南極磷蝦微生物復(fù)合發(fā)酵制備呈味基料的工藝優(yōu)化

章雪琴，吉宏武,2,3,4*，張迪，段偉文，劉書成,2,3,4

1(廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，廣東 湛江，524088) 2(廣東省水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江，524088) 3(廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江，524088)4(廣東省普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江，524088)

南極磷蝦(Euphausiasuperba)又稱南極大磷蝦，是一種生活在南極洲水域的海洋浮游甲殼類生物，資源豐富，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球資源總量至少有6.5～10億噸[1]。此外，南極磷蝦的降解產(chǎn)物含有豐富的游離氨基酸、肽類、核苷酸等物質(zhì)[2]，既具有營養(yǎng)保健功能又是良好的呈味物質(zhì)。其富含的氨基酸包含人體所需的全部必需氨基酸，有些還具有很好的呈味效果，比如帶有甜味的甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸、丙氨酸，帶有鮮味的天冬氨酸、谷氨酸等，還含有一些既能提供鮮味又可以調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能的短肽，既是天然的鮮味成分，又具有良好保健作用的核苷酸、肌苷酸、鳥苷酸等物質(zhì)[3]。因此南極磷蝦是制備功能性天然海鮮調(diào)味料的理想原料。

微生物發(fā)酵法是一種制備調(diào)味料的方法，廣泛用于味精、醬油、醋等調(diào)味品的制備，在改善香腸、魚露、泡菜風(fēng)味等方面也有重要作用。用于食品發(fā)酵的微生物種類繁多，多采用混合發(fā)酵的方式，可以有效地去腥脫苦，改善風(fēng)味，縮短發(fā)酵時(shí)間，彌補(bǔ)單一菌種發(fā)酵的缺陷[4-6]。NURMI[7]發(fā)現(xiàn)在生產(chǎn)香腸的過程中，使用乳酸桿菌和微球菌混合發(fā)酵與單一菌種發(fā)酵相比，不僅產(chǎn)酸更快而且明顯縮短了發(fā)酵時(shí)間，提高了風(fēng)味質(zhì)量。此后，混合菌種發(fā)酵劑的使用得到快速的發(fā)展。NATTEEWAN UDOMSIL[8]利用TetragenococcushalophilusMS33和Virgibacillussp. SK37兩種菌進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵，縮短了魚露的發(fā)酵時(shí)間，提高了氨基酸含量，減少胺類物質(zhì)的生成，提高了產(chǎn)品的整體接受性。孟凌玉[9]以木糖葡萄球菌、戊糖片球菌、枯草桿菌對(duì)蝦的酶解液進(jìn)行混合發(fā)酵，所得產(chǎn)品發(fā)酵程度高，發(fā)酵液蝦味明顯，彌補(bǔ)了單一菌種發(fā)酵的不足，但是發(fā)酵周期較長，香味不夠濃郁。本研究在此基礎(chǔ)上引入了植物乳酸桿菌和魯氏酵母菌，直接鹽漬后進(jìn)行半固體發(fā)酵。植物乳酸桿菌是發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌，分解糖產(chǎn)生乳酸，可降低發(fā)酵產(chǎn)物的pH值，抑制大多數(shù)腐敗菌及致病菌的生長，而魯氏酵母是典型的產(chǎn)香型菌株，其產(chǎn)生的乙醇與植物乳酸桿菌產(chǎn)生的乳酸作用生成酯類，可顯著提高產(chǎn)品的香氣指數(shù)[10]，所得產(chǎn)品的風(fēng)味更好。

本實(shí)驗(yàn)采用模糊數(shù)學(xué)綜合評(píng)價(jià)結(jié)合響應(yīng)面分析的方法，優(yōu)化南極磷蝦復(fù)合發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)，開發(fā)一種既營養(yǎng)又美味的天然海鮮調(diào)味料，促進(jìn)南極磷蝦的進(jìn)一步利用。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

南極磷蝦(Euphausiasuperba)：2017年5月購自中國水產(chǎn)有限公司，-40 ℃凍藏；風(fēng)味蛋白酶：南寧龐博生物工程有限公司；木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus，菌種編號(hào)GIMI.895)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum，菌種編號(hào)GIMI.191)和魯氏酵母菌(Saccharomycesrouxii，菌種編號(hào)AS2.180))：中國科學(xué)院菌種保藏中心；MRS培養(yǎng)基 、營養(yǎng)瓊脂(NA)、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

PHST-3F 型酸度計(jì)，上海雷磁儀廠; GL-10LND 型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠; LDZX-50KBS 型立式蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；HZQ-X100全溫振蕩培養(yǎng)箱，蘇州市培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1測定方法

