逆流超聲輔助酶解法制備大米ACE抑制肽

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(江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

米渣是生產(chǎn)淀粉、糖、味精、檸檬酸及釀酒等產(chǎn)品的加工副產(chǎn)物[1],富含優(yōu)質(zhì)的蛋白(40%～65%)[1],目前主要用于動物飼料生產(chǎn),沒有挖掘其潛在價值進行高值化利用,難以實現(xiàn)米渣價值的最大化,因此,急需對米渣進行精深加工。

研究表明,酶解菜籽粕[2]、玉米胚芽粕[3]等植物原料制備的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(Angiotensin-I Converting Enzyme,ACE)抑制肽能有效地降低血壓,因此,從米渣中提取大米蛋白用于酶解制備ACE抑制肽有望實現(xiàn)對米渣的高值化利用。近年來,非熱物理加工技術(shù)發(fā)展迅速,已廣泛的應(yīng)用于食品深加工研究領(lǐng)域[4]。尤其是超聲波技術(shù),已經(jīng)在促進活性成分的提取[5]、輔助酶解[6]和促進蛋白乳化[7]等方面起到顯著的效果,其中最為顯著的是在超聲輔助酶解方面,能夠有效地解決酶解產(chǎn)物活性不高、酶解不充分[8]等問題,如毛麗琴[9]用超聲波輔助酶解制備ACE抑制肽。但傳統(tǒng)的超聲設(shè)備如李敏[10]等人使用的超聲清洗機,張輝[11]使用的超聲探頭發(fā)生器均存在超聲頻率固定、超聲不均勻、設(shè)備不易放大等缺陷,很難應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。因此,需要研發(fā)新型超聲設(shè)備解決此類問題。

本文使用自主研發(fā)的新型逆流超聲設(shè)備,可更換超聲頻率,逆流超聲使超聲更均勻。以大米蛋白為研究對象,首先優(yōu)化酶解參數(shù),在最優(yōu)酶解參數(shù)基礎(chǔ)上,研究不同超聲參數(shù)預(yù)處理對大米蛋白酶解物ACE抑制活性的影響。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

米渣(實驗測定蛋白含量56.1%)湖北京源山生物科技股份有限公司;ACE自提[12](200 g豬肺可提取ACE 356.41 U,比活力3.00412×104U/g);馬尿酸(Hippuric acid,Hip)中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司;馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(N-hippuryl-His-Leu tetrahydrate,HHL)美國Sigma公司;堿性蛋白酶(酶活2.09454×105U/g)河南鑫宏泰生物科技有限公司;甲醇、乙腈上海安普實驗科技股份有限公司。

JY98-IIIDN型超聲細胞粉碎機寧波新芝生物科技股份有限公司;逆流超聲波設(shè)備江蘇大學食品與生物工程學院(見圖1);DF-1型集熱式恒溫磁力攪拌器金壇市中大儀器廠;DR-5C型低溫冷凍離心機上海安亭科學儀器廠;PHS-3C型酸度計上海鴻蓋儀器有限公司;Card-Waters型高效液相色譜系統(tǒng)美國Waters公司;ALPHA-2-4 Card-真空冷凍干燥機德國Martin Christ公司。

圖1　超聲設(shè)備示意圖Fig.1　Schematic diagram of ultrasonic equipment

1.2　實驗方法

1.2.1大米蛋白的提取參考Yang[13]等所描述的大米蛋白提取方法,將80 g米渣加入1000 mL蒸餾水,用3 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)混合液的pH,熱水浴使溫度穩(wěn)定在50 ℃,攪拌3 h,穩(wěn)定pH為7.8。然后在5000 r/min下離心15 min,取上清液用3 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH到4.0,再在5030×g離心力下離心15 min,將沉淀重新懸浮于蒸餾水中,調(diào)節(jié)pH為7。使用冷凍干燥機將懸浮液干燥,采用凱氏定氮法測定蛋白含量(GB/T 5009.5-2003)。所提取的大米蛋白保存在干燥皿中待用。

