人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對巨噬細(xì)胞表型調(diào)節(jié)的機制探討

薛 婧，高杰清，尹雅琪，張 琪，于松巖，鄒俊彥，郝好杰，母義明

解放軍總醫(yī)院，北京 100853 1內(nèi)分泌科；2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)所

間充質(zhì)干細(xì)胞是具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞。近年來，間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)能力越來越受重視。間充質(zhì)干細(xì)胞能控制炎癥進(jìn)展，促進(jìn)組織修復(fù)，治療多種與免疫及炎癥相關(guān)的疾病[1]。巨噬細(xì)胞是體內(nèi)重要的吞噬和抗原提呈細(xì)胞，在機體穩(wěn)態(tài)維持和炎癥的發(fā)生發(fā)展中有著關(guān)鍵作用[2]。巨噬細(xì)胞具有高度的可塑性和明顯的異質(zhì)性，可大致可分為兩種表型：經(jīng)典活化的M1型巨噬細(xì)胞和選擇性活化的M2型巨噬細(xì)胞[3]。M1型巨噬細(xì)胞主要分泌高濃度的IL-1β、TNF-α、干擾素γ(interferonγ，IFN-γ)等促炎因子，引發(fā)機體炎癥反應(yīng)，發(fā)揮宿主免疫功能，但過度的炎癥會導(dǎo)致機體正常組織的損傷。M2型巨噬細(xì)胞主要分泌IL10、IL-4、TGF-β等抑炎因子，可控制炎癥發(fā)展，促進(jìn)組織修復(fù)[3]。巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變與組織的炎癥和修復(fù)密切相關(guān)，如機體脂肪組織中M1型巨噬細(xì)胞向M2型極化有利于減輕胰島素抵抗，改善2型糖尿病[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病、動脈粥樣硬化、敗血癥等代謝性和炎性疾病中[6-8]，間充質(zhì)干細(xì)胞輸注后受損組織局部巨噬細(xì)胞功能和表型發(fā)生改變，但間充質(zhì)干細(xì)胞(特別是人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞)對巨噬細(xì)胞表型的調(diào)節(jié)及其機制仍有不明確之處。因此，本研究旨在探究人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞對巨噬細(xì)胞表型的影響及其潛在的機制，為干細(xì)胞的應(yīng)用提供新的思路。

材料和方法

1 細(xì)胞 小鼠骨髓巨噬細(xì)胞(bone marrow derived macrophages，BMDMs)、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞均提取自6周齡的C57BL/6J小鼠，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞提取自人新鮮臍帶。

2 主要試劑與儀器 RMPI1640培養(yǎng)基，0.25%胰蛋白酶，胎牛血清(美國Gibco公司)；M-CSF、流式抗體F4/80-PE(德國Becton Dickinson公司)；TrizolRNA提取試劑(美國Invitrogen公司)；PCR引物由華大基因合成；iNOS抗體、Arg1抗體(美國Abcam公司)；P-AKT、PI3K抗體(美國CST公司)、β-tubulin抗體、Western blot二抗 (中山金橋 )；LPS、IFN-γ(美國 Sigma公司 )、7-AAD(美國 Tonbobio公 司 )、IL-1β、TNF-α、IL-4、AIMPLEX流式檢測試劑盒(中國曠博生物公司)、流式細(xì)胞儀(德國Becton Dickinson公司)，Q-PCR儀器(美國Bio-Rad公司)、激光共聚焦顯微鏡(Leica，德國 )。

3 小鼠巨噬細(xì)胞培養(yǎng)及分組 骨髓巨噬細(xì)胞提?。簩?周齡C57BL/6J小鼠斷頸處死，分離小鼠雙下肢，剝除皮膚后于75%乙醇中浸泡5 min，在超凈臺中剝離下肢肌肉組織，完整分離出雙側(cè)脛骨和腓骨。分別將脛骨和腓骨兩端剪開，用1 ml注射器吸取含有10%胎牛血清和100 ng/ml M-CSF的1640培養(yǎng)基，反復(fù)沖洗骨髓腔至變白。收集骨髓腔沖洗液，1 000 r/min離心5 min，棄上清后重懸細(xì)胞，接種于六孔版內(nèi)，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d換液1次。腹腔巨噬細(xì)胞提?。簲囝i處死6周齡C57BL/6J小鼠，75%乙醇浸泡5 min，于超凈臺中分離腹部皮膚暴露腹腔，用2 ml含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基灌洗腹腔。將腹腔灌洗液1 000 r/min離心5 min，重懸接種于放置無菌蓋玻片的六孔板中。將細(xì)胞分為對照組、LPS和IFN-γ誘導(dǎo)組、干細(xì)胞共培養(yǎng)組，對照組更換為1640完全培養(yǎng)基，LPS和IFN-γ誘導(dǎo)組、干細(xì)胞共培養(yǎng)組換為含100 ng/ml LPS和50 ng/ml IFN-γ的培養(yǎng)基。24 h后再次換液，各組均更換為完全培養(yǎng)基，干細(xì)胞共培養(yǎng)組與3×104人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞通過Transwell共培養(yǎng)24 h。收集各組細(xì)胞檢測各項指標(biāo)。