氨基酸態(tài)氮：采用甲醛滴定法 (GB 5009.235—2016)。

1.2.2工藝流程

南極磷蝦→切碎→腌制→打漿→發(fā)酵→酶解→滅酶→成品

1.2.3操作要點(diǎn)

南極磷蝦實(shí)驗(yàn)用量為100 g，解凍后切碎；加7%食鹽腌制2 h；加1倍水打漿；發(fā)酵完成后按0.1%的比例加入風(fēng)味蛋白酶，50 ℃酶解3 h，滅酶，取上清液，備用。

1.2.4制備菌液

首先將木糖葡萄球菌、植物乳酸桿菌、魯氏酵母菌分別接種到營養(yǎng)瓊脂、MRS培養(yǎng)基、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基中活化2次，然后在液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，木糖葡萄球菌、植物乳酸桿菌菌液在振蕩培養(yǎng)箱中以80 r/min、37℃培養(yǎng)24 h，魯氏酵母菌菌液以100 r/min、28 ℃培養(yǎng)48h。最后4 ℃ 3 500 r/min 離心15 min 收集菌體，重懸在 0.85 %無菌生理鹽水中，采用平板計(jì)數(shù)法調(diào)整菌懸液菌體濃度為108CFU/mL，備用。

1.2.5實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.5.1單因素實(shí)驗(yàn)

以感官評(píng)分和氨基態(tài)氮含量為指標(biāo)，首先確定菌種比例，然后初步篩選出影響發(fā)酵液品質(zhì)的發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量3個(gè)主要因素的最佳條件。發(fā)酵時(shí)間：15、18、21、24、27 h, 控制發(fā)酵溫度30 ℃，接種量4%；發(fā)酵溫度：22、26、30、34、38 ℃，控制發(fā)酵時(shí)間21 h，接種量4%；接種量：1%、2%、3%、4%、5%、6%，控制發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時(shí)間21 h。

1.2.5.2響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)(未顯示)，以發(fā)酵溫度(A)、接種量(B)、發(fā)酵時(shí)間(C)為自變量，綜合感官評(píng)分為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)，試驗(yàn)因素和水平見表1。

表1　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素與水平編碼Table 1　Factors and levers of Box-Behnken test

1.2.5.3感官評(píng)定方法

參照IRENEUSZ BIALOBRZEWSKI[13]的方法, 由10位感官評(píng)定人員對(duì)樣品進(jìn)行打分。評(píng)定前，使每個(gè)評(píng)定員對(duì)樣品的蝦味、發(fā)酵味、異味、鮮味、口感有明確的了解。然后按感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)表(見表 2)進(jìn)行評(píng)分。

表2　南極磷蝦發(fā)酵液感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)表Table 2　Standard of sensory evaluation for Antarctic krill fermentation broth

1.2.6建立模糊數(shù)學(xué)模型

1.2.6.1確立因素集

因素集 U，影響被評(píng)判對(duì)象感官質(zhì)量的屬性或性能的集合。本實(shí)驗(yàn)以氣味(u1)、色澤(u2)、形態(tài)(u3)、滋味(u4)這4個(gè)感官評(píng)價(jià)指標(biāo)組成因素集,即U ={u1，u2，u3，u4}。

1.2.6.2確立評(píng)語集

評(píng)語集 V，反映被評(píng)判對(duì)象質(zhì)量等級(jí)的集合。將南極磷蝦發(fā)酵液的感官質(zhì)量劃分為4個(gè)等級(jí)，即優(yōu)秀(v1)、良好(v2)、一般(v3)、較差(v4)，V={ v1，v2，v3，v4}，每個(gè)等級(jí)相對(duì)應(yīng)的分值見表2。

1.2.6.3確定質(zhì)量因素權(quán)重集

權(quán)重集 K，影響樣品質(zhì)量的各個(gè)因素在被評(píng)定因素中所處的地位即權(quán)重系數(shù)的集合，每個(gè)質(zhì)量因素對(duì)應(yīng)一個(gè)權(quán)重系數(shù)，本實(shí)驗(yàn)中 K={氣味 k1,色澤 k2,形態(tài) k3,滋味k4}，且 k1+ k2+ k3+ k4=1。

1.2.6.4確立模糊關(guān)系綜合評(píng)判集

對(duì)樣品的每個(gè)質(zhì)量因素進(jìn)行評(píng)價(jià)打分，統(tǒng)計(jì)各質(zhì)量因素在各等級(jí)中的票數(shù)，將各等級(jí)的票數(shù)除以總?cè)藬?shù)得到樣品的質(zhì)量評(píng)價(jià)模糊關(guān)系矩陣A。各樣品的模糊數(shù)學(xué)綜合評(píng)判集 Y = K × A。