1.2.2酶解參數(shù)的單因素篩選用堿性蛋白酶對底物蛋白進行酶解,根據(jù)Li[14]等的研究略作修改,初始設(shè)定酶解參數(shù)條件為底物濃度30 g/L、加酶量7.5%、酶解時間60 min、溫度50 ℃、pH8.5,采用單因素逐級優(yōu)化法,以ACE抑制率為主要指標,篩選底物濃度參數(shù),確定最優(yōu)底物濃度后同樣的方法依次篩選加酶量、溫度、pH、時間。

1.2.2.1不同底物濃度對ACE抑制率的影響分別將12 g大米蛋白加入600、400、300、240和200 mL蒸餾水中配成濃度分別為20、30、40、50和60 g/L蛋白溶液,實驗條件采用反應(yīng)溫度50 ℃,加酶量為7.5%(E/S),pH8.5,酶解時間60 min。在酶解過程中不斷滴加1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH,記錄消耗的堿量并計算DH,酶解結(jié)束后,沸水浴滅酶10 min,然后在5000 r/min離心10 min,取上清液稀釋50倍檢測ACE抑制率。

1.2.2.2不同加酶量對ACE抑制率的影響實驗條件采用底物濃度30 g/L,反應(yīng)溫度50 ℃,維持pH為8.5,酶解時間60 min,按照設(shè)定的加酶量4.5%(E/S)、6%(E/S)、7.5%(E/S)、9%(E/S)、10.5%(E/S),分別加入5.4、7.2、9.0、10.8和12.6 mL堿性蛋白酶,后續(xù)酶解操作同1.2.2.1。

1.2.2.3不同溫度對ACE抑制率的影響實驗條件采用底物濃度30 g/L,加酶量7.5%(E/S),維持 pH為8.5,酶解時間60 min,溫度分別設(shè)為40、45、50、55和60 ℃,進行實驗,后續(xù)酶解操作同1.2.2.1。

1.2.2.4不同pH對ACE抑制率的影響實驗條件采用底物濃度30 g/L,加酶量7.5%(E/S),反應(yīng)溫度50 ℃,酶解時間60 min,pH分別維持在7.5、8、8.5、9、9.5進行實驗。后續(xù)酶解操作同1.2.2.1。

1.2.2.5不同時間對ACE抑制率的影響實驗條件采用底物濃度30 g/L,加酶量7.5%(E/S),反應(yīng)溫度50 ℃,維持 pH為8.5,酶解時間分別設(shè)為30、45、60、75和90 min進行實驗。后續(xù)酶解操作同1.2.2.1。

1.2.3超聲參數(shù)的篩選實驗使用自主研發(fā)的逆流超聲波設(shè)備在大米蛋白酶解前進行超聲預(yù)處理,設(shè)備示意圖見圖1,以傳統(tǒng)超聲設(shè)備(JY98-IIIDN超聲細胞粉碎機)作為對照。初步設(shè)定逆流超聲設(shè)備和傳統(tǒng)超聲設(shè)備超聲參數(shù)為頻率20 kHz、功率密度80 W/L、時間10 min,采用單因素逐級優(yōu)化法,以ACE抑制率為主要指標,篩選最優(yōu)超聲頻率、功率密度和超聲時間。

1.2.3.1對傳統(tǒng)超聲參數(shù)進行篩選因傳統(tǒng)超聲無法調(diào)整超聲頻率,故對超聲功率密度及超聲時間進行篩選。分別設(shè)定超聲功率密度為80、110、140、170、200 W/L,超聲時間10 min對大米蛋白進行超聲預(yù)處理,酶解實驗按上述最優(yōu)酶解參數(shù)進行,酶解結(jié)束后操作同1.2.2.1中的后續(xù)處理。取200 W/L超聲功率密度,設(shè)定超聲時間為5、7.5、10、12.5、15 min進行超聲預(yù)處理,酶解實驗按上述最優(yōu)酶解參數(shù)進行,酶解結(jié)束后操作同1.2.2.1中的后續(xù)處理。

