200例人乳頭瘤病毒基因分型檢測及感染情況分析

葉健翔，溫寶欣，何嘉穎

(廣東省肇慶市第二人民醫(yī)院，肇慶 526060)

人類乳頭瘤病毒（HPV）屬于乳多空病毒科的乳頭瘤空泡病毒A屬，確切來說，是一種球形DNA病毒，HPV可引起人體皮膚粘膜的鱗狀上皮增殖。感染HPV后可表現(xiàn)為尋常疣和生殖器疣等癥狀。研究指出，HPV可引起生殖道感染，從而誘發(fā)尖銳濕疣、宮頸病變、宮頸癌，因此，HPV檢測已經(jīng)成為宮頸癌篩查的主要方法[1，2]。宮頸癌屬婦科常見惡性腫瘤，且發(fā)病率有逐年增高趨勢，發(fā)病年齡越來越趨于年輕化，近年來，隨著宮頸細(xì)胞學(xué)篩查的應(yīng)用，宮頸癌的早期病變檢出率已經(jīng)越來越高。由于HPV的基因分型較多，且不同地區(qū)的感染率和基因分型均在明顯差異，通過分析當(dāng)?shù)貐^(qū)域女性HPV的感染和基因分型情況，對于當(dāng)?shù)睾Y查和防治宮頸癌具有重要指導(dǎo)意義[3-5]。本研究就本地區(qū)200例HPV感染情況和基因分型情況進(jìn)行研究分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下：

1　資料與方法

1.1臨床資料選取2017年1月-6月期間在廣東省肇慶市第二人民醫(yī)院接受HPV基因分型檢測的200例女性進(jìn)行觀察分析，年齡18-67歲，平均年齡（42.5±8.0）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：入選女性均有性生活史；搜集標(biāo)本前要求月經(jīng)過后，2d內(nèi)無性生活史，且白帶清潔度檢查正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)菌性、霉菌性、滴蟲性陰道炎。

1.2方法標(biāo)本采集：受檢者保持膀胱截石位，標(biāo)本采集人員使用擴(kuò)陰器顯露宮頸口，并用棉拭子將宮頸口的分泌物擦去，將宮頸刷置入宮頸口處，緊貼于宮頸口順時(shí)針轉(zhuǎn)動，轉(zhuǎn)動圈數(shù)為4-5圈，然后抽出宮頸刷，將刷子放入有細(xì)胞保存液的試管中，在管口處沿折痕將宮頸刷折斷，將刷頭保留在試管中，做好標(biāo)識，將標(biāo)本保存于-20℃的冰箱中，1周內(nèi)完成檢測。

檢測儀器和試劑：使用上海宏石SLAN-96P型基因擴(kuò)增儀。所用試劑由碩世生物技術(shù)有限公司提供，所檢的HPV病毒亞型共有21型，其中包括18中高危亞型和3種低危亞型，高危亞型包括16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82，低危亞型包括 6、11、81 亞型。

檢測方法：⑴HPV DNA的提?。孩偃〕鰳?biāo)本，振蕩混勻，吸取500μl樣本于帶螺口的離心管中，12000rpm離心1min，小心吸取上清，保留沉淀物。②加入400μl溶液A，振蕩混勻，100℃水浴或干浴煮10min。③加入400ul溶液B，振蕩混勻，室溫放置2min，12000rpm離心5min，棄上清液，室溫放置2min。④加入60μl溶液C，充分溶解，室溫靜置5min，12000rpm離心1min，上清液即為核酸溶液。⑵PCR擴(kuò)增：小心打開PCR八聯(lián)管蓋，每份待測樣本核酸溶液、空白對照、陽性對照按照2μl/管依次加入對應(yīng)編號含有A-H反應(yīng)體系的PCR八聯(lián)管中，1排PCR八聯(lián)管為1人份。將加好樣的八聯(lián)管放上實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上時(shí)行擴(kuò)增。

1.3判定標(biāo)準(zhǔn)在儀器正常，空白對照、陽性對照、H組的FAM通道均正常的情況下，根據(jù)HPV亞型探針熒光標(biāo)識表進(jìn)行分析。根據(jù)參考值，在A-H組中的HPV亞型擴(kuò)增曲線呈典型S型曲線且CT值小于參考值，判斷相應(yīng)的HPV亞型為陽性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0的統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以（n，%）表示，經(jīng) χ2檢驗(yàn)，P＜0.05時(shí)為組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1HPV感染情況及基因分型檢出情況200例受檢女性中，共檢出63例HPV感染，感染率為31.50%；63例HPV陽性標(biāo)本中，檢出16種亞型，其中包括高危亞型12型，低危亞型4例。高危亞型中以HPV16最常見，低危亞型中以HPV54型最常見。

2.2HPV單一亞型和多重亞型感染情況200例受檢女性中，檢出63例HPV感染，單一亞型感染的檢出率明顯高于多重亞型感染，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表 1。

表1　HPV單一亞型和多重亞型感染情況（%）

2.3不同年齡組HPV感染情況比較 將入選女性按照年齡分組，即年齡≤25歲、26-35歲、36-45歲、46-55歲、56-65歲以及年齡＞65歲，各年齡階段的HPV感染率比較，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨著年齡增長，其感染率有逐漸下降趨勢，見表2。