4 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定見參考文獻(xiàn)[9]。

5 Western blot檢測巨噬細(xì)胞蛋白表達(dá) 各組巨噬細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后，提取細(xì)胞總蛋白，取等量的細(xì)胞蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE凝膠電泳，再轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，BSA封閉后，加入iNOS(1/1 000)、Arg1(1/1 000)、P-AKT(1/1 000)、PI3K(1/1 000)、Tubulin(1：2 000)、GAPDH(1：2 000)一抗，4℃孵育過夜。用TBST充分洗膜3次，并予以對應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h后曝光。使用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

6 流式細(xì)胞術(shù)鑒定巨噬細(xì)胞及測定上清細(xì)胞因子表達(dá) 選取生長至80%融合的細(xì)胞，收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，100μl PBS重懸細(xì)胞，加入F4/80-PE抗體和相應(yīng)的小鼠IgG作為同型對照，避光孵育15 min。PBS洗滌2次后重懸，再加入7-AAD，利用流式細(xì)胞儀檢測BMDMs免疫表型。收集經(jīng)過相應(yīng)處理的各組細(xì)胞的培養(yǎng)液，1 000 r/min離心5 min，吸取上清加樣，分別加入小鼠IL-1β、TNF-α、IL-4流式抗體孵育，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞因子表達(dá)。

7 qRT-PCR檢測巨噬細(xì)胞標(biāo)記物和炎癥相關(guān)因子mRNA表達(dá) Trizol法提取各組細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，選取β-actin作為內(nèi)參照，利用2-ΔΔCt計算基因表達(dá)相對倍數(shù)變化。

8 免疫熒光檢測巨噬細(xì)胞表型變化 將腹腔巨噬細(xì)胞接種于已放置無菌蓋玻片的六孔板中，按前述步驟處理各組細(xì)胞，之后使用4%多聚甲醛固定15 min，0.5% TritonX-100/PBS通透液破膜15 min，10%山羊血清封閉20 min，加iNOS(1∶100)、Arg1(1∶100)抗體4℃孵育過夜。PBS洗滌3次后加入對應(yīng)熒光二抗避光孵育2 h，最后DAPI(1∶2 000)染核7 min。使用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照，計算細(xì)胞陽性比率。

9 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析，計量數(shù)據(jù)結(jié)果以-x±s表示，多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 巨噬細(xì)胞的鑒定及其形態(tài)學(xué)特點 小鼠BMDMs經(jīng)過流式細(xì)胞術(shù)測定，巨噬細(xì)胞特異性表面標(biāo)記物F4/80陽性率99%以上，提示骨髓單核細(xì)胞成功誘導(dǎo)為成熟巨噬細(xì)胞(圖1A)；腹腔巨噬細(xì)胞免疫熒光顯示，F(xiàn)4/80陽性率達(dá)到95%以上，達(dá)到實驗要求(圖1B)。光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)各組巨噬細(xì)胞形態(tài)上存在差異：對照組BMDMs大小和形態(tài)均一，呈現(xiàn)類圓形，生長狀態(tài)良好；LPS+IFN-γ誘導(dǎo)組細(xì)胞形態(tài)多變，部分細(xì)胞出現(xiàn)偽足，呈長梭形細(xì)胞比例明顯升高；經(jīng)過與干細(xì)胞共培養(yǎng)，巨噬細(xì)胞觸角減少，長梭形細(xì)胞減少(圖2)。

