丹酚酸B通過mTOR/Ulk1信號通路誘導膠質(zhì)瘤細胞C6自噬性死亡

趙 敏 張 瑜 張 嵐 劉 欣 王新成

(鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，鄭州 450000)

惡性膠質(zhì)瘤是中樞系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，具有高致死率和高轉(zhuǎn)移率的特點[1]。目前對于惡性膠質(zhì)瘤的治療仍以手術(shù)治療為主，但由于其具有較高的復(fù)發(fā)率，使患者術(shù)后存活時間不足15個月[2]。因此，尋找新的治療方法及藥物是降低惡性膠質(zhì)瘤死亡率的關(guān)鍵。近年來，天然藥物的抗癌活性越來越受到關(guān)注。丹酚酸B(Salvianolic acid B,Sal B)是中藥丹參的主要活性成分，現(xiàn)代研究表明其具有抗氧化、抗炎、抗凝血和免疫調(diào)節(jié)等活性[3-5]，并能抑制肝癌、乳腺癌和鱗狀上皮癌等癌癥的惡化[6-8]。同時，有研究表明，Sal B能通過調(diào)控ROS的產(chǎn)生誘導人膠質(zhì)瘤細胞凋亡[9]。此外，Sal B還能通過調(diào)控自噬影響直腸癌細胞和肝癌細胞的增殖[10,11]。自噬是調(diào)控癌癥發(fā)展的重要機制之一，但Sal B是否能通過自噬影響膠質(zhì)瘤細胞的存活還未見報道。因此，本研究將探討Sal B對膠質(zhì)瘤細胞C6自噬的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Gibco公司;Sal B購自成都普瑞法科技公司;酶標儀購自美國Biotek公司;CO2培養(yǎng)箱購自德國Binder公司;流式細胞儀購自美國ThermoFisher公司;電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀均購自美國Bio-RAD公司;CCK8試劑盒和BCA試劑盒購自南京建成生物科技公司;Ki67、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin)、UNC-51樣激酶-(UNC-51-like kinase 1,Ulk1)、自噬相關(guān)蛋白5(Autophagy-related peotein 5,Atg5)、Atg7、 Atg12、 Beclin1、 p62和 LC3一抗均購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞C6購自ATCC。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將細胞培養(yǎng)于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中，每3天換液一次。

1.2.2CCK8檢測細胞活性 待細胞匯合率達到80%以上時，將細胞消化接種至96孔板中，培養(yǎng)24 h后，加入CCK8試劑，繼續(xù)孵育2 h，用酶標儀于450 nm處檢測吸光度，計算細胞活性。

1.2.3流式細胞術(shù) 細胞匯合率達到80%以上后，用0.25%胰蛋白酶消化收集C6細胞，加入預(yù)冷的70%乙醇4℃固定1 h，固定完成后加入PI和FITC-Annexin V室溫孵育15 min，流式細胞儀檢測Sal B處理后膠質(zhì)瘤細胞凋亡情況。

1.2.4Western blot 用RIPA蛋白裂解液提取細胞總蛋白，根據(jù)BCA試劑盒說明書檢測蛋白質(zhì)濃度并調(diào)平蛋白濃度。用12% SDS-PAGE分離蛋白后，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜。用5%脫脂奶粉室溫孵育含有蛋白質(zhì)的PVDF膜2 h，加入適應(yīng)濃度一抗4℃封閉過夜。一抗封閉完成后，用TBST緩沖液洗膜3次，加入對應(yīng)二抗室溫孵育1 h，最后滴加ECL于暗室曝光顯影。

1.2.5免疫熒光 將C6細胞接種于提前用0.1%PLL包被的24孔板中，培養(yǎng)24 h后用4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS清洗3次后，滴加0.5% TrintonX-100室溫透膜15 min，加入Rabbit anti-LC3(1∶200)4℃孵育過夜，次日用PBS清洗3次，加入Goat anti-rabbit二抗室溫封閉1 h后，加入DAPI即用液進行復(fù)染，最后每孔隨機選取6個視野拍照統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1Sal B對膠質(zhì)瘤細胞活性的影響 為了探究Sal B對膠質(zhì)瘤細胞活性的影響，我們采用CCK8法檢測不同濃度Sal B處理后C6細胞的活性。實驗結(jié)果表明，Sal B濃度在50 μmol/L以下時對C6細胞活性無明顯影響；Sal B達到100 μmol/L時，細胞活性降至80%以下(圖1)。因此，我們選擇了對細胞無明顯毒副作用的高中低三個劑量(10、20、50 μmol/L)進行后續(xù)實驗。