表2　不同年齡組HPV感染情況比較

3　討論

人乳頭瘤病毒（HPV）與宮頸癌的相關(guān)性研究已經(jīng)明確HPV感染是導(dǎo)致宮頸癌的直接原因，也是誘發(fā)宮頸癌的必要條件[6]。針對HPV感染的女性，其宮頸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較無HPV感染的女性發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)更高。宮頸癌屬婦科常見疾病之一，嚴(yán)重影響女性的生命健康。由于宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是宮頸上皮內(nèi)瘤變到浸潤癌的一個(gè)過程，其可預(yù)防，因此，盡早發(fā)現(xiàn)宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌，對于該疾病的診斷和治療尤為重要。HPV屬乳多空病毒科的乳頭瘤空泡病毒A屬，是一種球形DNA病毒，可引起皮膚粘膜鱗狀上皮增殖。目前，臨床已經(jīng)分離出130多種HPV亞型，不同型別引起的臨床表現(xiàn)也不同。目前，我國皮膚型HPV人群的感染率較普遍，如趾疣、扁平疣、尋常疣等，另外，高危型HPV和外生殖器低危型HPV感染，可造成生殖器疣和宮頸炎。相關(guān)流行病學(xué)研究表明，在全球性病當(dāng)中，HPV感染引起的生殖器疣占15%-20%[7]。雖然目前我國并無大量關(guān)于HPV流行病學(xué)篩查的樣本報(bào)告，但因HPV感染造成的尖銳濕疣發(fā)病率呈逐年升高的趨勢，也是性病中發(fā)病率最高的疾病。而我國每年大約有13.15萬新發(fā)的宮頸癌病例，且發(fā)病率和死亡率還在逐漸增長，且發(fā)病年齡越來越趨于年輕化。由此可見，分析HPV感染情況及基因分型檢測，對于防治宮頸癌具有重要指導(dǎo)意義。

PCR分子生物學(xué)檢測技術(shù)是近幾年用于HPV感染診斷的一項(xiàng)新技術(shù)，對于HPV DNA檢測的敏感性較高，尤其是在亞臨床感染和潛伏感染診斷中，PCR體現(xiàn)出了較傳統(tǒng)檢測方法更好的優(yōu)勢[8]。目前，PCR檢測PCR DNA的方法包括斑點(diǎn)跡象、熒光定量PCR、Southern印記等，其中熒光定量PCR的效果最理想，其準(zhǔn)確性和靈敏度均已受到臨床認(rèn)可[9]。

1990年，WHO證實(shí)將高危型HPV確定為宮頸癌的治病因子，因此對于HPV基因分型的檢測尤為重要，有利于宮頸癌的篩查。本研究通過分析在我院進(jìn)行HPV檢測的女性臨床資料，入選的200例女性中，HPV感染率為31.50%。在赤峰地區(qū)HPV的感染率為30.34%，武漢地區(qū)HPV感染率為14.9%，大連地區(qū)HPV感染率為17.09%，本地區(qū)HPV感染率均高于其它地區(qū)，說明HPV的感染有明顯的低于特征，可能與當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)水平、生活方式、初婚年齡、婚外性行為等原因有關(guān)。曾選[10]等研究也提示，對117799例女性宮頸分泌物進(jìn)行HPV分型檢測，其中HPV陽性率為20.94%，單一感染率占74.71%，多重感染占25.29%，且各個(gè)年齡階段中HPV陽性檢出率存在明顯差異。

本研究結(jié)果提示，年齡＞65歲HPV的感染率最低，而在26-55歲之間，發(fā)病率相對較高，且隨著女性年齡增長，HPV的感染率呈逐漸下降趨勢，王長奇[11]等對1336例HPV感染女性的感染率、感染亞型分布特點(diǎn)、HPV感染相關(guān)因素進(jìn)行分析，結(jié)果提示，36-40歲HPV陽性檢出率位6.1%，而41-45歲檢出率為5.1%，46-50歲檢出率為3.4%。說明臨床應(yīng)當(dāng)重視宮頸癌發(fā)病年齡越來越趨于年輕化的問題。原因是，現(xiàn)代女性初次性行為年齡提前，加上性生活頻繁，宮頸鱗柱狀上皮尚處于轉(zhuǎn)化期，給HPV吸附在細(xì)胞表面提供了機(jī)會，從而使得該年齡階段的女性更易受到HPV的感染[12]。研究結(jié)果還提示，單一亞型感染的檢出率明顯高于多重亞型感染。

造成宮頸癌的病因是HPV感染宮頸上皮，并使其發(fā)生瘤變，目前我國宮頸癌的三級預(yù)防中，消除HPV感染是最重要的措施，其中包括注射HPV疫苗和采用利普刀治療HPV感染。宮頸癌疫苗的注射比較簡單，且效果理想。注射HPV預(yù)防性疫苗的機(jī)制是通過體液免疫預(yù)防HPV感染，靶抗原以HPV的衣殼蛋白L1和L2為主，通過誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高滴度的中和抗體，從而誘發(fā)局部的免疫反應(yīng)，從而防止HPV長期/重復(fù)感染[13]。

綜上所述，本地區(qū)的HPV感染以單項(xiàng)基因感染為主。通過對當(dāng)?shù)嘏赃M(jìn)行HPV基因分型檢測，對當(dāng)?shù)睾Y查、防治宮頸癌具有重要意義。只有全面開展宮頸癌的篩查，做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，才可能控制或降低宮頸癌的發(fā)病率和死亡率。

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