不同藤梨根樣品中多糖含量的比較研究及應(yīng)用

徐浩 樓招歡 申力 于曉露 張光霽★

藤梨根又名楊桃根，是獼猴桃科植物獼猴桃 A.chinensis Planch和軟獼猴桃 Actinidia arguta Planch的干燥根［1］。主要分布在浙江、江西、湖南、河南、福建、安徽等地［2］。藤梨根具有許多的藥理活性，其中抗腫瘤活性較為顯著，被廣泛應(yīng)用于一些癌癥例如肺癌、大腸癌、食管癌、胃癌、結(jié)腸癌等的治療。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)藤梨根具有抗氧化能力以及免疫活性［3］。多糖為藤梨根的化學(xué)成分之一，Alexmandra M. Deters等［4］在藤梨根中提取分離出葡甘露聚糖。不同產(chǎn)地、不同采收期藥材中多糖含量存在差異，而生長年限的不同也可能引起多糖含量的不同。多糖具有許多的生理活性，如抗細(xì)菌感染的能力［5］、抗肝癌［6］等，發(fā)展的潛力較大。本實(shí)驗(yàn)通過研究不同產(chǎn)地、不同采收期、不同年限的藤梨根以藤梨根不同部位的多糖含量來進(jìn)行分析比較，確定含量較多的藤梨根。

1 材料與方法

1.1 儀器 TC-15恒溫電熱套（海寧市華星儀器廠），501恒溫水油浴鍋（杭州惠創(chuàng)儀器設(shè)備有限公司），電子稱（11009123S），分析天平（AG135），電子天平（奧豪 CP114），微型電子計(jì)算機(jī)（0600914S），紫外分光光度計(jì)（浙江中醫(yī)藥大學(xué) 1000337S），KQ-500DE型數(shù)據(jù)超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司0500788S），離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申順生物科技有限公司 20012788），DLSB-5/10℃ 低溫冷卻循環(huán)泵，SHB-III 循環(huán)水式真空泵。

1.2 試劑 濃硫酸（衢州巨化試劑有限公司），D-無水葡萄糖（中國藥品生物制品檢定所110833），95%乙醇（安徽安特食品股份有限公司 1505093601），苯酚（鄭州恒祥化工原料有限公司 060311）。

1.3 藥材 2014年7月收集浦江2年、浦江3年、浦江4年、磐安2009、磐安2010、磐安2011、諸暨1年、諸暨2年的藤梨根（TLG）藥材，除去雜質(zhì)，清水洗凈，切片后烘箱烘干備用；2014年10月收集浦江4年秋、磐安2009年秋、諸暨2012年秋的藥材，按以上處理后備用；2015年4月收集磐安、浦江的藥材，按以上處理后備用。

1.4 TLG多糖的提取 稱取100g TLG干品于2000 ml圓底燒瓶中，加10倍體積的水，100℃回流1h，藥液過濾后備用。取藥渣，加10倍體積的水，100℃回流1h，棄藥渣，藥液過濾，合并兩次藥液，減壓回收并適當(dāng)濃縮藥液至500 ml。取藥液，邊攪拌邊加95%乙醇，使溶液含醇量達(dá)80%。靜置12h后3500 r/min，離心3 min，棄上清液，沉淀物冷凍干燥，得TLG多糖。

1.5 溶液的制備 （1）對(duì)照品溶液的配制：精密稱取D-無水葡萄糖對(duì)照品10.0 mg，置于100 ml容量瓶中，加蒸餾水適量，超聲使之溶解，加適量蒸餾水至刻度線，搖勻，配制成0.1 mg/ml的溶液。（2）供試品溶液的配制：精密稱取各樣品多糖10.0mg，分別置于100ml容量瓶中，加適量蒸餾水至刻度線，搖勻，配制成0.1mg/ml的溶液。（3）苯酚溶液的配制：稱取苯酚5g置于100 ml容量瓶中，加適量蒸餾水至刻度，搖勻備用。