1.3　數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)驗(yàn)3次，用 Origin 8.5、Microsoft Excel 2003 和Design Expert8.0.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2　結(jié)果與討論

2.1　發(fā)酵液質(zhì)量因素的權(quán)重分布情況

采用用戶調(diào)查法[12]，由10 名感官評(píng)價(jià)員對(duì)氣味、色澤、形態(tài)、滋味4個(gè)因素按重要程度打分，總分 10分。統(tǒng)計(jì)所有打分，將各因素的得分之和除以總分100分，即得各因素的權(quán)重因子。

由表3可知，對(duì)發(fā)酵液感官品質(zhì)按重要程度排序，即氣味>滋味>色澤>形態(tài)，K={氣味，色澤，形態(tài)，滋味}={0.39，0.185，0.155，0.27}。

表3　評(píng)價(jià)南極磷蝦發(fā)酵液風(fēng)味質(zhì)量因素的權(quán)重分布統(tǒng)計(jì)Table 3　Weight distribution and statistics of Antarctickrill fermentation broth’ quality factor

2.2　響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1模糊數(shù)學(xué)感官評(píng)定結(jié)果

10位感官評(píng)定人員分別對(duì)17組樣品的氣味、色澤、形態(tài)、滋味按評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。統(tǒng)計(jì)每個(gè)指標(biāo)在各等級(jí)中的票數(shù)，得出南極磷蝦復(fù)合發(fā)酵感官評(píng)定結(jié)果，見表4。

表4　不同發(fā)酵反應(yīng)條件下感官評(píng)定票數(shù)分布Table 4　Vote distribution of sensory evaluation of fermentation under different conditions

注: vl: 優(yōu)秀; v2: 良好; v3: —般; v4: 較差。

2.2.2模糊矩陣的建立及結(jié)果

以樣品1中的氣味指標(biāo)為例，從表4可知，有0人認(rèn)為樣品的氣味處于優(yōu)秀等級(jí)，有3人認(rèn)為其氣味良好，5人認(rèn)為氣味一般，2人認(rèn)為較差, 樣品1的氣味因素在各等級(jí)的評(píng)定人數(shù)除以總評(píng)定人數(shù)10，可得A氣味=[0，0.3，0.5，0.2]，同理A色澤=[0.1，0.5，0.3，0.1]。將影響感官評(píng)定的4個(gè)因素的評(píng)價(jià)結(jié)果轉(zhuǎn)化為模糊關(guān)系矩陣,可得：

2.2.3模糊變換及綜合評(píng)價(jià)結(jié)果

將權(quán)重集K乘以模糊關(guān)系矩陣A即可得到樣品的綜合評(píng)價(jià)結(jié)果Y。同樣以1號(hào)樣品為例。

同理可得另外16組樣品的綜合評(píng)價(jià)結(jié)果：

Y2=(0.4515，0.389，0.1595，0)；

Y3=(0.119，0.4915，0.3505，0.039)

Y4=(0.2665，0.402，0.2535，0.078)；

Y5=(0.253，0.4035，0.2775，0.066)

Y6=(0.208，0.435，0.213，0.144)；

Y7=(0.4035，0.4135，0.183，0)

Y8=(0.47，0.413，0.117，0) ；

Y9=(0.253，0.529，0.218，0)

Y10=(0.184，0.4845，0.2925，0.039)；

Y11=(0.2875，0.41，0.2755，0.027)

Y12=(0.185，0.5185，0.215，0.0815)；

Y13=(0.3785，0.4775，0.144，0)

Y14=(0.3125，0.3725，0.198，0.117) ；

Y15=(0.262，0.388，0.323，0.027)

Y16=(0.287，0.542，0.171，0)；

Y17=(0.253，0.5，0.247，0)

2.2.4Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

為了更好地比較各樣品之間的優(yōu)劣，防止信息缺失，將模糊向量單值化，便于綜合比較[13]。將優(yōu)秀、良好、一般、較差4 個(gè)等級(jí)按次序賦予 5、4，3、2分，將綜合評(píng)分結(jié)果中各個(gè)量分別乘以其相對(duì)應(yīng)的分值，其和作為每個(gè)產(chǎn)品的最終感官評(píng)定總分T，結(jié)果見表5。

2.2.4.1二次回歸擬合及方差分析

以感官評(píng)定總分為響應(yīng)值，使用Design Expert 8.0.5軟件對(duì)以上試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，確定南極磷蝦發(fā)酵液感官評(píng)定總分(Y)對(duì)發(fā)酵溫度(A)、發(fā)酵劑接種量(B)、發(fā)酵時(shí)間(C)的二次多元回歸方程，去除不顯著項(xiàng)，得到回歸方程：

