藍莓花色苷抗氧化功能及穩(wěn)定性研究進展

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(重慶市中藥研究院,重慶 400065)

藍莓為杜鵑花科越橘屬多年生落葉或常綠灌木,富含花色苷、酚酸和類黃酮等多種活性物質,被聯合國糧農組織(FAO)列為人類五大健康食品之一。藍莓花色苷是花青素和糖以糖苷鍵結合而成的黃酮多酚類化合物[1]。花色苷具有未配對電子,是氫的供體,能有效清除多種活性氧自由基。國內外研究表明,花色苷具有廣泛的藥理作用,如促進視紅素再生、抗炎、提高免疫力、抗氧化、延緩衰老、抗腫瘤等多種生理活性[2-3]。其中抗氧化功能越來越受到研究人員的重視。Hua Li等[4]的研究表明,包括藍莓在內的5種不同漿果中均富含花青素和酚酸,具有強效的抗氧化、抗炎活性。常用的人工合成抗氧化劑如BHA(丁基羥基茴香醚)、BHT(二丁基羥基甲苯)和PG(沒食子酸丙酯),已被證實對人體有毒副作用。目前國內外都在積極研究天然高效的抗氧化劑。但藍莓花色苷抗氧化功能的研究大多停留在粗提取物及體外實驗,且花色苷抗氧化機制的研究也較少,加之花色苷極不穩(wěn)定,要甄別出高效穩(wěn)定的花色苷難度較大。本文主要對藍莓花色苷的有關研究進行綜述,以期為藍莓花色苷的進一步研究和開發(fā)利用提供參考。

1　藍莓花色苷的結構與分類

花色苷是花青素與糖苷形式結合的化合物?；ㄇ嗨?anthocyanidin)的結構母核為2-苯基苯并吡喃陽離子,屬于黃酮類化合物,其結構中存在2個苯環(huán),形成共軛體系,故在紫外光區(qū)與可見光區(qū)(520～545 nm,275～285 nm)均由較強的吸收,結構如圖1所示?，F已知的花青素有20多種,主要存在于植物中的有天竺葵色素(Pelargonidin,Pg)、矢車菊色素或芙蓉花色素(Cyanidin,Cn)、翠雀素或飛燕草色素(Delphindin,Dp)、芍藥色素(Peonidin,Pn)、牽?；ㄉ?Petunidin,Pt)及錦葵色素(Malvidin,Mv),除此之外還有芹菜素(Apigeninidin,Ap)。自然條件下游離狀態(tài)的花青素極少見,花青素常與一個或多個葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖在C3、C5、C7、C3′、C5′位以糖苷鍵相連形成花色苷,C3位是最常見的結合點,少數在C7位。花色苷分子含有極性基團,易溶于水、乙醇等極性溶劑。

表1　常見的花青素與花色苷的結構Table 1　Strucral identification of most common anthocyanidins and anthocyanins

圖1　花青素的結構式Fig.1　General anthocyanidins structure

通常認為花色苷B環(huán)的結構對其穩(wěn)定性影響很大,B環(huán)羥基化會導致花色苷體內降解為酚酸和乙醛,穩(wěn)定性降低;B環(huán)甲氧基化能阻止有色的花色苷水化成無色的假堿,使得花色苷的穩(wěn)定性升高;B環(huán)?；侵阜枷阕搴椭咀寤衔锱c花青素C3結合形成較長的支鏈,避免了C2位受到親核分子的攻擊,C4位的取代基團也會加強其穩(wěn)定性[5-7]。目前已知的天然花色苷有635種。藍莓主要的花色苷為飛燕草色素、矢車菊色素、芍藥色素、牽牛色素和錦葵色素[8]。花色苷的通式如圖2所示,常見的花青素與花色苷的結構詳見表1。藍莓的品種繁多,抗氧化能力有一定的差異[9-10]。李穎暢等[11]的研究發(fā)現,從圣云藍莓花色苷分離出的3種花色苷在抗脂質體過氧化、還原力、清除羥自由基能力、清除DPPH自由基能力有顯著差異。