1.6 最大吸收波長的選擇 移取2.0 ml對(duì)照品溶液于試管中，加入5%苯酚溶液1.0ml后迅速加入濃硫酸5.0 ml，渦旋后室溫靜置10min，沸水浴15 min后隨即進(jìn)行冰水浴15min，以蒸餾水2ml按上述條件處理的溶液作為空白，在400～600nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定最大吸收波長為490nm。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別吸取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 ml的對(duì)照品溶液于10 ml的容量瓶中，加入適量蒸餾水定容，在最大吸收波長490 nm處進(jìn)行吸光度的測定。以吸光度A為橫坐標(biāo)，濃度C（mg/ml）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y=0.01972X-0.00145，R2=0.99907，結(jié)果顯示葡萄糖在2.5～20μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，結(jié)果見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2 結(jié)果

2.1 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液2.0ml于試管中，進(jìn)行吸光度的測定，平行測定7次，計(jì)算得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）為0.19%，表明儀器精密度良好。見表1。

表1 精密度試驗(yàn)

2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液2.0 ml于試管中，進(jìn)行吸光度的測定，連續(xù)測定1h，計(jì)算得RSD為0.91%，表明供試品溶液在1h內(nèi)較為穩(wěn)定。見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品多糖5份，每份10 mg，按供試品溶液的配制進(jìn)行配液，根據(jù)2.3中的方法進(jìn)行操作，測定吸光度，計(jì)算得RSD為3.54 %，表明本法重現(xiàn)性良好。見表3。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)

2.4 加樣回收率試驗(yàn) 稱取2.5mg的供試品多糖，用適量的蒸餾水溶解于50ml的容量瓶中，加入適量一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行超聲，加蒸餾水至刻度線，配制成0.1mg/ml的待測液，進(jìn)行吸光度的測定，計(jì)算得平均回收率為102.2 %，RSD為2.21%，結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率試驗(yàn)

2.5 不同樣品多糖的含量測定 分別移取各供試品溶液2.0ml，在490 nm處進(jìn)行吸光度的測定，并通過回歸方程計(jì)算得到各樣品多糖含量，計(jì)算公式如下：，其中y為葡萄糖濃度（mg/ml），m為多糖樣品稱取量（mg）。結(jié)果見表 5～8。

表5 不同產(chǎn)地藤梨根樣品多糖的含量（%）

表6 不同采收期藤梨根樣品中的多糖含量（%）

表7 不同年限藤梨根樣品中的多糖含量（%）

表8 不同部位藤梨根樣品中的多糖含量（%）

3 討論

藤梨根是臨床常用于治療消化系統(tǒng)腫瘤的中草藥之一，浙江地區(qū)亦有用藤梨根治療胃癌、食管癌的報(bào)道［7-8］。藤梨根多糖是從藤梨中提取的一類植物多糖，由醛糖或酮糖通過苷鍵連接在一起，具有多效應(yīng)和多靶點(diǎn)的藥理學(xué)活性，已經(jīng)受到越來越多的關(guān)注。

多糖一般可激活免疫反應(yīng)達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖，且對(duì)正常細(xì)胞毒性較低。藤梨根多糖的含量常決定藤梨根中藥材的藥效。植物藥材中多糖類物質(zhì)的積累與產(chǎn)地的關(guān)系密切，不同產(chǎn)地的同一種藥材，其中的多糖含量也具有較大的差異［9］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，諸暨產(chǎn)藤梨根的多糖含量顯著高于磐安和浦江，而浦江與磐安的多糖含量相差不大，可能與當(dāng)?shù)氐臍夂驐l件與土壤環(huán)境有關(guān)。

采收期的不同同樣影響了多糖含量［10］，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，秋季采收的多糖含量顯著高于其他季節(jié)采收的。年限不同，多糖的含量也不相同。浦江的樣品中，2年生的藤梨根多糖含量最高，而4年生的則是最少，相對(duì)于諸暨，諸暨1年生的樣品含量高于2年生的，可初步斷定多糖含量與年限有關(guān)，具體的相關(guān)性有待進(jìn)一步的研究。藤梨根的木質(zhì)部較大，約占根半徑的二分之一［19］，而韌皮部較狹窄，樣品中韌皮部的多糖含量低于木質(zhì)部的含量可能與之相關(guān)。

