地塞米松體外短期處理影響Ⅰ型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與自然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞平衡*

黃麗艷 歐志兵 謝 婷 廖湘平 張 健 劉文培 瞿小旺

(南華大學(xué)附屬郴州醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，郴州 423000)

糖皮質(zhì)激素是免疫系統(tǒng)重要的調(diào)節(jié)器，內(nèi)源性激素對(duì)新陳代謝、生長(zhǎng)發(fā)育等許多生理過程都極其重要，還可以保護(hù)機(jī)體免受強(qiáng)烈免疫反應(yīng)的不良影響。1948年以來，合成的糖皮質(zhì)激素由于其強(qiáng)有力的抗炎和免疫抑制活性，被廣泛應(yīng)用于治療多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病、過敏、腫瘤以及器官移植后預(yù)防排斥反應(yīng)[1-4]。然而糖皮質(zhì)激素的分解活動(dòng)會(huì)在間質(zhì)組織中引起嚴(yán)重的副作用，如皮膚萎縮、肌無力和骨質(zhì)疏松；而糖皮質(zhì)激素在肝臟的新陳代謝尤其是糖異生會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗和糖尿病。因此，在分子水平上理解這種多效激素對(duì)不同細(xì)胞類型的特異性影響，是維持糖皮質(zhì)激素的治療效果和克服副作用發(fā)展策略所必需的。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)，是1995年由Sakaguchi等[5]首次報(bào)道的一種具有免疫抑制作用的T細(xì)胞亞群，其表型為CD4+Foxp3+CD25+T[6]。Treg在機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)、 移植耐受、 腫瘤免疫逃逸、自身免疫性疾病等過程中都發(fā)揮重要作用，是維持機(jī)體免疫耐受的重要調(diào)控者[7,8]。Ⅰ型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tr1)作為誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞，表型為CD4+CD25-LAG-3+T，主要通過分泌 IL-10、TGF-beta等物質(zhì)而發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)控作用[9]。Tr1在過敏性疾病及器官移植后發(fā)揮免疫耐受作用[10,11]，在炎癥性腸病中Tr1可以進(jìn)入炎癥部位發(fā)揮抗炎作用[12]；Tr1缺乏或功能受損會(huì)導(dǎo)致多發(fā)性硬化等自身免疫性疾病[13]；然而Tr1過多會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)增和免疫逃逸[14]。在丙型病毒性肝炎患者的肝臟組織內(nèi)Tr1過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致干擾素治療的無反應(yīng)性，從而進(jìn)展為肝炎后肝硬化和肝癌[15]。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在有炎癥性疾病的人和小鼠體內(nèi)都可以被地塞米松誘導(dǎo)[16,17]，地塞米松可以恢復(fù)過敏癥患者體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量和功能[18]，然而機(jī)制尚不明確。本研究擬通過地塞米松體外短期處理外周血淋巴細(xì)胞，探究地塞米松對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞平衡的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑

1.1.1研究對(duì)象 收集健康人外周血樣，所有納入對(duì)象均無肝炎、艾滋、梅毒等血液傳播疾病，近期均未使用過糖皮質(zhì)激素。該研究在郴州市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)和志愿者知情同意下進(jìn)行。

1.1.2流式抗體 鼠抗人CD3 APC-eFluor 780(SK7)、鼠抗人CD8a APC(OKT8)、鼠抗人CD127 APC(eBioRDR5)、兔抗人Foxp3 PE-eFluor?610(PCH101)購于美國(guó)eBioscience公司；鼠抗人CD4 BUV737(SK3)、鼠抗人CD8 BUV737(SK1)、鼠抗人CD25 PE-CyTM5(M-A251)購于美國(guó)BD公司；鼠抗人LAG-3 FITC(17B4)購于美國(guó)Lifespan公司。

1.1.3儀器 應(yīng)用MOFLO XDP流式細(xì)胞儀(美國(guó)BECKMAN公司) 獲取并分析細(xì)胞，F(xiàn)lowJo.10.0軟件分析流式數(shù)據(jù)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞準(zhǔn)備 取外周血8～10 ml肝素鈉抗凝，在離心管中加入2倍血液體積的淋巴細(xì)胞分離液，2 200 r/min離心22 min，然后吸出中間白細(xì)胞層加入到裝有15 ml RPMI1640的離心管1 800 r/min離心6 min，棄上清，將細(xì)胞用1 ml 10%FBS+RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸計(jì)數(shù)，然后每孔以0.2～0.25(106)個(gè)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)至96孔平底板中，用地塞米松(109～105mol/L)或10%FBS+RPMI1640完全培養(yǎng)基200 μl/孔處理3 d，流式檢測(cè)相應(yīng)細(xì)胞標(biāo)志物。