圖2　花色苷結構通式Fig.2　General structure of anthocyanins

2　藍莓花色苷的抗氧化能力測定方法

體外測定法包括基于電子轉移的方法(SET)和基于H原子轉移的方法(HAT)。SET主要是測定抗氧化物質維持氧化還原狀態(tài)的能力,方法有二苯基苦苯肼自由基清除能力檢測(2,2′-diphenyl-picrylhydrazyl radical,DPPH)、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(2,2-Azinobis-(3-ethylbenzthiazo-line-6-sulphonate),ABTS)清除能力檢測法、三價鐵還原抗氧化劑的能力(ferric reducing anti-oxidant power,FRAP)等。HAT包括了氧化自由基吸收能力(Oxygen Radical Absorption Capacity,ORAC)、硫代巴比妥酸反應物法(Thiobarbituric Acid Reactive Substance Assay,TBARS)測定脂質過氧化物顯色、總自由基清除抗氧化能力法(total radical-trapping antioxidative capacity,TRAP)等。王曉宇等[12]認為不同的測定法各有利弊,任何一種方法都僅測定了抗氧化能力的某一方面,而且不能模擬生理環(huán)境下的多條抗氧化途徑。李敏等[8]測定不同花青素的抗氧化活性時發(fā)現的DPPH、FRAP結果一致,ORAC結果有所不同。

體內測定方法主要包括人體和動物實驗以及細胞抗氧化實驗。人體和動物實驗是通過測定血清中的MDA、SOD、GSH-Px酶活性以及TAOC等來反應抗氧化能力。張名位等[13]證明ox-LDL能明顯抑制內皮細胞活力,并呈濃度依賴關系,且不同花色苷對內皮細胞活力、MDA生成和NO釋放差異顯著。體內測定方法可以一定程度反應抗氧化物的活性,但鄭影等[14]在藍莓花色苷在體外和模擬人體胃腸環(huán)境的抗氧化活性研究中發(fā)現,在模擬人體胃腸環(huán)境中的吸收利用率很低,在腸液中的活性還不到原來的一半。Hussein M Ali測定了不同種花色苷的DPPH、ABTS+、羥自由基、FRAP的清除率以及相應Trolox當量值,數值越大則表明抗氧化活性越強,見表2[15]。

表2　某些花青素與花色苷的抗氧化及清除自由基能力Table 2　Radical scavenging activities and reducing power of anthocyanidins and anthocyanins

注：a:反應物的最終濃度,例如DPPH自由基清除率(%)(30.0 μmol/L)表明是在DPPH最終濃度為30.0 μmol/L的條件下測得,其余同;b:TEDPPH是指以Trolox標準液的總抗氧化能力為1,相同濃度情況下,其它物質的抗氧化能力用其抗氧化能力和Trolox相比的倍數來表示,其余同。

3　藍莓花色苷的抗氧化功能

藍莓中的抗氧化物質包括可溶性多糖、維生素C、還原性谷胱甘肽、總花色苷。其中總花色苷含量與DPPH自由基清除能力的相關性最強,說明藍莓果實中總花色苷是抗氧化作用的重要部分[16]。藍莓花色苷抗氧化作用體現在抑制脂質過氧化[17]、提高體內抗氧化酶類活性[18]、供電子還原自由基等方面。

3.1　抗氧化功能的構效關系

3.1.1B環(huán)上羥基的數目和位置大量研究表明黃酮類化合物B環(huán)上羥基的位置和數量極大地影響了其清除自由基的強度。花色苷提供氫離子與自由基還原后,其本身會形成新的自由基,新自由基穩(wěn)定性越強則說明抗氧化能力越強。B環(huán)上的鄰二羥基位置能與自由基形成穩(wěn)定的共軛半醌式自由基,共軛半醌式自由基的電子云均勻分布降低了其分子內能,對二羥基與間二羥基無法與自由基形成鄰苯醌的結構。更重要的是B環(huán)半醌式自由基與鄰位羥基形成了分子內氫鍵導致苯氧自由基的穩(wěn)定性大大增加。在藍莓中普遍存在的花色苷的結構式中,可以看到其B環(huán)上存在大量羥基,尤其以C3′-C4′鄰二羥基的活性最強。飛燕草花色苷的C3′、C4′、C5′均為羥基,與Long Y等[19]得出的飛燕草和飛燕草-3-葡萄糖苷在21種花色苷中對ox-LDL所致血管內皮損傷的保護作用效果最好的結論相一致。B環(huán)上的羥基主要起到直接清除自由基的作用,除此之外,C3-OH、C5-OH、C2′-OH、C7-OH也能夠有效消除自由基[20-21]。B環(huán)的鄰3′、4′二羥基能以氧負離子的形式與脂質過氧化鏈中的金屬離子形成五元環(huán)螯合物,抑制脂質過氧化的發(fā)生。