2 UC-MSCs對巨噬細(xì)胞炎癥相關(guān)因子表達(dá)的影響qRT-PCR結(jié)果顯示，與LPS和IFN-γ誘導(dǎo)組

相比，干細(xì)胞共培養(yǎng)組炎性因子IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL6表達(dá)明顯下調(diào)(P均＜0.05，圖3A)，抑炎因子IL-4、IL10表達(dá)上調(diào)(P＜0.05，圖3A)。利用流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞上清蛋白含量，與PCR結(jié)果類似，與LPS+IFN-γ誘導(dǎo)組相比，UC-MSCs共培養(yǎng)后巨噬細(xì)胞分泌的IL-1β、TNF-α分別下調(diào)79.5%、41.1%(P均＜0.05，圖3B)，抑炎因子IL-4表達(dá)上調(diào)91.4%(P＜0.05，圖3B)，提示UCMSCs能明顯抑制M1型巨噬細(xì)胞引發(fā)的炎性反應(yīng)。

3 UC-MSCs促使巨噬細(xì)胞向M2表型極化 免疫熒光顯示，干細(xì)胞共培養(yǎng)組與LPS+IFN-γ誘導(dǎo)組相比，M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物iNOS陽性細(xì)胞比例下降32.48%(P＜0.01，圖4A)，M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物Arg1陽性細(xì)胞比例升高32.25%(P＜0.01，圖4A)。Western blot結(jié)果同樣顯示，經(jīng)過UC-MSCs共培養(yǎng)后，巨噬細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)下降(P＜0.01，圖4B)，Arg1蛋白表達(dá)顯著提高(P＜0.01，圖4B)。以上結(jié)果提示UC-MSCs促進(jìn)巨噬細(xì)胞由M1型向M2型極化。

4 PI3K/AKT通路參與UC-MSCs促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化的過程 為了進(jìn)一步探討UC-MSCs對巨噬細(xì)胞表型調(diào)節(jié)的機制，我們檢測了參與巨噬細(xì)胞極化的PI3K/AKT通路。Western blot分析顯示，與UC-MSCs共培養(yǎng)后，巨噬細(xì)胞PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)上調(diào)(P＜0.01，圖5A，圖5B)。給予巨噬細(xì)胞PI3K通路抑制劑LY294002處理后，被UC-MSCs抑制的巨噬細(xì)胞iNOS表達(dá)上調(diào)，而Arg1表達(dá)有所下調(diào)(P均＜0.01，圖5A，圖5B)，提示UC-MSCs的作用被該抑制劑阻斷，說明PI3K/AKT通路參與了UC-MSCs促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞向M2型極化的過程。

圖1 巨噬細(xì)胞的鑒定 A: 流式細(xì)胞術(shù)檢測骨髓來源巨噬細(xì)胞F4/80表達(dá)； B: 免疫熒光檢測腹腔巨噬細(xì)胞F4/80的表達(dá)(紅色)Fig. 1 Identification of macrophages A: Expression of F4/80 in bone marrow derived macrophages(BMDMs) was detected by flow cytometry; B: Expression of F4/80 (red) in peritoneal macrophages was evaluated by immunofluorescence

圖2 光鏡下骨髓來源巨噬細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(40×)Fig. 2 Morphological characteristics of BMDMs (40×)

討 論

間充質(zhì)干細(xì)胞是具有多向分化潛能和自我更新能力的一類成體干細(xì)胞，在機體中分布廣泛。近年來研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞具有顯著的免疫調(diào)控能力[10]，在炎性微環(huán)境中能調(diào)節(jié)如T細(xì)胞[11]、NK細(xì)胞[12]、DC細(xì)胞[13]等免疫細(xì)胞的表型和功能，從而抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)，在自身免疫性疾病和炎癥性疾病治療上顯示出了良好的前景。目前關(guān)于UC-MSCs對巨噬細(xì)胞表型的調(diào)節(jié)及其機制的報道較少，因此本研究主要探討了UC-MSCs對巨噬細(xì)胞表型的影響及其相關(guān)的信號通路。