1.2.2細(xì)胞表面染色 按多色分析法進(jìn)行染色，以1∶1 000比例稀釋Livedead，每孔加100 μl稀釋好的Livedead，室溫30 min避光孵育，染抗體前加5% Fc Receptor Blocking Solution 25 μl/孔，室溫培養(yǎng) 5 min，以阻斷Fc受體非特異性結(jié)合。然后以50 μl/孔的總體系表面染CD3、CD4、CD8、CD127、CD25、LAG-3室溫避光30 min，1 800 r/min離心4 min、洗滌，重復(fù)3次。

1.2.3Foxp3染色 表面染后根據(jù)Foxp3 Perm/Fix試劑盒說明書室溫下40 min避光破核膜，3次離心洗滌后染Foxp3抗體。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS.20統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，正態(tài)分布用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1地塞米松體外短期處理增加CD4+T細(xì)胞頻率且呈劑量依賴性 為了探討地塞米松對(duì)CD4+T細(xì)胞的影響，我們用不同濃度(109～105mol/L)的地塞米松處理健康人外周血淋巴細(xì)胞3 d，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，地塞米松處理后CD4+T細(xì)胞的頻率顯著增高(圖1)(P值分別為P=0.058、P=0.009、P=0.006、P=0.02、P=0.003)，且隨著濃度的增加均值增大，提示地塞米松增加CD4+T細(xì)胞的頻率，且呈劑量依賴性。

圖1 地塞米松對(duì)CD4+T細(xì)胞頻率的影響(n=10) Fig.1 Effect of dexamethasone on frequency of CD4+T cells(n=10)Note: A.Flow analysis diagram of CD4+T cells；B.The effect of different doses of dexamethasone on CD4+T cells frequency.

圖2 地塞米松對(duì)CD4+T細(xì)胞表型的影響(n=12) Fig.2 Effect of dexamethasone on phenotype of CD4+T cells(n=12) Note: A.Flow analysis diagram of CD4+T cell phenotype；B.The effect of dexamethasone on the expression of CD25，F(xiàn)oxp3，CD127 and LAG-3 on CD4+T cells.

圖3 地塞米松影響自然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 (n=10) Fig.3 Effect of dexamethasone on regulatory T cells(n=10)Note: A.Flow analysis diagram of regulatory T cells;B.Dexamethasone reduced the Treg frequency.

圖4 地塞米松對(duì)Tr1細(xì)胞及Tr1/Treg細(xì)胞比率的影響(n=8)Fig.4 Effect of dexamethasone on Tr1 and ratio of Tr1/Treg cells (n=8)Note: A.Flow analysis diagram of regulatory Tr1;B.Dexamethasone increase Tr1 frequency;C.The ratio of Tr1/Treg cells increased.

2.2地塞米松體外短期處理改變CD4+T細(xì)胞表型 為了明確地塞米松處理后對(duì)CD4+T表型影響，我們分析了健康人外周血CD4+T細(xì)胞上CD127、CD25、LAG-3和Foxp3的表達(dá)情況(圖2)，我們發(fā)現(xiàn)地塞米松刺激后CD25和 Foxp3顯著降低(P值分別為P=0.006和P<0.0001)，而CD127和LAG-3顯著升高(P值分別為P<0.0001和P=0.011)，提示地塞米松處理改變CD4+T細(xì)胞的表型。

2.3地塞米松體外短期處理影響Treg和Tr1平衡 在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，地塞米松處理后Treg頻率顯著降低，如圖3 (P<0.0001)，而Tr1頻率增高，如圖4(P=0.051)，且Tr1/Treg細(xì)胞比率升高(P=0.044)，提示地塞米松改變Tr1/Treg細(xì)胞平衡。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，地塞米松短期體外處理增加CD4+T細(xì)胞頻率且呈劑量依賴性，降低CD4+T細(xì)胞上CD25和 Foxp3的表達(dá)，增加CD127和LAG-3表達(dá)；地塞米松處理顯著降低Treg，升高Tr1，且Tr1/Treg比率顯著增高。糖皮質(zhì)激素短期處理改變Tr1/Treg細(xì)胞平衡。