1.2.3.2對逆流式超聲參數(shù)進行篩選設(shè)定超聲頻率為20、28、35、40、50 kHz,超聲功率密度80 W/L,超聲時間10 min,得到的酶解液后續(xù)操作同傳統(tǒng)超聲。采用篩選的20 kHz超聲頻率進行超聲功率密度篩選,設(shè)定為80、110、140、170、200 W/L進行超聲預(yù)處理,得到的酶解液后續(xù)操作同傳統(tǒng)超聲。取篩選的20kHz超聲頻率、170 W/L功率密度,對超聲時間進行篩選,設(shè)定為5、7.5、10、12.5、15 min進行超聲預(yù)處理,得到的酶解液后續(xù)操作同傳統(tǒng)超聲。

1.2.4大米蛋白水解度的測定方法采用pH-Stat法[15]測定蛋白水解度,計算公式如下:

式中:h-被裂解的肽鍵數(shù);htot-為常數(shù),即每個底物中蛋白中含有的肽鍵總數(shù),大米蛋白為7.72 mmol/g;B-消耗的堿液的體積(mL);N-堿液的摩爾濃度(mol/L);α-大米蛋白的平均解離度,此處為0.969;m-底物中蛋白質(zhì)總含量(g)。

式中,R為酶解液對ACE的抑制率(%);A為空白對照組中馬尿酸的峰面積(mAU·s);B為添加酶解液組中馬尿酸的峰面積(mAU·s)。

1.3　數(shù)據(jù)分析

2　結(jié)果與分析

2.1　蛋白的提取

原料米渣(蛋白含量56.1%)經(jīng)堿溶酸沉法提取出大米蛋白,經(jīng)凱氏定氮法測定得到蛋白含量為81.57%。

2.2　不同酶解參數(shù)對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響

2.2.1底物濃度對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率從圖2可以看出大米蛋白的DH及酶解物ACE抑制率隨底物濃度增加均呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢,當?shù)孜餄舛葹?0 g/L時,ACE抑制率達到最高,而后酶解物ACE抑制率隨著底物濃度的增加而降低,原因可能類似于楊曉軍[17]酶解斑點叉尾鮰內(nèi)臟制ACE抑制肽中所述底物濃度過高,導致酶解體系過于黏稠,減小了酶與底物結(jié)合的機率,從而導致ACE抑制率降低。結(jié)果表明,底物濃度為20 g/L和30 g/L時ACE抑制率無顯著差異(p>0.05),30 g/L的底物濃度DH更高,多肽得率高,選擇底物濃度為30 g/L進行后續(xù)實驗。

圖2　底物濃度對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響Fig.2　Effect of substrate concentration on the DH and the ACE inhibitory rate of rice protein hydrolysate注:圖中條形柱上的不同大、小寫字母表示不同處理間差異顯著(p<0.05),圖3～圖11同。

2.2.2加酶量對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響從圖3可以看出酶解液的DH和ACE抑制率變化趨勢一致,在加酶量為7.5%時,其酶解液的ACE抑制活性開始趨于平緩,是因為當加酶量為7.5%時,酶相對于底物來說處于飽和狀態(tài)。加酶量為7.5%、9%、10.5%時ACE抑制率與DH的差異均不顯著(p>0.05)。為了節(jié)約成本,選擇加酶量為7.5%進行后續(xù)實驗。

圖3　加酶量對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響Fig.3　Effect of enzyme dosage on the DH and the ACE inhibitory rate of rice protein hydrolysate

2.2.3溫度對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響由圖4可以看出隨酶解溫度升高,ACE抑制率與DH均呈現(xiàn)先升高后趨于平穩(wěn)的趨勢,這是因為堿性蛋白酶酶活隨溫度升高而變強[18],達到50 ℃后酶活保持穩(wěn)定,隨后50、55、60 ℃時ACE抑制率與DH之間沒有顯著差異(p>0.05),為了減少能耗,選擇酶解溫度為50 ℃進行后續(xù)實驗。

圖4　溫度對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響Fig.4　Effect of temperature on the DH and the ACE inhibitory rate of rice protein hydrolysate