2.2Sal B對膠質(zhì)瘤細胞凋亡的影響 Sal B可誘導多種癌細胞凋亡。流式實驗結(jié)果表明，Sal B能顯著促進膠質(zhì)瘤細胞凋亡，并隨Sal B濃度的升高，作用逐漸增強，體現(xiàn)量效關(guān)系(圖2)；同時，與C6組比較，20 μmol/L組和50 μmol/L組細胞增殖標記蛋白Ki67的表達水平明顯降低；此外，20 μmol/L組和50 μmol/L組凋亡標記蛋白Caspase-3、Bax的表達水平較C6組比較明顯升高，Sal B還能明顯抑制Bcl-2的表達，并體現(xiàn)量效關(guān)系(圖3)。

圖1 Sal B對膠質(zhì)瘤細胞活性的影響Fig.1 Effect of Sal B on cell viability of glioma cellsNote:Glioma cells were seed in 96-well plate and treated with Sal B with different concentrations.Cell viability was measured by CCK8 assay.A.The stracture of Sal B;B.The cell viability of C6 cells was determined by CCK8 assay.n=6,every experiment was repeated at least three times.

圖2 Sal B對膠質(zhì)瘤細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of Sal B on apoptosis of glioma cellNote:Cell were divided into C6 10 μmol/L,20 μmol/L and 50 μmol/L group and treated with Sal B for 24 h.C6 group was treated as control.Flow cytometry was performed for cell apoptosis of C6 cell.*.P<0.05,**.P<0.01 versus C6 group.

圖3 Sal B對增殖、凋亡標記蛋白表達的影響Fig.3 Effects of Sal B on expressions of proliferation-,apoptosis-related proteinsNote:A.The expressions of Ki67,cleaved caspase-3,Bcl-2 and Bax were measured by Western blot;B.The quantification of protein levels of Ki67,cleaved caspase-3,Bcl-2 and Bax .

圖4 Sal B對膠質(zhì)瘤細胞自噬及對mTOR/Ulk1通路的影響Fig.4 Effects of Sal B on autophagy and mTOR/Ulk1 pathway of glioma cellNote:A.The expressions of mTOR,Ulk1,Atg5,Atg7,Atg12,Beclin1,p62 and LC3 were measured by Western blot;B.The quantification of protein levels.GAPDH was used as loading control.*.P<0.05,**.P<0.01 versus C6 group.

2.3Sal B對膠質(zhì)瘤細胞自噬及對mTOR/Ulk1通路的影響 為了探究Sal B對膠質(zhì)瘤細胞自噬的影響，我們檢測了自噬相關(guān)蛋白的表達情況。如圖4所示，Sal B(10、20、50 μmol/L)能顯著促進自噬標記蛋白Atg5、Atg7、Atg12和Beclin1的表達，升高LC3Ⅱ/Ⅰ的比值(圖4)；與C6組比較，Sal B 20 μmol/L 組和50 μmol/L組p62的蛋白表達水平明顯降低(圖4)；同時，Sal B能顯著促進LC3陽性熒光斑點的形成，并隨濃度增加，促進作用逐漸增強(圖5)，提示Sal B可誘導膠質(zhì)瘤細胞發(fā)生自噬；此外，Sal B明顯促進了Ulk1的表達(圖4)；濃度為20 μmol/L 和50 μmol/L 時，明顯抑制了mTOR的表達，并體現(xiàn)出量效關(guān)系(圖4)，提示Sal B可能通過抑制mTOR/Ulk1信號通路的激活促進膠質(zhì)瘤細胞自噬。

圖5SalB對膠質(zhì)瘤細胞LC3含量的影響

Fig.5EffectofSalBonexpressionlevelofLC3ingliomacells

Note: The level of LC3 was measured by immunofluorescence.*.P<0.05,**.P<0.01，***.P<0.001 versus C6 group.

