茶樹小G蛋白CsRAC5基因的克隆與低溫脅迫下的表達(dá)分析

葉小麗，潘俊廷，朱姣姣，疏再發(fā)，崔傳磊，邢安琪，農(nóng)壽華，朱旭君，房婉萍，王玉花

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茶樹小G蛋白基因的克隆與低溫脅迫下的表達(dá)分析

葉小麗，潘俊廷，朱姣姣，疏再發(fā)，崔傳磊，邢安琪，農(nóng)壽華，朱旭君，房婉萍，王玉花*

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095

小G蛋白是一類重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，參與植物的各項(xiàng)生命活動(dòng)，但目前在茶樹中的研究尚少。本研究以茶樹品種龍井長葉為實(shí)驗(yàn)材料，克隆獲得1個(gè)小G蛋白基因，命名為。序列分析顯示，含有597?bp，編碼198個(gè)氨基酸，具有Rho蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；序列多重比對發(fā)現(xiàn)，該序列與其他物種序列的一致性高達(dá)95.96%。CsRAC5蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量為21.79?kDa，為親水性蛋白；煙草瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)顯示，CsRAC5定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核中。熒光定量PCR結(jié)果顯示，在茶樹中的表達(dá)具有明顯的組織特異性，其中在葉片中的表達(dá)最高，在花粉中的表達(dá)最低；低溫（4℃）脅迫抑制茶樹葉片中的表達(dá)。

茶樹；；生物信息學(xué)分析；低溫脅迫；表達(dá)分析

小G蛋白家族（Small GTPase family）是普遍存在于真核細(xì)胞中的1個(gè)GTP結(jié)合蛋白家族，是真核生物中成員數(shù)量較多的一類信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，有100多種，參與調(diào)控細(xì)胞的多種生命活動(dòng)[1-2]{!!! INVALID CITATION !!!, ;Bourne, 1990 #79}。根據(jù)序列結(jié)構(gòu)和細(xì)胞功能的相似處，小G蛋白超家族可以分為Ras（Sarcoma）、Rho（Ras homolog）、Rab（Rat brain）、Arf（ADP ribosylation factor）和Ran（Ras-related nuclear）5個(gè)亞家族[1]。植物中存在一種特殊的小G蛋白R(shí)OPs（Rho-related GTPase from plants）是Rho家族成員，由于植物中ROPs跟Rho家族成員中Rac非常相似，所以植物中特有的一類小G蛋白R(shí)ac-like GTPase or ROPs（Rho-related GTPases from plants）（RAC/ROPs）也可以稱之為RACs[2]。ROP是植物中的分子開關(guān)，參與感受胞外刺激，如激素、病原體激發(fā)子以及非生物脅迫等信號(hào)，并且能夠通過不同的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來響應(yīng)這些信號(hào)。

茶樹[(L.) O.Kuntze]作為南方丘陵的一種多年生經(jīng)濟(jì)作物，性喜溫[3]。我國許多地區(qū)的茶樹受初冬驟至的寒流或早春“倒春寒”等氣候的影響，茶樹萌芽推遲，生長緩慢；零度以下的凍害使茶葉產(chǎn)量下降，成葉邊緣變褐，葉片呈紫褐色，嫩葉出現(xiàn)“麻點(diǎn)”、“麻頭”[4]，這些成為制約廣大茶區(qū)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要問題。研究茶樹對低溫的響應(yīng)機(jī)理對保障茶樹安全越冬、預(yù)防“倒春寒”和茶樹引種都具有重要意義。目前，雖然未見小G蛋白參與茶樹低溫脅迫的研究，但是低溫脅迫可以通過誘導(dǎo)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，與下游的順式作用元件特異性結(jié)合，激活下游與抗逆相關(guān)的基因的表達(dá)來提高植物的抗性。這些基因的表達(dá)受Ca2+調(diào)控[5]。一些二級(jí)信號(hào)分子，如ABA[6]、ROS[7]也可通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+流動(dòng)從而引發(fā)低溫脅迫信號(hào)應(yīng)答。越來越多的研究表明ROPs參與細(xì)胞骨架的組織動(dòng)態(tài)與囊泡運(yùn)輸，響應(yīng)激素信號(hào)[8-12]，保衛(wèi)細(xì)胞開放和閉合[13]，H2O2的產(chǎn)生[14]。更重要的是植物特有蛋白家族RIC（ROP-interactive CRIB-containing protein）是RAC/ROP的下游效應(yīng)因子[15]，AtROP1能夠激活A(yù)tRIC3通過一條Ca2+依賴的途徑導(dǎo)致F-肌動(dòng)蛋白的分解[16]。所以我們推測小G蛋白與低溫脅迫之間可能存在相應(yīng)的聯(lián)系。

