泌尿系草酸鈣結(jié)石蛋白分析＊

葉韜 ，王義兵 ，劉偉 ，羅曉明 ，王共先 ，黃學(xué)明 ，劉偉鵬 ，習(xí)海波 ，余月 ，傅斌 ，

(1、江西省九江市第一人民醫(yī)院泌尿外科，九江 332000；2、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院急診科，南昌 330006；3、江西省婦幼保健院藥劑科，南昌 330006；4、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，南昌 330006；5、江西省泌尿外科研究所，南昌 330006)

我國(guó)是泌尿系結(jié)石高發(fā)區(qū)之一，人群發(fā)病率高達(dá)1%-10%，其中25%患者需住院手術(shù)治療[1]。泌尿系結(jié)石復(fù)發(fā)率非常高，10年復(fù)發(fā)率為50%，15年復(fù)發(fā)率更是高達(dá)75%[2]。因此探討泌尿系結(jié)石的發(fā)病機(jī)制與防治方法具有重要意義。草酸鈣結(jié)石在尿石病患者中最為常見，其形成機(jī)制尚不明確。結(jié)石內(nèi)蛋白成分在結(jié)石形成過程中可能有重要作用，而且與泌尿系感染密切相關(guān)。本項(xiàng)目通過研究草酸鈣結(jié)石蛋白成分特點(diǎn)，分析其與尿路感染最為常見的大腸桿菌的關(guān)系，旨在探索結(jié)石蛋白成分在結(jié)石形成中的作用與機(jī)制，進(jìn)而為臨床防治提供依據(jù)。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料隨機(jī)收集20例患者的尿路結(jié)石標(biāo)本。同時(shí)收集相應(yīng)患者的尿液標(biāo)本。大腸桿菌通過參考大腸桿菌培養(yǎng)操作手冊(cè)進(jìn)行培養(yǎng)獲得。

1.2實(shí)驗(yàn)方法將收集到的結(jié)石樣本，經(jīng)過清洗、晾干、充分碾磨。全部患者的尿液標(biāo)本行尿常規(guī)分析及中段尿細(xì)菌培養(yǎng)。采用LIIR-20型號(hào)的結(jié)石紅外光譜分析系統(tǒng)分析結(jié)石的無機(jī)組成成分。利用本團(tuán)隊(duì)的專利方法（專利號(hào)為ZL201510017515.7）提取結(jié)石內(nèi)蛋白質(zhì)。采用細(xì)菌蛋白質(zhì)提取試劑盒提取大腸桿菌蛋白。采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。采用SDS-SPAGE電泳純化蛋白，銀染染色和考馬斯亮藍(lán)染色分別鑒定結(jié)石和大腸桿菌內(nèi)蛋白分子量大小。經(jīng)液相色譜儀和質(zhì)譜儀鑒定蛋白質(zhì)成份，對(duì)質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行Gene Ontology等生物功能信息分析。

2　結(jié)果

2.1結(jié)石無機(jī)成分20例結(jié)石樣本中有18例（90%）為草酸鈣結(jié)石，其中含一水草酸鈣成分的結(jié)石有17例；非草酸鈣結(jié)石2例，分別為二水磷酸氫鈣、碳酸磷灰石合并六水磷酸銨鎂。

2.2尿常規(guī)及中段尿培養(yǎng)6例患者尿常規(guī)結(jié)果正常。14例（70%）患者尿白細(xì)胞增多，提示有泌尿道感染可能。草酸鈣結(jié)石患者尿常規(guī)異常者13例（72%）。草酸鈣結(jié)石患者尿培養(yǎng)結(jié)果陽性1例（5%），培養(yǎng)結(jié)果為大腸埃希氏菌。

2.3結(jié)石蛋白與大腸桿菌蛋白濃度測(cè)定所有結(jié)石樣本均含有不同濃度的蛋白成分，草酸鈣結(jié)石平均蛋白濃度為0.57μg/μL，其標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。合并感染的結(jié)石平均蛋白濃度為0.69μg/μL，非感染結(jié)石平均蛋白濃度為0.23μg/μL。采用t檢驗(yàn)計(jì)算p值為0.01751，提示感染性結(jié)石和非感染結(jié)石濃度有顯著性差異。大腸桿菌蛋白濃度為5.38μg/μL。