2.2.4pH對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響圖5表明,pH的變化使酶解液ACE抑制率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,這是由于隨pH接近酶的最適pH8.5～9.0時,酶的催化效率變高,當超過最適pH時,酶的分子結(jié)構(gòu)開始改變,催化活性降低,張艷萍等[19]研究的貽貝ACE抑制活性肽也表現(xiàn)出這種趨勢。pH為8.5與9.0時ACE抑制率無明顯差異(p>0.05),為了降低加堿量,選擇pH為8.5進行后續(xù)實驗。

圖5　pH對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響Fig.5　Effect of pH on the DH and the ACE inhibitory rate of rice protein hydrolysate

2.2.5酶解時間對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響圖6中可以發(fā)現(xiàn),大米蛋白的DH及酶解液ACE抑制率隨著酶解時間的增加先上升后趨于穩(wěn)定。酶解液的ACE抑制率在60 min時達到最大值。原因可能是隨著酶解時間增加，生成新的具有降血壓活性的多肽，使ACE抑制率升高的同時，部分具有降血壓特性的肽鏈裂解，失去生物活性，使酶解產(chǎn)物的ACE活性降低[20]，兩種同時作用使ACE抑制率趨于平穩(wěn)，與姚成虎[20]結(jié)論不同，可能是因為酶解時間不夠長，仍有底物與酶反應(yīng)生成新的具有ACE抑制活性的肽鏈。酶解時間為60、75、90 min時的酶解液ACE抑制率無明顯差異(p>0.05),60 min與75 min時的DH無明顯差異(p>0.05),為提高實驗效率,選擇酶解時間為60 min,此時大米蛋白酶解液ACE抑制率為45.59%,水解度為21.49%。

圖6　酶解時間對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響Fig.6　Effect of time on the DH and the ACE inhibitory rate of rice protein hydrolysate

2.3　超聲參數(shù)篩選

2.3.1傳統(tǒng)超聲功率密度對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響在已優(yōu)化的酶解參數(shù)基礎(chǔ)上對傳統(tǒng)聚能探頭式超聲波設(shè)備進行參數(shù)篩選,由于傳統(tǒng)聚能超聲探頭發(fā)生器無法調(diào)整超聲頻率,所以對功率密度與超聲時間進行篩選。超聲功率密度的篩選如圖7所示,DH與ACE抑制率隨著功率密度增加而增加,得到傳統(tǒng)超聲最佳參數(shù)為功率密度200 W/L。

圖7　傳統(tǒng)超聲功率密度對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響Fig.7　Effect of traditional ultrasonic power density on the DH and the ACE inhibitory rate of rice protein hydrolysate

2.3.2傳統(tǒng)超聲時間對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響傳統(tǒng)超聲時間的篩選如圖8,在15 min時ACE抑制率達到最大,選取最優(yōu)超聲時間為15 min。在此參數(shù)下酶解液DH為20.32%,ACE抑制率為64.87%。

圖8　傳統(tǒng)超聲時間對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響Fig.8　Effect of traditional ultrasound time on the DH and the ACE inhibitory rate of rice protein hydrolysate

2.3.3逆流超聲頻率對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響同樣的,在已優(yōu)化的酶解參數(shù)基礎(chǔ)上,用不同頻率超聲預(yù)處理后大米蛋白酶解液的DH與ACE抑制率如圖9所示,在20 kHz超聲頻率下ACE抑制率最高為64.02%,與未超聲的空白組ACE抑制率相比提高了39.51%。35 kHz時水解度較大,其余超聲頻率DH差異不明顯,與其他組ACE抑制率有較大的區(qū)別,可能是因為超聲作用,使得蛋白酶優(yōu)先酶解暴露蛋白表面的疏水性基團,使含有疏水氨基酸的肽增多[20],而含有疏水氨基酸的肽通常具有較高的ACE抑制率[21],在超聲頻率為20 kHz時這種現(xiàn)象最明顯,選取20 kHz作為最優(yōu)超聲頻率。

圖9　逆流超聲頻率對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響Fig.9　Effect of countercurrent ultrasonic frequency on the DH and the ACE inhibitory rate of rice protein hydrolysate