巨噬細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，根據(jù)其功能、表面標(biāo)記物、分泌譜等，大致可分為經(jīng)典活化的M1型巨噬細(xì)胞和選擇性活化的M2型巨噬細(xì)胞[1]。IFN-γ和TLR配體如LPS可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1表型極化。M1型巨噬細(xì)胞主要分泌 IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-12、IL-23、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶等，具有抗原提呈和活化T細(xì)胞的能力，是炎癥反應(yīng)重要的效應(yīng)細(xì)胞。M2型包括M2a、M2b、M2c等多個亞型，總體而言，M2型巨噬細(xì)胞IL10高表達(dá)，并分泌大量的IL10、TGF-β、VEGF等細(xì)胞因子，促進(jìn)Th2細(xì)胞免疫反應(yīng)，具有緩解炎癥、促進(jìn)血管生成和組織修復(fù)的作用[14]。M1型巨噬細(xì)胞的大量浸潤與代謝性疾病的進(jìn)展密切相關(guān)[15]。如2型糖尿病的進(jìn)展伴隨著胰島中巨噬細(xì)胞表型的改變。正常狀態(tài)下，胰島中固有巨噬細(xì)胞多呈CD11b+Ly-6C-的M2表型。隨著糖尿病進(jìn)程，胰島中分泌IL-1β、TNF-α的CD11b+Ly-6C+促炎型巨噬細(xì)胞顯著增多，參與了β細(xì)胞的損傷和凋亡[16]。而促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化可抑制炎癥，延緩疾病進(jìn)展。

本研究利用LPS和IFN-γ處理巨噬細(xì)胞24 h來誘導(dǎo)形成M1型巨噬細(xì)胞。LPS和IFN-γ處理后，巨噬細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，長梭形細(xì)胞數(shù)目顯著增加，IL-1β、TNF-α的mRNA和蛋白水平的表達(dá)量明顯上調(diào)(P均＜0.05)，免疫熒光和Western blot結(jié)果顯示iNOS表達(dá)明顯上升(P＜0.01)，提示M1型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)成功。而經(jīng)過與干細(xì)胞共培養(yǎng)后，長梭形細(xì)胞減少，細(xì)胞黏附性增強，胞內(nèi)顆粒增多。免疫熒光和Western blot均顯示，與LPS和IFN-γ的誘導(dǎo)組相比，干細(xì)胞共培養(yǎng)組巨噬細(xì)胞iNOS表達(dá)下調(diào)，Arg1表達(dá)明顯上調(diào)，提示UCMSCs共培養(yǎng)后，M1型巨噬細(xì)胞表型向M2轉(zhuǎn)變。同時，巨噬細(xì)胞分泌的IL-1β、TNF-α、IFN-γ等炎性因子下降，其中IL-1β下降顯著。TNF-α可誘發(fā)級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致及組織損傷和局部炎癥的遷移擴散。IL-1β是促炎型巨噬細(xì)胞分泌的主要效應(yīng)因子之一，IL-1β前體經(jīng)過NLRP3炎性小體激活，成為成熟的IL-1β后分泌，引發(fā)局部組織炎癥[17]。值得注意的是，胰島β細(xì)胞表面具有大量的IL-1β受體，高濃度的IL-1β是導(dǎo)致糖尿病前期以及糖尿病階段β細(xì)胞損傷的關(guān)鍵因素[18]。因此，UC-MSCs通過顯著抑制巨噬細(xì)胞IL-1β的分泌，可能具有改善胰島功能的作用。

PI3K/AKT通路是參與巨噬細(xì)胞激活與極化的重要通路之一[19-21]。PI3K能激活其下游的AKT和mTOR，從而抑制NF-κB的激活、促進(jìn)C/EBP的活化，進(jìn)而抑制巨噬細(xì)胞炎性因子分泌，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2表型活化[20]。我們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過與UC-MSCs共培養(yǎng)，巨噬細(xì)胞PI3K、p-AKT表達(dá)增強(P均＜0.01)，在加入該通路抑制劑Ly294002后，Western blot結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞iNOS表達(dá)升高，Arg1表達(dá)下降(P均＜0.01)，說明M1型巨噬細(xì)胞向M2表型極化減弱，提示PI3K/AKT通路參與了UC-MSCs促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化的過程。UC-MSCs具有強大的分泌功能，UC-MSCs分泌了哪些細(xì)胞因子促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化還需要進(jìn)一步探索。

通過以上研究，我們發(fā)現(xiàn)UC-MSCs能通過PI3K/AKT通路促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞向M2型極化，降低炎性因子分泌，從而抑制炎癥。鑒于巨噬細(xì)胞廣泛參與了機體穩(wěn)態(tài)維持和多種生理病理過程，UC-MSCs對巨噬細(xì)胞表型的調(diào)節(jié)可能參與了UCMSCs對多種免疫和炎癥性疾病的治療過程，特別是肥胖相關(guān)的代謝性疾病。因此，本研究進(jìn)一步揭示了UC-MSCs的免疫調(diào)控特性，為UC-MSCs的應(yīng)用提供了新的前景。

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