CD4+輔助性T細(xì)胞具有可塑性，可分為多種亞類，包括Th1、Th2、Th17和最近確認(rèn)的Th9、Th22以及與抗體產(chǎn)生有關(guān)的濾泡輔助性T細(xì)胞等。另一類具有免疫調(diào)節(jié)性的CD4+T細(xì)胞包括Treg,Tr1等。本研究顯示體外地塞米松處理增加CD4+T細(xì)胞頻率且呈劑量依賴性。Lim[1]發(fā)現(xiàn)不同劑量的地塞米松作用效果不一樣，低劑量的地塞米松使巨噬細(xì)胞功能增加，而大劑量的地塞米松對(duì)巨噬細(xì)胞功能具有免疫抑制性。陳艷等[19]的研究表明地塞米松對(duì)骨形成有抑制作用，且呈劑量依賴性。進(jìn)一步研究地塞米松對(duì)CD4+T細(xì)胞的表型影響后發(fā)現(xiàn)，CD4+T細(xì)胞上的Foxp3和CD25表達(dá)顯著降低，表明糖皮質(zhì)激素可能降低Treg頻率，結(jié)果與Pandolfi等[20]的研究一致。Wang等[18]用地塞米松處理過敏性哮喘小鼠，發(fā)現(xiàn)CD4+Foxp3+T細(xì)胞在體外實(shí)驗(yàn)中增加，而Prado等[21]認(rèn)為地塞米松增加Foxp3表達(dá)，但不增加其調(diào)節(jié)性活性。本研究還發(fā)現(xiàn)地塞米松體外處理后上調(diào)CD4+T細(xì)胞上CD127和LAG-3的表達(dá),研究結(jié)果與Denis和Hai-Chon等一致[22-24]。

通過分析Foxp3和LAG-3分別為Treg和Tr1調(diào)節(jié)性T細(xì)胞典型標(biāo)志物。地塞米松處理下調(diào)Foxp3而上調(diào)LAG-3表達(dá)，提示地塞米松可能會(huì)調(diào)節(jié)抑制性免疫細(xì)胞的平衡。結(jié)果分析表明：地塞米松處理后Treg顯著降低，Tr1細(xì)胞上調(diào)，且Tr1/Treg細(xì)胞比率顯著上調(diào)?？赡苁堑厝姿啥唐谔幚泶龠M(jìn)或起始效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞分化為以Ⅰ型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞為主的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，從而發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)控作用。糖皮質(zhì)激素治療后的反應(yīng)性質(zhì)依賴于刺激的持續(xù)時(shí)間和免疫系統(tǒng)的生理狀態(tài)。糖皮質(zhì)激素在病理狀態(tài)下起抗炎分子的作用以控制病程；相反，在生理狀態(tài)下，糖皮質(zhì)激素可能發(fā)揮了促炎作用[25]。這些結(jié)果提示，糖皮質(zhì)激素可能主要誘導(dǎo)Ⅰ型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。本研究由于是體外研究探討糖皮質(zhì)激素對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量的影響，具有一定的研究局限性。下一步有必要進(jìn)一步探討地塞米松對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖與凋亡及功能的影響，并結(jié)合不同免疫性疾病對(duì)激素治療前后調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化與功能的研究。

地塞米松對(duì)免疫系統(tǒng)的作用是多效性的，且與治療時(shí)間和劑量相關(guān)。本研究探討了地塞米松對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Treg和Tr1的頻率及Tr1/Treg平衡的影響。本研究提示在臨床進(jìn)行激素治療過程中，需明確不同疾病在激素治療后調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的變化及對(duì)疾病進(jìn)展與預(yù)后的影響，以便更好地了解激素的臨床適應(yīng)癥。

參考文獻(xiàn)：

[1] Lim HY,Müller N,Herold MJ,etal.Glucocorticoids exert opposing effects on macrophage function dependent on their concentration[J].Immunology，2007，122(1):47-53.

[2] Suárez A,López P,Gómez J,Gutiérrez C.Enrichment of CD4+CD25high T cell population in patients with systemic lupus erythematosus treated with glucocorticoids[J].Ann Rheum Dis，2006，65(11):1512-1517.

[3] Zhao Y,Wang H,Gustafsson M,etal.Combined multivariate and pathway analyses show that allergen-induced gene expression changes in CD4+T cells are reversed by glucocorticoids[J].PLoS One，2012，7(6):e39016.

[4] Varga G,Ehrchen J,Brockhausen A,etal.Immune suppression via glucocorticoid-stimulated monocytes:a novel mechanism to cope with inflammation[J].J Immunol，2014,193(3):1090-1099.

[5] Sakaguchi S，Sakaguchi N，Asano M,etal.Pillars article:immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25).Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases[J].J Immunol，1995，155:1151-1164.

[6] Fontenot JD,Gavin MA,Rudensky AY,etal.Pillars article:Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+regulatory T cells[J].Nat Immunol，2003,4:330-336.

[7] Togashi Y，Nishikawa H.Regulatory T cells:molecular and cellular basis for immunoregulation[J].Curr Top Microbiol Immunol，2017，410:3-27.