2.3.4逆流超聲功率密度對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響如圖10所示,隨超聲功率密度升高,酶解液ACE抑制率與DH均呈先上升后下降趨勢,在170 W/L進行預(yù)處理后ACE抑制率到達70.39%,可能是因為隨超聲功率密度升高,超聲形成的空化泡破裂時釋放的能量更強,擊破蛋白顆粒,使蛋白酶切位點更多的暴露出來,DH增加,形成了更多的ACE抑制肽,ACE抑制率上升,這與金建[22]等的研究具有一致性。隨后ACE抑制率與DH下降,原因可能是過高的功率密度產(chǎn)生過高的能量,暴露的疏水基團相互作用,使蛋白分子重新自組裝聚集[22]。以最高ACE抑制率為指標選取最佳超聲功率密度為170 W/L。

圖10　逆流超聲功率密度對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響Fig.10　Effect of countercurrent ultrasound power density on the DH and the ACE inhibitory rate of rice protein hydrolysate

2.3.5逆流超聲時間對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響從圖11中可以看出隨超聲時間的增加,ACE抑制率呈現(xiàn)先上升后下降狀態(tài),DH呈現(xiàn)一直上升狀態(tài),可能是因為超聲時間延長,蛋白分子更多的展開,酶切位點暴露出來,水解度也隨之增大,產(chǎn)生的具有ACE抑制的肽也增多,超聲時間繼續(xù)增加后ACE抑制率下降,這可能與超聲功率密度過大導致的情況類似,是因為超聲時間過長,已展開的蛋白分子發(fā)生折疊聚集[23],這與耿靜靜[24]所得結(jié)果相似。根據(jù)ACE抑制率的大小選取12.5 min為最優(yōu)超聲時間。

圖11　逆流超聲時間對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響Fig.11　Effect of countercurrent ultrasound time on the DH and the ACE inhibitory rate of rice protein hydrolysate

使用自主研發(fā)的逆流式超聲波儀器篩選出的超聲最優(yōu)參數(shù)為:超聲頻率為20 kHz,功率密度為170 W/L,處理時間為12.5 min,在此參數(shù)下大米蛋白酶解液ACE抑制率為72.24%,相較于未超聲提高了57.42%。相較于傳統(tǒng)超聲設(shè)備固定的超聲頻率,本實驗所用逆流超聲設(shè)備擁有20、28、35、40、50 kHz可供篩選,需要超聲功率密為170 W/L低于傳統(tǒng)超聲設(shè)備所需的200 W/L,超聲時間為12.5 min低于傳統(tǒng)超聲所需的15 min,設(shè)備效率高,能耗低,產(chǎn)物ACE抑制率相較于傳統(tǒng)超聲設(shè)備提高了11.36%?？赡苁且驗槟媪餮h(huán)系統(tǒng),使整體待處理液充分受到超聲波作用,能夠克服超聲不均勻的問題,為其工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。

3　結(jié)論

通過單因素逐級優(yōu)化法確定了大米蛋白的最佳酶解參數(shù)為底物濃度30 g/L、加酶量7.5%(E/S)、溫度50 ℃、pH8.5、酶解時間60 min。在此條件下,大米蛋白酶解液ACE抑制率為45.59%，DH為21.49%。

在最優(yōu)酶解參數(shù)的基礎(chǔ)上,篩選出傳統(tǒng)超聲設(shè)備最佳參數(shù)為:功率密度200 W/L,超聲時間15 min,在此參數(shù)下超聲波預(yù)處理酶解液的ACE抑制率為64.87%。篩選出自主研發(fā)逆流式超聲設(shè)備參數(shù)為:超聲頻率20 kHz,功率密度170 W/L,處理時間12.5 min。在此參數(shù)下超聲預(yù)處理得到大米蛋白酶解液ACE抑制率為72.24%,DH為21.64%相較于未超聲時提高了57.42%,相較于傳統(tǒng)超聲設(shè)備ACE抑制率提高了11.36%。

本研究所用逆流超聲波設(shè)備預(yù)處理與傳統(tǒng)超聲設(shè)備相比需要的超聲功率密更小,時間更短,酶解液ACE抑制率更高,說明逆流超聲設(shè)備在輔助酶解制備大米ACE抑制肽的研究中能有效提高酶解效率,減少能耗,提高酶解制備的ACE抑制肽的活性。

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