3 討論

膠質(zhì)瘤是一類具有較高轉(zhuǎn)移率和死亡率的惡性腫瘤，其發(fā)病率占神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤的60%[12]。目前尚未有研究表明有藥物可明顯影響膠質(zhì)瘤的預(yù)后。近年來的研究表明，天然藥物在抗腫瘤方面具有較好的療效。Sal B是中藥丹參的主要活性成分之一，現(xiàn)代研究表明Sal B具有較強的抗腫瘤活性[9,11,13]。本文研究發(fā)現(xiàn)，在Sal B對膠質(zhì)瘤細胞無明顯細胞毒性的條件下，Sal B可明顯抑制細胞增殖標記蛋白Ki67的表達，表明其能夠抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖。

細胞凋亡是指細胞程序性死亡。在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中，細胞凋亡被明顯抑制，從而促進癌細胞無限增殖[14]。研究表明，Sal B具有較強的促進癌細胞凋亡活性。Sal B可通過誘導凋亡抑制神經(jīng)母細胞瘤、頭頸部鱗狀細胞癌和結(jié)腸癌等的細胞增殖[8,15-17]。也有研究報道稱Sal B能明顯促進人膠質(zhì)瘤細胞U87發(fā)生細胞凋亡[9]。本文研究也發(fā)現(xiàn)，Sal B能顯著增強膠質(zhì)瘤細胞C6的凋亡程度，從而抑制C6細胞增殖。同時，Sal B還明顯促進了細胞凋亡標記分子Cleaved caspase-3和Bax的表達，降低Bcl-2的蛋白表達水平。其中，Bcl-2是影響細胞凋亡的主要調(diào)控分子，其在多種癌癥中均呈高表達狀態(tài)[18,19]。Bcl-2過度表達可誘導癌癥的發(fā)生和癌細胞的轉(zhuǎn)移[20]。Bax則是Bal-2活性的主要調(diào)控分子，在調(diào)控癌細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用[21]。結(jié)合實驗結(jié)果表明，Sal B可通過調(diào)節(jié)凋亡調(diào)控分子的表達促進膠質(zhì)瘤細胞凋亡，減緩膠質(zhì)瘤的惡化進程。

自噬是人體第二類細胞程序性死亡過程[22]。研究表明，自噬在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著“雙刃劍”的作用。早期可通過抑制原癌基因激活而防止癌癥的發(fā)生，癌癥發(fā)生后，自噬一方面能為癌細胞提供營養(yǎng)，另一方面又可造成細胞的死亡[23]。有研究報道表明，在膠質(zhì)瘤發(fā)展過程中，細胞自噬明顯被抑制，從而促進了癌細胞增殖[1]。細胞死亡是自噬和細胞凋亡相互調(diào)控的結(jié)果。我們已經(jīng)證明Sal B可促進C6細胞的凋亡，進一步研究發(fā)現(xiàn)，Sal B能明顯促進細胞自噬標記蛋白Atg5、Atg7、Atg12和Beclin1的表達，升高了LC3Ⅱ/Ⅰ的比值，同時還降低了p62的蛋白表達水平。此外，Sal B還能促進LC3陽性熒光斑點的形成。其中Atg5、Atg12和Beclin1在自噬的起始階段發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，Atg7和LC3主要參與自噬小體形成，p62主要存在于細胞核，隨著自噬的進行，p62會不斷被降解，其表達水平與自噬程度呈負相關(guān)[24,25]。結(jié)合實驗結(jié)果表明，Sal B可明顯促進膠質(zhì)瘤細胞自噬的發(fā)生。

mTOR/Ulk1通路是調(diào)控自噬的重要信號通路之一[26]。在自噬起始階段，mTOR活性被上游基因抑制，從而激活下游靶基因Ulk1，Ulk1的激活會誘導Atg復(fù)合體的形成，完成自噬小體基本結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。同時，復(fù)合物會促進LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化，隨后LC3Ⅱ在Atg7和Atg3的作用下轉(zhuǎn)移至細胞膜，完成自噬體的形成[24,27]。mTOR可通過抑制Ulk1的激活抑制自噬[26]。已有研究表明，Sal B可通過調(diào)控AKT/mTOR信號通路誘導肝癌細胞自噬[10]。本文研究發(fā)現(xiàn)，Sal B可抑制mTOR的表達，促進Ulk1蛋白表達，表明Sal B可促進膠質(zhì)瘤細胞mTOR/Ulk1信號通路的激活。上述實驗結(jié)果表明，Sal B可通過調(diào)控mTOR/Ulk1信號通路的激活促進膠質(zhì)瘤細胞自噬。

綜上所述，Sal B可抑制膠質(zhì)瘤細胞凋亡、促進癌細胞發(fā)生自噬死亡，提示調(diào)控自噬可能成為一種新的抗腫瘤途徑，并且其機制與調(diào)控mTOR/Ulk1信號通路激活有關(guān)。

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