圖1　尿蛋白濃度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4SDS-PAGE電泳草酸鈣結(jié)石內(nèi)蛋白有3至4條蛋白帶，主要集中在25.0-35.0KDa和66.2-116.0KDa。相同成分結(jié)石條帶集中區(qū)域大致相同 （圖2）。大腸桿菌蛋白SDS-PAGE凝膠電泳顯示蛋白成分主要集中在35.0KDa-116.0KDa，與草酸鈣結(jié)石有部分重疊（圖3）。

圖2　草酸鈣結(jié)石SDS-PAGE膠分離后行銀染染色（M為蛋白marker)

圖3　大腸桿菌蛋白SDS-PAGE膠分離后考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果（M為蛋白marker)

2.5草酸鈣結(jié)石蛋白質(zhì)譜分析質(zhì)譜結(jié)果共鑒定到88個(gè)蛋白，204個(gè)肽段。蛋白分子功能分析結(jié)果顯示48.8%為結(jié)合功能蛋白，19.58%為催化活性蛋白，31.62%為其他各類蛋白。蛋白生物學(xué)過程分析結(jié)果顯示8.14%的蛋白參與代謝，8.09%參與生物調(diào)控，10.34%和7.12%的蛋白分別參與細(xì)胞過程和應(yīng)激。草酸鈣結(jié)石蛋白成分中多為結(jié)合功能蛋白，提示其在結(jié)石基質(zhì)形成過程中可能起主要作用。尿常規(guī)陽性的草酸鈣結(jié)石與尿常規(guī)陰性的結(jié)石在質(zhì)譜分析中結(jié)石蛋白成分無明顯差異。

3　討論

近年來，隨著經(jīng)濟(jì)、環(huán)境與飲食結(jié)構(gòu)等改變，我國(guó)泌尿系結(jié)石的發(fā)病率正逐年升高，尤其是南方地區(qū)更是嚴(yán)重，已嚴(yán)重影響了健康與社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展[3]。泌尿系結(jié)石主要包含草酸鈣結(jié)石、磷酸鹽結(jié)石、尿酸結(jié)石、胱氨酸結(jié)石等。其中以草酸鈣結(jié)石最為常見，約占80%以上[4]。本研究通過手術(shù)隨機(jī)收集的20例結(jié)石樣本中含草酸鈣成分的結(jié)石樣本有18例（90%），進(jìn)一步驗(yàn)證了草酸鈣結(jié)石的常見性。該類結(jié)石形成被認(rèn)為主要與患者草酸和鈣代謝異常相關(guān)[5，6]。

臨床上泌尿系結(jié)石和尿路感染常合并存在，兩者可能為互促因素[7]。國(guó)內(nèi)眾多研究發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性菌是泌尿系感染的主要致病菌，其中大腸埃希氏菌最為常見[8，9]。Kaneko等研究發(fā)現(xiàn)腎結(jié)石內(nèi)含抗菌肽、溶菌酶等蛋白質(zhì)[10]?？咕呐c溶菌酶是細(xì)菌感染灶周圍相關(guān)的炎癥細(xì)胞所分泌[11]。據(jù)此可推斷泌尿系結(jié)石的形成與泌尿系細(xì)菌入侵有關(guān)，且結(jié)石內(nèi)的蛋白質(zhì)成份之一可能含有細(xì)菌蛋白質(zhì)。本研究通過比對(duì)大腸埃希氏菌蛋白與草酸鈣結(jié)石蛋白條帶，發(fā)現(xiàn)兩者間存在重疊，草酸鈣結(jié)石的蛋白成分中可能含有大腸桿菌蛋白成分。