本實(shí)驗(yàn)從茶樹品種龍井長葉的cDNA中克隆得到1個(gè)小G蛋白基因，通過生物信息學(xué)的方法對其氨基酸序列進(jìn)行比對分析，并采用熒光定量PCR，探討該基因在茶樹不同組織部位的表達(dá)差異和低溫脅迫下表達(dá)變化情況，為茶樹在低溫條件下的分子育種提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)選用江蘇省雅潤茶苗繁育中心兩年生龍井長葉（cv）水培苗為研究對象，取幼嫩葉提取RNA，用于后續(xù)克隆實(shí)驗(yàn)。另外，取栽植于南京市中山陵茶廠的5年生龍井長葉的根、莖、葉、老葉、花、果實(shí)、種子和花粉，用于后續(xù)基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)。茶花采于2016年10月—11月上旬盛花期間，下午16~17時(shí)采摘處于蕾白期的花，花粉的收集方法參照陳暄等[17]報(bào)道的方法。2016年10月20日將茶苗放入RXZ型人工智能氣候箱，晝夜溫度25℃/20℃，光周期與暗培養(yǎng)周期為12?h/12?h，光照強(qiáng)度30?klx，相對濕度75%~80%，培養(yǎng)2周后將茶苗放入4℃人工氣候箱低溫處理。分別于處理0、1、4、8、12、24?h后取茶苗中部成熟葉片，放入液氮速凍，–70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

EASYspin plus植物RNA提取試劑盒和EASYspin植物快速提取試劑盒購于北京艾德萊生物科技有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs、Marker、PMD?19-T Vector、RNA酶抑制劑、SYBR?Premix Ex TaqⅡ、反轉(zhuǎn)錄試劑盒等均購于寶生物工程（大連）有限公司。Agarose Gel DNA Purification Kit購于美國OMEGA Biotek公司。其余試劑為國產(chǎn)分析純試劑。大腸桿菌菌株DH5α由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉科學(xué)研究所保存。

1.2 總RNA的提取及cDNA的合成

利用EASYspin植物快速提取試劑盒，按照說明書提取龍井長葉幼嫩葉的總RNA，并利用NanoDrop測得RNA濃度，1%的瓊脂糖膠檢測RNA的完整性，觀察18?S、28?S條帶。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.3 CsRAC5基因的克隆

利用本課題組已有轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[18]，通過Blast比對，將推測的ROP序列與擬南芥的11個(gè)ROP氨基酸序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)1個(gè)目標(biāo)序列與擬南芥的AtRAC5（登錄號(hào)：AT1G75840）序列高度同源，命名其基因?yàn)?。利用DNAMAN6.0設(shè)計(jì)ORF區(qū)全長引物，引物序列為-F：5′-ATGAGT GCTTCGAGGTTCATC-3′，-R：5′-ACAAGATACTGCAATTTTTTTG。PCR的擴(kuò)增體系為20?μL：酶10?μL，ddH2O 7?μL，上游引物1?μL，下游引物1?μL，模板cDNA 1?μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3?min；94℃變性30?s，56℃退火30?s，72℃延伸1?min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10?min。取5?μL產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。按照Agarose Gel DNA Purification Kit試劑盒說明書回收PCR產(chǎn)物，連接到PMD-19T載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α。取部分菌液委托南京金斯瑞公司測序。