[8] 孫偉紅,魏曉芳,趙 鵬,等.胃癌患者DC-CIK治療前后外周血Treg細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子的變化[J].中國(guó)腫瘤生物治療雜志,2015,22(01):79-83.

Sun WH,Wei XF,Zhao P,etal.Changes in Treg cells and their cytokine production in the peripheral blood of gastric cancer patients following immunotherapy with DC-CIK cells[J].Chin J Cancer Biother，2015，22(01):79-83.

[9] Wu K,Bi Y,Sun K,Wang C.IL-10-producing type 1 regulatory T cells and allergy[J].Cell Mol Immunol，2007，4(4):269-275.

[10] Akdis M,Verhagen J,Taylor A,etal.Immune responses in healthy and allergic individuals are characterized by a fine balance between allergen-specific T regulatory 1 and T helper 2 cells[J].J Exp Med，2004，199(11):1567-1575.

[11] Gagliani N,Jofra T,Stabilini A,etal.Antigen-specific dependence of Tr1-cell therapy in preclinical models of islet transplant[J].Diabetes，2010，59(2):433-439.

[12] Foussat A,Cottrez F,Brun V,etal.A comparative study between T regulatory type 1 and CD4+CD25+T cells in the control of inflammation[J].J Immunol，2003，171(10):5018-5026.

[13] Martinez-Forero I,Garcia-Munoz R,Martinez-Pasamar S,etal.IL-10 suppressor activity and ex vivo Tr1 cell function are impaired in multiple sclerosis[J].Eur J Immunol，2008，38(2):576-586.

[14] Liu G,Luan J,Li Q.CD4(+)Foxp3(-)IL-10(+) Tr1 Cells Promote Relapse of Diffuse Large B Cell Lymphoma by Enhancing the Survival of Malignant B Cells and Suppressing Antitumor T Cell Immunity[J].DNA Cell Biol，2016,35(12):845-852.

[15] Ouaguia L,Morales O,Mrizak D,etal.Overexpression of regulatory t cells type 1 (Tr1) specific markers in a patient with HCV-induced hepatocellular carcinoma[J].SRN Hepatol，2013，2013:928485.

[16] Chen X,Oppenheim JJ,Winkler-Pickett RT,etal.Glucocorticoid amplifies IL-2-dependent expansion of functional FoxP3(+)CD4(+)CD25(+) T regulatory cells in vivo and enhances their capacity to suppress EAE[J].Eur J Immunol，2006,36(8):2139-2149.

[17] Braitch M,Harikrishnan S,Robins RA,etal.Glucocorticoids increase CD4CD25 cell percentage and Foxp3 expression in patients with multiple sclerosis[J].Acta Neurol Scand，2009,119(4):239-245.

[18] Wang W,Jiang T,Zhu Z,etal.Dexamethasone suppresses allergic rhinitis and amplifies CD4(+) Foxp3(+) regulatory T cells in vitro[J].Int Forum Allergy Rhinol，2015,5(10):900-906.

[19] 陳 艷,黃連芳,劉衍志,等.不同劑量地塞米松對(duì)大鼠松質(zhì)骨代謝的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2012,28(9):1311-1314.

Chen Y,Huang LF,Liu YZH,etal.Effects of different doses of dexamethasone on metabolism of cancellos bone in rats[J].Chin Pharmacol Bulletin，2012，28(9):1311-1314.

[20] Pandolfi J,Baz P,Fernández P,etal.Regulatory and effector T-cells are differentially modulated by dexamethasone[J].Clin Immunol，2013,149(3):400-410.

[21] Prado C,Gómez J,López P,etal.Dexamethasone upregulates FOXP3 expression without increasing regulatory activity[J].Immunobiology，2011,216(3):386-392.

[22] Kakal JA,Ghazawi FM,Faller EM,etal.Transcriptional regulation of the IL-7Rα gene by dexamethasone and IL-7 in primary human CD8 T cells[J].Immunogenetics，2017,69(1):13-27.

[23] Lee HC,Shibata H,Ogawa S,etal.Transcriptional regulation of the mouse IL-7 receptor alpha promoter by glucocorticoid receptor[J].J Immunol，2005,174(12):7800-7806.

[24] Franchimont D,Galon J,Vacchio MS,etal.Positive effects of glucocorticoids on T cell function by up-regulation of IL-7 receptor alpha[J].J Immunol，2002,168(5):2212-2218.

[25] Cruz-Topete D,Cidlowski JA.One hormone,two actions:anti-and pro-inflammatory effects of glucocorticoids[J].Neuroimmuno-modulation，2015,22(1-2):20-32.