此外，本研究通過對(duì)草酸鈣結(jié)石進(jìn)行質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)草酸鈣腎結(jié)石內(nèi)以結(jié)合功蛋白為主，其中包括炎癥相關(guān)蛋白 （纖維連接蛋白、角蛋白、S100A8和S100A9等）。而纖維蛋白、炎癥蛋白在草酸鈣結(jié)石中存在，提示炎癥與結(jié)石發(fā)病有一定聯(lián)系。事實(shí)上，近些年來研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)石成分或細(xì)菌感染介導(dǎo)的炎癥-氧化應(yīng)激反應(yīng)會(huì)造成腎小管上皮細(xì)胞損傷，后者被認(rèn)為是泌尿系結(jié)石形成的重要機(jī)制。Saeed等研究發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)吞草酸鈣晶體可激活溶酶體釋放大量活性酶和氧自由基，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷[12]。另有研究發(fā)現(xiàn)一水草酸鈣晶體會(huì)明顯抑制體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞的增殖；而且上皮細(xì)胞的凋亡率也會(huì)隨著晶體濃度的升高而增加[13]。腎小管上皮細(xì)胞損傷后形成的細(xì)胞碎片可為結(jié)石形成時(shí)的成核過程提供核心；腎小管上皮細(xì)胞的損傷破壞了腎小管正常的重吸收和分泌功能，從而可能導(dǎo)致尿液中成石物質(zhì)的過飽和；當(dāng)上皮細(xì)胞存在損傷時(shí)，成石物質(zhì)在較低濃度時(shí)即可粘附形成結(jié)晶[14]。研究發(fā)現(xiàn)活性氧（ROS）及其產(chǎn)生的氧化應(yīng)激也參與了結(jié)石的形成[12，15]：結(jié)石晶體誘導(dǎo)上皮細(xì)胞產(chǎn)生 ROS，氧化應(yīng)激啟動(dòng)P38 MAPK/JNK等信號(hào)通路，激活形成大量轉(zhuǎn)錄與生長(zhǎng)因子，包括NFκB、TGFβ等，這些炎癥介質(zhì)會(huì)造成上皮細(xì)胞過氧化損傷與死亡。暴露的基底膜則有利于結(jié)晶的黏附與停留，進(jìn)而在集合管末端形成腎鈣斑 (Randall’splaques)；同時(shí)，ROS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致膠原蛋白沉積并形成纖維化。由此可見，炎癥反應(yīng)及其形成的諸多蛋白產(chǎn)物是結(jié)石形成的重要成因。

當(dāng)今主流觀點(diǎn)認(rèn)為泌尿系結(jié)石的形成是環(huán)境、飲食、代謝、遺傳與感染等共同作用的結(jié)果。除了前文述及的結(jié)石促成因素之外，在人體內(nèi)存在著較多的結(jié)石抑制物：大分子物質(zhì)（核糖核酸、黏液素、酸性黏多糖、腎鈣素、蛋白多糖、骨橋蛋白（OPN）、非集合TH蛋白、間-α-胰蛋白酶抑制物等）和小分子物質(zhì)（鎂、枸櫞酸鹽、α-亞麻酸、焦磷酸鹽等），均具有一定的抑制晶體形成的作用[16-18]。結(jié)石抑制物與結(jié)石促成物相互之間往往會(huì)由于機(jī)體功能異常而失衡，進(jìn)而誘發(fā)結(jié)石形成。

本研究存在的局限性是隨機(jī)獲得的結(jié)石樣本例數(shù)少，而且結(jié)石樣本在儲(chǔ)存、研磨及蛋白提取過程中受到環(huán)境的影響，這也可能造成有效蛋白成分的丟失，這也直接影響了蛋白電泳結(jié)果與質(zhì)譜分析結(jié)果。

總之，國(guó)內(nèi)外眾多研究業(yè)已證實(shí)結(jié)石基質(zhì)蛋白可通過多種機(jī)制參與泌尿系結(jié)石的形成。但是，不同結(jié)石成分的蛋白來源、是否有異同性、如何參與結(jié)石成核、生長(zhǎng)、又是如何參與抑制結(jié)石形成的機(jī)制尚未闡明。泌尿系結(jié)石的形成機(jī)制觀點(diǎn)眾多，但可以肯定的是目前尚無任何一種機(jī)制能夠完全解釋結(jié)石的形成。泌尿系感染在結(jié)石的形成過程中肯定扮演重要的角色，但其具體的機(jī)制仍需要我們進(jìn)一步研究及探討。

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