1.4 序列分析

將公司測序的結(jié)果，利用NCBI中的生物軟件（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行比對分析。使用相關(guān)程序（https://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi）對獲得的氨基酸序列和蛋白序列進(jìn)行BLAST比對搜索和保守結(jié)構(gòu)域與功能域的預(yù)測；序列多重比對使用DNAMAN6.0；蛋白質(zhì)的組成成分與理化性質(zhì)使用EXPASY（http://www.expasy.org）軟件；ProtScale（http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）分析其親/疏水性質(zhì)；利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）在線程序預(yù)測CsRAC5蛋白的α-螺旋、β-折疊和其他二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用COILS（http://embnet.vital-it.ch/ software/COILS_form.html）預(yù)測它們的卷曲螺旋（Coils）區(qū)域；利用TMHMM Server.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）預(yù)測它們的跨膜結(jié)構(gòu)域；利用SignalIP4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測。利用TargetP1.1 Server- predition results（http://www.cbs.dtu.dk/services/ ChloroP）預(yù)測它們在細(xì)胞中的定位。利用Swiss-Model（http://www.Swissmodel.expasy.org）構(gòu)建蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)模型。

1.5 CsRAC5亞細(xì)胞定位

將不含有終止密碼子的連接到植物瞬時(shí)表達(dá)載體p576，構(gòu)建由Ubiquitin啟動(dòng)子啟動(dòng)的pGreenⅡ-Hyg-UBQ10-RAC5-eGFP融合蛋白表達(dá)載體。采用凍融法將融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌（）GV3101-pSoup中，參照Spaekes等[19]的方法侵染煙草表皮細(xì)胞，25℃暗培養(yǎng)3?d后使用共聚焦顯微鏡觀察熒光信號(hào)。

1.6 CsRAC5組織表達(dá)特異性與低溫處理下的表達(dá)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 CsRAC5基因的擴(kuò)增

通過本課題組原有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，將推測的ROP序列與擬南芥的11個(gè)ROP氨基酸序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)一個(gè)目標(biāo)序列與擬南芥的AtRAC5（登錄號(hào)：AT1G75840）序列高度同源。以龍井長葉的幼嫩葉cDNA為模板，以-F和-R引物，經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到一個(gè)600?bp左右的片段（圖1），序列測定與分析結(jié)果表明，基因片段為597?bp，編碼198個(gè)氨基酸（圖2）。

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 序列比對與進(jìn)化樹分析

利用BLAST-conserved domains search對基因的氨基酸保守域預(yù)測（圖3），CsRAC5擁有Rop-like保守結(jié)構(gòu)域，9~178之間是一個(gè)Rho結(jié)合域，Rho結(jié)構(gòu)域中含有GTP/GDP結(jié)合區(qū)域、Effector（下游效應(yīng)因子）區(qū)域，Rho插入?yún)^(qū)域、絲氨酸/蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，堿性氨基酸區(qū)域以及與堿性氨基酸區(qū)域緊鄰位于C末端保守的異戊烯基化位點(diǎn)等保守結(jié)構(gòu)。符合小G蛋白家族基因的保守區(qū)域結(jié)構(gòu)特性。

注：M表示marker，1表示CsRAC5基因。

注：下劃線標(biāo)注的氨基酸序列為Rop-like結(jié)構(gòu)域。Note: The amino acid sequences underlined mean Rop-like domain.

利用BLAST進(jìn)行同源序列比對，將茶樹的基因與胡楊（）、巨桉（）、小果野芭蕉（）、油棕（）、芝麻（）RAC5進(jìn)行多重序列比對，結(jié)果顯示同源性達(dá)95.96%（圖4）。

利用MEGA7.0軟件將CsRAC5與擬南芥11個(gè)RAC/ROP構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5），結(jié)果表明CsRAC5與AtRAC5親緣關(guān)系最近，屬于RAC/ROP四類分類法中的第Ⅳ類,此類主要調(diào)控肌動(dòng)蛋白骨架組裝、細(xì)胞的極性生長以及激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等[23]。

圖3 CsRAC5的保守區(qū)預(yù)測

圖4 茶樹CsRAC5與其它物種的多序列比對

圖5 茶樹CsRAC5與擬南芥RAC/ROP基因的同源進(jìn)化樹分析

2.2.2 氨基酸組成、理化性質(zhì)分析及結(jié)構(gòu)預(yù)測

根據(jù)BLAST同源比對的結(jié)果，挑選不同物種中ROP相似度較高的序列，利用ExPASy- ProtParam對挑選的序列進(jìn)行氨基酸組成和理化性質(zhì)的分析。結(jié)果顯示（表1），這些植物中小G蛋白的氨基酸數(shù)量為196~198，相對分子質(zhì)量在21?500左右，理論等電點(diǎn)在9.3左右，正電荷氨基酸25左右，負(fù)電荷氨基酸17左右，不穩(wěn)定系數(shù)在39左右，這些蛋白都屬于穩(wěn)定蛋白，總平均疏水性（GRAVY）均為負(fù)值，表明這些蛋白均為親水性蛋白。