3.1.2C環(huán)與A環(huán)的作用在黃酮類化合物通式中,C4位為羰基主要與鄰位羥基絡合金屬離子抑制脂質過氧化反應,還存在C2和C3之間的雙鍵結構,主要起著延長A、B環(huán)的共軛體系,提高結構穩(wěn)定性。在花色苷中沒有C4位的羰基,也沒有C2和C3之間的雙鍵結構,而在C3與C4中間是不飽和氫鍵,這使得C環(huán)表現為吸電子效應。在黃酮類化合物中A、C環(huán)的平面夾角為26°左右,尤其是擁有色原酮的結構中C環(huán)對A環(huán)的影響更大,會弱化A環(huán)中的酚羥基活性。不飽和C環(huán)延長了A、B的共軛體系,使苯氧自由基更加穩(wěn)定。C環(huán)中的C3-OH同樣能夠提供氫與氧自由基反應。藍莓主要的花色苷A環(huán)中在C5、C7均有羥基,Olenikov等[22]的研究表明A環(huán)中C5-OH、C7-OH與未被羥基基團取代的黃酮化合物相比,表現出很有效的螯合Fe2+能力。

3.2　抗氧化作用機制

3.2.2對酶的作用催化體內產生自由基的氧化酶包括NADPH氧化酶(NOX)、脂氧合酶(LOX)、醛氧化酶(AO)、黃嘌呤氧化酶(OX)等。經研究發(fā)現飛燕草素(Dp)、矢車菊素(Cy)、芍藥花青素(Pn)、錦葵色素(Mv)及它們的糖苷對LOX-1和5-LOX的抑制作用,結果發(fā)現翠雀素葡萄糖苷和飛燕草半乳糖苷能夠顯著抑制LOX-1和5-LOX,對LOX-1的作用強于對5-LOX[25];林歡等[26]用Western蛋白免疫印跡法證實花色苷能抑制Bax和半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3的表達,降低胞內ROS。另一方面藍莓花色苷能夠提高抗氧化酶的活性,Shih等[27]發(fā)現矢車菊素、飛燕草色素、錦葵色素不僅可以激活Nrf2作用于ARE,誘導Ⅱ相抗氧化蛋白谷胱甘肽還原酶、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)、醌氧化還原酶1(NQ01)等的表達從而抑制半胱天冬酶-3(Caspase-3)的活性,而且能抑制LPS,通過作用 PI3K和 MAPKS途徑,抑制前列腺素E(PGE2)和NO的產生。李穎暢等[20]在藍莓對實驗高血脂癥大鼠影響的研究中發(fā)現,高劑量花色苷組高脂血癥大鼠血脂水平和動脈粥硬化指數(AI)均有顯著降低,血清和肝臟T-ACO和SOD、GSH-Px活性明顯增加,MDA的生成量顯著減少。

4　影響藍莓花色苷穩(wěn)定性的部分因素

4.1　光照、pH、溫度

光對花色苷的影響是兩方面的,首先是花色苷生物合成的重要因子,但同時光會加速花色苷的降解[29]?；ㄉ赵谧匀还庵鄙湎峦噬?在避光條件下褪色慢[30-32]。方忠祥等[33]研究表明,光可加速紫薯花色苷降解。

花色苷隨溶液中pH的變化而發(fā)生結構上的轉化,在pH<2時,花色苷主要以紅色的花色烊陽離子形式存在;pH在3～6時,花色苷主要以無色的甲醇假堿和查爾酮假堿的形式存在,在中性或者微酸環(huán)境下花色苷以紫色或淺紫色中性的醌式堿的形式存在,pH6～7時,形成紫色或藍色的共振穩(wěn)定的醌類陰離子[34]。Diego Luna-Vital等[26]研究玉米花青素的穩(wěn)定性時,運用第一反應動力學計算發(fā)現pH<5時,隨著pH的增加,花青素半衰期預測值明顯降低,pH>5時，由于色度不成線性所以無法計算半衰期?；ㄉ罩荒茉谒嵝詶l件下才能保持穩(wěn)定[35-38]。

溫度升高能加速花色苷的降解,其熱解過程符合動力學方程,在50、70、90 ℃降解速率常數k分別為0.0263、0.0864、0.3604 h-1,熱降解活化能Ea63.61 kJ·mol-1[39]?；ㄉ盏臒岱€(wěn)定性與其結構、pH等因素有關?；ㄉ赵跍囟壬邥r,向著無色的查爾酮和甲醇假堿形式轉化,當冷卻和酸化時,醌式堿和甲醇假堿還可轉化變成紅色的花色烊陽離子形式。陸卿卿[22]認為在60 ℃以下花色苷的穩(wěn)定性較好,加熱4 h后,其花色苷的殘留率達80%以上。Kechinski等[40]研究表明,藍莓花青素在40 ℃下更穩(wěn)定,在80 ℃時的損失速率是40 ℃時的36倍。李文安[37]對pH、溫度、時間三因素進行三水平正交實驗得出花色苷最穩(wěn)定的條件是pH3.0,溫度4 ℃,時間1.5 h。

