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    PKC抑制劑對甲醛誘導(dǎo)的內(nèi)臟炎性痛大鼠脊髓ERK1/2磷酸化的影響*

    2018-04-19 19:41:28張家君張燦文牛敬忠胡冬梅楊明峰張顏波
    中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志 2018年4期
    關(guān)鍵詞:內(nèi)臟甲醛磷酸化

    張家君 岳 偉 張燦文 牛敬忠 胡冬梅 袁 慧 楊明峰 張顏波△

    (泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院1超聲科;2消化科;3神經(jīng)內(nèi)科,泰安271000)

    炎癥腸道疾病和癌癥相關(guān)性內(nèi)臟痛是臨床上常見的內(nèi)臟痛,內(nèi)臟炎癥痛機(jī)制和治療是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)、難點(diǎn)。內(nèi)臟痛發(fā)病機(jī)制尚不明確,其研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于軀體痛,嚴(yán)重影響了內(nèi)臟痛病人的治療與預(yù)后。眾多信號分子、受體在內(nèi)臟痛覺特別是痛覺敏感化形成和維持中起重要作用,是目前研究的主要方向[1~5]。我們既往的研究發(fā)現(xiàn),大鼠脊髓內(nèi)PKC及其PKCγ、PKCε亞型參與甲醛內(nèi)臟炎癥痛發(fā)生、發(fā)展過程;Galan等和Sakurai等研究發(fā)現(xiàn),脊髓和脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)ERK參與內(nèi)臟炎癥痛痛覺敏感化的維持PKC、ERK1/2已經(jīng)作為內(nèi)臟炎癥痛新型藥物治療靶點(diǎn)[6~8]。ERK1/2是否作為PKC的下游信號通路在內(nèi)臟炎癥痛發(fā)病機(jī)制中起重要作用,對內(nèi)臟炎癥痛靶向治療具有重要意義。所以本實(shí)驗(yàn)利用甲醛直腸黏膜下注射內(nèi)臟炎癥痛大鼠模型[6,9~11],通過蛛網(wǎng)膜下腔注射給予PKC抑制劑H-7,觀察H-7對內(nèi)臟炎癥痛大鼠脊髓ERK1/2磷酸化水平的影響,探討PKC- ERK1/2信號通路在內(nèi)臟炎癥痛發(fā)病機(jī)制中的作用。

    方 法

    1.試劑與材料

    H-7(Sigma公司,美國),甲醛、戊巴比妥鈉(北京西中化工廠),PE-10管(ID:0.28 mm; OD:0.61 mm,Becton Dickinson公司,美國),有機(jī)玻璃行為學(xué)觀察箱(首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物研究室制),大鼠手持直腸窺器(專利號:CN200820173538.2),兔ERK 1/2一抗、兔p-ERK 1/2一抗、actin一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體(美國Santa Cruz公司,美國),ECL反應(yīng)底物(Bio-Rad公司,美國),BCA蛋白分析試劑盒(PIERCE公司,美國),Gel Doc凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司,美國)。

    2.實(shí)驗(yàn)動物及分組

    選用清潔級雄性SD大鼠(重200~250 g,山東省中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,實(shí)驗(yàn)動物許可證號:SCXK(魯)2005-0015),實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為5組:正常對照組(N組);甲醛(formalin, F)直腸致炎組(F組);甲醛直腸致炎和脊髓蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)插管(intrathecal, IT)組(IT組);甲醛直腸致炎、脊髓蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)插管并注射生理鹽水組(NaCl組);甲醛直腸致炎、脊髓蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)插管并注射H-7組( H-7組);每組大鼠24只,共120只。

    3.脊髓蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)插管及給藥

    根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)室既往成熟方法[6,9~11],用PE-10管插入大鼠脊髓蛛網(wǎng)膜下腔,插入長度7.5 cm,外端留有4.5 cm左右。本實(shí)驗(yàn)中NaCl和H-7組,分別在甲醛直腸致炎前30 min經(jīng)PE-10插管注射20 μl 0.9% NaCl、20 μl H-7 溶液(含 5 μg H-7),然后注入10 μl 0.9% NaCl沖洗插管,保證注射藥品全部進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔。

    4.內(nèi)臟炎癥痛模型復(fù)制

    根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)室既往成熟方法[6,9~11],大鼠乙醚持續(xù)麻醉,經(jīng)肛門插入自制的直腸窺器(專利號:CN200820173538.2),距肛門約35 mm處,用針長8 cm的1 ml注射器于直腸黏膜下注射100 μl 5%的甲醛。