KinasePhos軟件分析顯示CsRAC5有11個(gè)絲氨酸（S）激酶、12個(gè)蘇氨酸（T）激酶、17個(gè)酪氨酸（Y）激酶潛在磷酸化位點(diǎn)，0個(gè)組氨酸（H）磷酸化位點(diǎn)。TMHMM跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，CsRAC5不具備跨膜螺旋區(qū)。

Predict Protein蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，CsRAC5含有α-螺旋（Hh）34處，延伸鏈（Ee）61處，β-轉(zhuǎn)角（Tt）0處，無規(guī)則卷曲（Cc）103處，分別占總氨基酸的17.17%，30.81%，0，52.02%。另外，同源建模發(fā)現(xiàn)，CsRAC5蛋白與AtRAC5蛋白的相似性達(dá)到90%以上（圖6）。

2.2.3 CsRAC5的信號(hào)肽分析和亞細(xì)胞定位

SignalIP信號(hào)肽預(yù)測顯示，在CsRAC5中，C最大值出現(xiàn)在94位，該位置最可能出現(xiàn)剪切位點(diǎn)；S最大值出現(xiàn)在91位，表明該位置為信號(hào)肽部分，Y的最大值出現(xiàn)在94位。所以可以判斷最理想的剪切位點(diǎn)位置在93與94之間，成熟蛋白啟動(dòng)的位置為94。CsRAC5蛋白質(zhì)線粒體靶向肽（mTP）為0.142；葉綠體靶向肽（cTP）為0.086；分泌通路信號(hào)肽（SP）為0.367；其他形式的肽分別為0.601，說明其為其他形式的肽的可能性較大。

為了進(jìn)一步闡明CsRAC5蛋白在何處發(fā)揮其生物學(xué)功能，利用農(nóng)桿菌侵染煙草葉片，進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)CsRAC5-eGFP融合蛋白。利用激光共聚焦顯微鏡對綠色熒光蛋白觀察發(fā)現(xiàn)，綠色熒光信號(hào)定位在細(xì)胞核和細(xì)胞膜中（圖7），我們推測CsRAC5可能在細(xì)胞核和細(xì)胞膜上行使生物學(xué)功能。

2.3 CsRAC5基因的組織特異性表達(dá)分析

提取龍井長葉的根、莖、葉、芽、花、果、花粉、花粉管的RNA，進(jìn)行熒光定量PCR，分析在茶樹各組織中的相對表達(dá)水平，結(jié)果顯示，在葉片中的表達(dá)水平最高，其次是芽、莖、果、花、根、花粉、花粉管（圖8）。表明在茶樹各組織器官的表達(dá)呈現(xiàn)組織特異性。

圖6 CsRAC5的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

注：A：明圖視野，B：熒光圖，C：疊加圖。Note: A: Bright field, B: Green fluorescence, C: Merge.

表1 不同物種中RAC氨基酸組成成分及理化性質(zhì)分析

注：不同字母代表顯著性差異，下同。

2.4 低溫處理下CsRAC5表達(dá)量變化情況

低溫處理龍井長葉水培苗1、4、8、12、24?h后的表達(dá)量與對照（0?h）相比，發(fā)現(xiàn)的表達(dá)量呈現(xiàn)先下降后上升然后相對穩(wěn)定的情況（圖9）。