4.2　金屬離子

金屬離子對花色苷有輔助顯色的效果,不同的金屬離子對不同種類的花色苷作用效果不同。李穎暢等[41]研究發(fā)現K+、Ca2+、Cu2+、Al3+對藍莓花色苷的穩(wěn)定性無顯著差異,Mn2+、Na+、Zn2+可以提高其穩(wěn)定性,Fe2+、Fe3+、Pb2+則會引起花色苷的穩(wěn)定性下降。田密霞等[23]對比研究發(fā)現相同金屬離子(Ca2+、Cu2+、Zn2+、Na+、Mg2+、Fe3+)對兩種不同品種的藍莓穩(wěn)定性影響不同,其中Fe3+影響最為顯著,兩種藍莓花色苷均因金屬離子影響穩(wěn)定性下降。李文安[37]研究發(fā)現Fe3+、Cu2+對花色苷穩(wěn)定性影響較大。

4.3　提取條件

藍莓花色苷的不同提取方式對花色苷的穩(wěn)定性影響很大。在楊磊等[42]的研究中,對藍莓勻漿提取過程中的各因素采用Plackett Burman和Box-Behnken實驗設計進行優(yōu)化,得到藍莓花色苷的最佳提取工藝條件是pH2.5、乙醇體積75%、料液比1∶17 (g·mL-1)、提取時間20 s、提取次數1 次,在此條件下提取的總花色苷抗氧化活性最高。但在申芮萌等[43]在單因素實驗的基礎上,通過響應面實驗,優(yōu)化后得到的最佳工藝參數是料液比1∶8 (g·mL-1),甲醇體積分數63%,超聲功率450 W,超聲時間50 min?；ㄉ盏奶崛」に嚊]有固定的標準,在摸索中有不同的提取條件。劉晨等[44]表明藍莓酒渣花色苷的最佳提取條件為超聲時間50 min、液料比33∶1 (mL/g)、提取溫度65 ℃,這與陳云霞等[45]的研究結論不同。劉樹勛等[46]表明蒸餾處理會顯著影響野生藍莓皮酒渣的總酚和花色苷總量。黃曉杰等[47]表明通過水楊酸處理藍莓果實,能有助于保存總酚和花色苷的含量,增強抗氧化作用。

4.4　氧化劑、還原劑

藍莓在加工過程中常會使用到O3和 H2O2作為食品殺菌劑,但殘留濃度的增加會引起花色苷發(fā)生降解。因為O3和 H2O2會生成自由基類物質,花色苷與其結合后反應生成酚類和醛類。氧化劑濃度升高,花色苷殘存率降低[23]。Na2SO3對藍莓花色苷存在一定的破壞作用。隨著時間的延長,藍莓花色苷的殘存率逐漸降低,且Na2SO3濃度越大,最終的殘存率也越低[23]。

4.5　其他

有機酸通常在花色苷的C3位糖上結合,形成更穩(wěn)定的?；ㄉ?。國內外均有關于酰基化提高花色苷穩(wěn)定性的報道。Yawadio R等[48]研究發(fā)現芥子酸、阿魏酸、P-香豆酸能起到對黑米汁進行顯色的作用。最新研究發(fā)現外源性脫落酸(ABA)處理可誘導的尿苷二磷酸葡萄糖類黃酮葡萄糖-玉米轉移酶,谷胱甘肽S-轉移酶4,O-甲基轉移酶和類黃酮3′,5′羥化酶表達,增加花旗子、馬鞭霉素花青素的總量[49]。

5　展望

目前藍莓花色苷抗氧化功能的研究大部分還停留于粗提取物或混合物以及體外實驗,甄別出高效穩(wěn)定的花色苷難度較大。對黃酮類化合物的抗氧化研究較多,但對花色苷抗氧化機制的研究較少,應進一步研究花色苷的抗氧化特異性構效關系,將研究方向從共性深入到特性。制約藍莓開發(fā)利用的主要因素是其花色苷極不穩(wěn)定,導致其提取以及純化率低。有資料顯示,添加酚類、黃酮類化合物以及微膠囊化可以延長花青素的穩(wěn)定性[50]。我國迄今尚未建立藍莓產品作為保健食品開發(fā)或抗氧化藥物生產的相關產品標準,導致市場上藍莓產品抗氧化能力參差不齊[51],因此應進一步研究藍莓花色苷的抗氧化作用機制和穩(wěn)定條件,建立產品生產標準,保證其結構的穩(wěn)定性和功能的有效性。

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