    5.內(nèi)臟痛行為學(xué)觀察

    甲醛致痛后,大鼠共有4種疼痛行為:①舔腹(L);②伸腰(B);③側(cè)扭(C);④全身收縮(W)。疼痛評分公式計算:S = 1L + 2B + 3C + 4W。L,B,C和W代表在一段時間內(nèi)相應(yīng)行為的次數(shù)。4組大鼠,每組8只,每15 min進(jìn)行一次疼痛計分,連續(xù)記錄大鼠的行為120 min[6,9~11]。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的大鼠在120 min觀察后進(jìn)行ERK1/2磷酸化水平檢測。

    6. ERK1/2磷酸化水平檢測

    在甲醛造模后30 min、60 min和120 min取出L6-S1節(jié)段脊髓,根據(jù)我們既往的方法進(jìn)行ERK1/2磷酸化檢測[9]。磷酸化ERK1/2 的蛋白檢測后,同一張NC膜,再與總ERK1/2抗體進(jìn)行第二次Western blot 雜交反應(yīng),獲得ERK1/2總蛋白印跡結(jié)果。Gel Doc凝膠成像分析系統(tǒng)同時進(jìn)行actin水平檢測,ERK1/2相對磷酸化水平以p-ERK1/2與ERK1/2的比值表示。

    7.統(tǒng)計學(xué)方法

    結(jié) 果

    1. PKC抑制劑H-7減輕內(nèi)臟炎癥痛疼痛反應(yīng)

    4個實(shí)驗(yàn)組大鼠在注射甲醛后30 min均達(dá)到疼痛評分的最大值,從注射甲醛后45 min至120 min內(nèi),疼痛評分逐漸降低。前60 min內(nèi)行為表現(xiàn)主要以W、C、B反應(yīng)為主;而在后60 min內(nèi)主要以L反應(yīng)為主。F、IT、NaCl組和H-7組大鼠在注射甲醛后30 min均達(dá)到疼痛評分的最大值,從注射甲醛后45 min至120 min內(nèi),疼痛評分逐漸降低,120 min時疼痛評分正常。H-7組在前90 min內(nèi)疼痛分?jǐn)?shù)顯著低于 F組 (P< 0.05或P< 0.01),F(xiàn)分別與IT、NaCl組相比未見顯著性差異(P> 0.05,見表1)。

    2.內(nèi)臟炎癥痛大鼠脊髓ERK1/2磷酸化水平增加

    與N組相比,F(xiàn)組甲醛直腸黏膜注射后脊髓ERK1/2磷酸化水平增加,30 min時達(dá)最高水平,60 min時仍高于對照組,有顯著性差異(P< 0.05或P< 0.01);60 min后磷酸化水平逐漸下降,120 min時磷酸化水平與N組相比,無顯著性差異(P> 0.05)。IT組、NaCl組與F組相比,無顯著性差異(P> 0.05,見圖1~4)。

    3. PKC抑制劑H-7降低內(nèi)臟炎癥痛大鼠脊髓ERK1/2磷酸化水平

    與N相比,H-7組甲醛直腸黏膜注射后脊髓ERK1/2磷酸化水平也增加,30 min時達(dá)最高水平,60 min時仍高于對照組,有顯著性差異(P< 0.05或P< 0.01);60 min后逐漸下降,120 min時下降至正常水平(P> 0.05)。在甲醛注射后60 min內(nèi),H-7組與F組相比,ERK1/2磷酸化水平明顯下降,有顯著性差異 (P< 0.05或P< 0.01),120 min時無顯著性差異(P> 0.05,見圖1~4)。

    討 論

    在臨床中由炎癥而導(dǎo)致的內(nèi)臟炎癥痛非常常見,而且炎癥也是導(dǎo)致內(nèi)臟器官痛敏的最常見原因,常伴隨一系列的征候群,如腸易激綜合癥(irritable bowel syndrome, IBS)等。內(nèi)臟痛與軀體痛發(fā)病機(jī)制不同,所以內(nèi)臟痛與軀體痛對鎮(zhèn)痛藥物的療效也不相同。與軀體痛相比,在炎性腸道疾病疼痛的治療中,應(yīng)用阿片類藥物會導(dǎo)致較高的副作用和死亡率;同樣應(yīng)用非甾體抗炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)鎮(zhèn)痛效果也不理想[4]。所以研發(fā)新型、有效的內(nèi)臟炎癥痛鎮(zhèn)痛藥物迫在眉睫。信號通路將是內(nèi)臟炎癥痛新型鎮(zhèn)痛藥物的研發(fā)方向,針對多個信號通路聯(lián)合藥物鎮(zhèn)痛治療優(yōu)于單一藥物,聯(lián)合治療是內(nèi)臟痛治療原則[4,12]。根據(jù)既往我們研究基礎(chǔ)和目前國內(nèi)外進(jìn)展,所以本研究選擇PKC、ERK1/2兩條信號通路進(jìn)行研究,并且將PKC、ERK1/2作為一條上下游信號通路進(jìn)行研究,是本研究的一個創(chuàng)新點(diǎn)。