3 討論

通過同源序列比對和RT-PCR的方法克隆得到茶樹1個(gè)小G蛋白基因，它具有典型的Rop蛋白的特征結(jié)構(gòu)域，與其他植物中的Rop基因高度相似性。屬于P-loop_NTPase超家族，P-loop包含三核苷酸水解酶，具有Rop-like特異性結(jié)合位點(diǎn)。每個(gè)小G蛋白氨基酸包含7個(gè)典型的功能區(qū)，4個(gè)保守的鳥嘌呤核苷酸結(jié)合區(qū)域，多個(gè)與下游效應(yīng)分子結(jié)合位點(diǎn)（GAP、GEF、GDI）以及Rho插入?yún)^(qū)和膜定位信號(hào)[8]。ROP GTPase在GDP結(jié)合的非活性形式和GTP結(jié)合的活性形式之間不斷轉(zhuǎn)化，其活性可以受到GEFs、GAPs、GDIs的精密調(diào)控[15, 24]。ROP通過這3種蛋白的調(diào)控，介導(dǎo)胞外信號(hào)到胞內(nèi)的傳遞[25]。該超家族具有特定的核苷磷酸結(jié)合形式。在其保守區(qū)域內(nèi)含有鳥苷酸和5個(gè)GTPase活化位點(diǎn)（GⅠ-GⅣ），并且包括1個(gè)效應(yīng)器分子結(jié)合域E（effector domain）和C-末端的異戊烯基化位點(diǎn)，Rho Insert為Rho GTPase特有的結(jié)構(gòu)，另外包括switchⅠ和switchⅡ2個(gè)開關(guān)轉(zhuǎn)換區(qū)域，為蛋白的2個(gè)表面環(huán)區(qū)，當(dāng)圍繞著GTP的γ-磷酸根結(jié)合后，蛋白就會(huì)發(fā)生構(gòu)象的改變，這讓鳥嘌呤核苷酸的結(jié)合區(qū)在空間上的結(jié)構(gòu)更接近[25]。

圖9 低溫對茶樹CsRAC5表達(dá)水平的影響

生物信息學(xué)分析表明CsRAC5是非跨膜的分泌型蛋白，含有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)和信號(hào)肽，表明它擁有細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，與茶樹的生命活動(dòng)以及逆境脅迫和非逆境脅迫密切相關(guān)。同源性結(jié)果表明，與同源性最高。亞細(xì)胞定位分析CsRAC5蛋白定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞核上。組織特異性結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因在葉片中的表達(dá)水平最高，花粉管中最低，這與其他物種中該基因的組織特異性表達(dá)量不盡一致[27]。

低溫處理抑制基因的表達(dá)，這一結(jié)果與王偉東等[18]的研究中低溫能夠抑制花粉管中該基因的表達(dá)以及Jin等[28]玉露桃冷害脅迫后ROP基因表達(dá)量顯著降低相一致，ROP基因與NADPH oxidase和CCR相互作用，參與植物的冷害脅迫。我們從在低溫處理過程中表達(dá)量先下降后上升，逐漸趨于平穩(wěn)的表達(dá)趨勢推測可能參與了茶樹抵抗低溫脅迫的前期信號(hào)調(diào)控，是低溫脅迫下的一個(gè)短時(shí)應(yīng)激蛋白，但具體調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

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Cloning and Expression Analysis of Small GTPase () under Cold Stress in Tea Plant ()

YE Xiaoli, PAN Junting, ZHU Jiaojiao, SHU Zaifa, CUI Chuanlei, XING Anqi, NONG Shouhua, ZHU Xujun, FANG Wanping, WANG Yuhua*

College of Horticulture, Nangjing Agricultural University, Nanjing 210095, China

Small GTPase binding proteinsare a kind of important signal transduction proteins, which are involved in various life activities of plants.However, few relative studies were reported in tea plants (). Here, a small GTPase binding protein namedwas cloned by using a cDNA template from tea cultivar ‘Longjingchangye’. The results showed that the length of its open reading frame (ORF) is 597?bp, encoding 198 amino acids.It has a conserved Rho domain which belongs to ROP family. Multiple alignment of CsRAC5 with homologue genes in other plant species showed that their identity could reach 95.96%. CsRAC5 is a hydrophilic protein with the theoretical relative weight of 21.79?kDa. The subcellular assay showed that CsRAC5 was localized in the nuclear and membrane. In addition, the results of RT-PCR analysis showed that the highest expression level ofwas in leaves but the lowest in pollen. Theexpression level ofwas decreased undercold stress.

,, bioinformatics analysis,cold stress, expression analysis

S571.1；Q52

A

1000-369X(2018)02-146-09

2017-10-09

2017-11-25

國家自然科學(xué)基金（31770733，31370014）、連云港市科技計(jì)劃項(xiàng)目（SF1502）、南京市科技計(jì)劃項(xiàng)目（201608068）

葉小麗，女，碩士研究生，主要研究方向?yàn)椴铇湓耘嘤N。

wangyuhua@njau.edu.cn