及酸奶核磁共振成像結(jié)果

石花菜酸奶和酸奶在發(fā)酵24 h時(shí)的MRI質(zhì)子密度成像結(jié)果見(jiàn)圖4，質(zhì)子密度越大則圖像越亮，代表此部分水分分布越多。由圖4可知，石花菜酸奶樣品成像區(qū)域亮度比酸奶亮，即含水量比酸奶多，持水性更好。由MRI結(jié)果直觀地監(jiān)測(cè)到水分分布狀態(tài)，石花菜酸奶較亮，水分含量較多，說(shuō)明加入了石花菜瓊膠使得水分被凝膠結(jié)構(gòu)所包圍，使得水分不游離出來(lái)。而酸奶樣品周?chē)^暗，說(shuō)明水分分布從酸奶表面流失，乳清析出，分子間氫鍵斷裂，凝乳的結(jié)構(gòu)被破壞，與大分子結(jié)合的水分部分游離出來(lái)，圖像亮度較暗[21]。

圖4 石花菜酸奶（a）及酸奶（b）的質(zhì)子密度成像結(jié)果Fig.4 Results of proton density images of Gelidium amansii yogurt(a)and yogurt(b)

2.4 環(huán)境掃描電鏡成像結(jié)果

實(shí)驗(yàn)對(duì)石花菜瓊膠、發(fā)酵24 h的酸奶、石花菜酸奶取樣并在環(huán)境掃描電鏡進(jìn)行測(cè)試，觀察酸奶的微觀結(jié)構(gòu)，酸奶、石花菜瓊膠、石花菜酸奶的微觀結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖5。由圖5可知，將石花菜瓊膠添加到高蛋白低脂高鈣復(fù)原乳中發(fā)酵的酸奶，凝膠過(guò)程中，蛋白質(zhì)酪蛋白膠束與瓊膠分子間相互纏結(jié)，蛋白鏈球顆粒粘結(jié)在致密的瓊膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)之中交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。電鏡成像結(jié)果與弛豫特性測(cè)定結(jié)果相一致，添加石花菜瓊膠發(fā)酵，瓊膠結(jié)構(gòu)致密，與蛋白鏈球充分粘結(jié)在一起形成一個(gè)整體，蛋白顆粒交聯(lián)形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，此階段為石花菜酸奶發(fā)酵完成階段[22]。

圖5 環(huán)境掃描電鏡成像結(jié)果（×10 000）Fig.5 Results of environment scanning electron microscope images(×10 000)

3 結(jié)論

利用低場(chǎng)核磁共振儀中CPMG序列測(cè)定石花菜酸奶及酸奶的橫向弛豫時(shí)間T2，經(jīng)軟件擬合后共得到兩個(gè)組分的峰，它們代表酸奶中流動(dòng)性不同的水分，分別為結(jié)合較為緊密的水T21（57.223 68～75.646 33 ms）和流動(dòng)性較大的水T22（200.9233～464.15888ms）。以質(zhì)子密度M22為主要指標(biāo)，結(jié)合成像結(jié)果，研究酸奶在發(fā)酵及儲(chǔ)藏過(guò)程中的水分遷移及水分狀態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)石花菜酸奶的水分含量變化幅度小于酸奶，說(shuō)明了添加石花菜瓊膠的酸奶持水性更強(qiáng)。確定了最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間為6h，后熟時(shí)間為24h。通過(guò)環(huán)境掃描電鏡技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)添加石花菜瓊膠發(fā)酵的酸奶，其蛋白質(zhì)酪蛋白膠束與瓊膠分子間相互纏結(jié)，蛋白鏈球顆粒粘結(jié)在致密的瓊膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)之中，持水性提高，與核磁共振分析結(jié)果一致。

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