    表1 注射甲醛后各組不同時間段的疼痛分?jǐn)?shù)(min,±SD)Table 1 Pain scores of different time periods after formalin injection (min,±SD)

    表1 注射甲醛后各組不同時間段的疼痛分?jǐn)?shù)(min,±SD)Table 1 Pain scores of different time periods after formalin injection (min,±SD)

    F: formalin group; IT: intrathecal group; NaCl: NaCl group; H-7: H-7 group. *P < 0.05, **P < 0.01, compared with F group.

    Group Pain Score 15 30 45 60 75 90 105 120 F 60.32±6.47 88.47±7.89 47.56±4.56 25.98±3.04 14.78±2.32 10.35±1.79 3.41±1.65 3.22±0.97 IT 64.78±7.06 89.45±7.65 48.78±5.01 22.47±3.65 13.41±2.74 11.01±2.01 3.73±1.78 3.34±0.87 NaCl 62.62±6.14 86.25±8.03 49.45±4.54 24.45±3.17 14.14±2.98 9.88±2.74 4.87±1.58 3.25±0.96 H-7 44.52±5.18** 65.78±6.65** 35.74±4.65** 16.42±3.89* 8.57±2.69* 5.36±1.87* 3.58±1.54 3.52±1.12

    圖1 注射甲醛后30 min ERK1/2磷酸化水平Fig.1 Phosphorylation of ERK1/2 at 30 minutes after formalin injection

    圖2 注射甲醛后60 min ERK1/2磷酸化水平Fig.2 Phosphorylation of ERK1/2 at 60 minutes after formalin injection

    圖3 ERK1磷酸化水平變化Fig.3 Changes of phosphorylation level of ERK1 N: Normal control group; F: Formalin group; IT:Intrathecal group; NaCl: NaCl group; H-7: H-7 group.

    圖4 ERK2磷酸化水平變化Fig.4 Changes of phosphorylation level of ERK2 N: Normal control group; F: Formalin group; IT:Intrathecal group; NaCl: NaCl group; H-7: H-7 group.

    在本實(shí)驗(yàn)中,甲醛注射后30 min達(dá)到疼痛的高峰,注射90 min后,甲醛組和對照組相比,沒有明顯差異,我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和Miampamba等人的結(jié)果一致[13],說明甲醛直腸黏膜下注射誘導(dǎo)內(nèi)臟炎癥痛模型,是國際上公認(rèn)的、可靠的內(nèi)臟痛模型,是內(nèi)臟炎癥痛的研究手段。PKC抑制劑H-7在甲醛注射后90 min內(nèi),能明顯抑制內(nèi)臟炎癥痛行為反應(yīng),說明PKC抑制劑可作為內(nèi)臟炎癥痛的治療藥物。在甲醛注射30 min時ERK1/2磷酸化水平達(dá)最高水平,60 min仍高于對照組,說明ERK1/2參與內(nèi)臟炎癥痛的形成和維持過程;PKC抑制劑H-7在甲醛注射后60 min內(nèi)能明顯抑制ERK1/2磷酸化水平,說明ERK1/2可能作為PKC的下游信號通路參與了內(nèi)臟炎癥痛的發(fā)病機(jī)制。PKC-ERK1/2作為一條信號通路參與信號傳導(dǎo),這與目前國際上應(yīng)用不同實(shí)驗(yàn)?zāi)P偷贸龅慕Y(jié)果一致[14~18]。El-Zein等研究發(fā)現(xiàn),瘦素通過PKC/ERK信號通路抑制腸道葡萄糖的吸收[17];Sun[16]等也研究證實(shí),Egr-1通過PKC/ERK信號通路介導(dǎo)慢性缺氧引起的腎間質(zhì)纖維變性。

    綜上所述,PKC抑制劑H-7能降低內(nèi)臟炎癥痛疼痛評分和抑制脊髓ERK1/2磷酸化水平,ERK1/2是PKC的下游信號通路在內(nèi)臟炎癥痛發(fā)病機(jī)制中起重要作用,對內(nèi)臟炎癥痛靶向治療具有重要意義。

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