由此可見，產(chǎn)地、年限、采收期對(duì)藤梨根中多糖的含量有影響，且其不同部位的多糖含量也不相同。對(duì)大多數(shù)中藥材而言，不同年限、不同產(chǎn)地主要活性成分的含量都存在差異，比如黃芪、貝母、地珠子、太子參等藥材均存在這種現(xiàn)象。

藤梨根具有清熱解毒的功效，可以有效改善患者胃中灼熱、口干、嘈雜等癥狀，近年來在臨床上應(yīng)用十分廣泛。藤梨根治療胃癌，與北沙參、麥冬、天冬、石斛、玉竹等滋陰藥配合使用，可以達(dá)到良好的滋養(yǎng)胃陰、清除胃熱的效果。如果胃的熱象明顯，可配合使用生石膏、知母、蘆根、天花粉、淡竹葉、白花蛇舌草等加強(qiáng)清熱的力量。如果患者夜里出汗顯著，可加用煅牡蠣、浮小麥、糯稻根等；如果患者口干、大便干的癥狀十分明顯，可加用玄參、生地、麥冬等；心煩失眠的患者，可加用酸棗仁、柏子仁、夜交藤等。有些患者還會(huì)出現(xiàn)疲勞等氣虛證的表現(xiàn)，可加入太子參、麥冬、五味子益氣養(yǎng)陰。

本研究表明，藤梨根的質(zhì)量和療效也會(huì)受到產(chǎn)地和采集的影響，與此類研究的結(jié)果類似。因此，在藤梨根生產(chǎn)的過程中應(yīng)該重視產(chǎn)地、采收時(shí)間等因素的影響，以提高有效成分的含量，提升臨床療效。

綜上所述，諸暨產(chǎn)的藤梨根中，多糖含量較其他地區(qū)高，且在秋天采收為宜，而不同產(chǎn)區(qū)的藤梨根在藥效上是否存在差異，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)觀察。

［1］ 中國科學(xué)院西北植物研究所編著． 秦嶺植物志． 北京: 科學(xué)出版社, 1983: 292-294．

［2］ 陳曉曉, 楊尚君, 白少巖． 中華獼猴桃根化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展． 齊魯藥事, 2009, 28(11): 677-679．

［3］ Lin Zhang, WuXia Zhang, Qingjie Wang． Purification, antioxidant and immunological activities of polysaccharides from Actinidia Chinensis roots． International Journal of biological Macromolecules,2015, 72: 975-983．

［4］ Alexmandra M． Deters, Klaus R． Schroder, Andreas Hensel． Kiwi Fruit ( Actinidia chinensis L． ) polysaccharides exert stimulating Effects on Cell Proliferation via Enhanced Growth Factor Receptors, Energy Production, and collagen synthesis of human Keratinocytes, fibroblasts, and skin equivalents． Journal of cellular physiology, 2005, 202: 717-722．

［5］ 閻家麒, 王九一, 趙敏, 等． 中華獼猴桃多糖的提取及其對(duì)自由基的消除作用． 中國生化藥物雜志, 1995, 16(1): 12-14．

［6］ 張光霽, 韓江余． 獼猴桃根多糖抗腫瘤注射劑小鼠體內(nèi)抑瘤機(jī)制． 中華中醫(yī)藥雜志, 2012, 27(8): 2177-2179．

［7］ 樓麗君, 呂定量, 胡增仁, 等． 獼猴桃根抗肝癌的實(shí)驗(yàn)研究． 中華中醫(yī)藥學(xué)刊, 2009, 27(7): 1509-1511．

［8］ 朱秀山, 許繼平． 壁虎藤梨根治療胃癌臨床及實(shí)驗(yàn)研究． 中國民間療法, 1999, 7(3): 43-44．

［9］ 許苗苗, 劉銀環(huán), 楊新杰, 等． 不同產(chǎn)地珠子參中多糖的含量． 現(xiàn)代中醫(yī)藥, 2014, 34(5): 73-75．

［10］ 曾麗娜, 袁玉虹, 黃淑燕, 等． 不同采收時(shí)間、不同入藥部位太子參有效藥用成分含量的比較． 福建林業(yè), 2014, 2: 25-26．