Y=4.25+0.17A-0.074B+0.09C-0.16AC-0.34A2-0.25B2-0.01C2

表5　Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 5　Design and results of Box-Behnken

為了檢驗(yàn)該模型的可靠性和各因素對(duì)感官評(píng)分的影響，對(duì)回歸模型和回歸系數(shù)進(jìn)行方差分析。由表6可知，該模型極顯著(p<0.000 1)，失擬項(xiàng)不顯著(p=0.925 3>0.05)，說明此模型高度顯著可靠，未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾很小，擬合程度好；相關(guān)系數(shù)R2=0.974 6，說明模型響應(yīng)值即感官評(píng)分的變化97.46%來自所選因變量，試驗(yàn)誤差小，可以很好的反映感官評(píng)分與發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和接種量之間的關(guān)系[14]?；貧w方程各項(xiàng)方差分析表明，一次項(xiàng)A、C和交互項(xiàng)AC以及二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)感官評(píng)分影響極顯著，一次項(xiàng)B對(duì)感官評(píng)分影響顯著，說明各因素之間不是簡單的線性關(guān)系，而是呈二次關(guān)系，響應(yīng)值的變化比較復(fù)雜。由F值可知，各因素對(duì)感官評(píng)分的影響順序依次為：A(發(fā)酵溫度)>B(發(fā)酵時(shí)間)>C(接種量)。綜上所述，使用該模型能夠較好對(duì)感官評(píng)分進(jìn)行分析和預(yù)測，確定最佳發(fā)酵工藝參數(shù)。

2.2.4.2響應(yīng)面與等高線結(jié)果分析

圖1～圖3是發(fā)酵溫度、接種量、發(fā)酵時(shí)間與相對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值構(gòu)成的三維空間趨勢圖，可以直觀地反映3因素交互作用對(duì)感官評(píng)分的影響。從等高線的形狀可以看出各因素交互作用的強(qiáng)弱，圓形表示交互作用不顯著，橢圓表示交互作用顯著；從響應(yīng)曲面的坡度可以反映因素值的變化對(duì)響應(yīng)值的影響大小，坡度陡峭說明因素值的變化對(duì)響應(yīng)值的影響較大，坡度平緩說明因素值的變化對(duì)響應(yīng)值的影響較小[15]。因此，從圖可以看出，AC項(xiàng)的交互作用對(duì)感官評(píng)分的影響最顯著，其次是AB、BC交互項(xiàng)，這與連鑫[10]優(yōu)化蝦醬發(fā)酵工藝的結(jié)果類似。從圖2可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間固定在零水平時(shí)，隨著溫度升高，感官評(píng)分先迅速增加，達(dá)到一個(gè)最大值后緩慢下降，變化趨勢較大，說明溫度的變化對(duì)感官評(píng)分的影響很大；當(dāng)固定溫度時(shí)，感官評(píng)分隨著發(fā)酵時(shí)間變長先增加后下降，時(shí)間的變化對(duì)感官評(píng)分也具有很大影響。等高線圖呈現(xiàn)橢圓形，說明發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度的交互作用對(duì)感官評(píng)分具有顯著影響。響應(yīng)曲面有最高點(diǎn)即感官評(píng)分有最大值，說明發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間過高或過低都不能使感官評(píng)分達(dá)到最大，只有取其中某個(gè)適當(dāng)值才能使感官評(píng)分最大。圖1和圖3的變化趨勢與圖2基本類似。

表6　回歸模型方差分析Table 6　Variance analysis of fitted model

注：*表示影響顯著(p<0.05)，**表示影響極顯著(p<0.01)。

圖中感官評(píng)分隨各因素的變化呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，可能是因?yàn)楫?dāng)發(fā)酵溫度過高時(shí)，超過微生物的最適生長溫度，代謝活動(dòng)降低，對(duì)腐敗微生物的抑制作用減弱，產(chǎn)生不良?xì)馕?，致使感官評(píng)分下降；而溫度過低時(shí)，微生物生長受到限制，發(fā)酵緩慢，鮮味不足，所以發(fā)酵溫度在30～32 ℃時(shí)發(fā)酵液感官評(píng)分比較高，此結(jié)果與XU YAN-SHUN[18]探究發(fā)酵溫度對(duì)銀鯉香腸的品質(zhì)影響的變化趨勢一致。當(dāng)接種量過高時(shí)，隨著乳酸菌和酵母菌的增加，會(huì)發(fā)酵過度，產(chǎn)生酸敗味、酒精味，發(fā)酵液香氣不純；接種量較低時(shí)，發(fā)酵味不明顯，所以接種量在3%～4%比較合適，F(xiàn)RANCISCO CARRAU[17]等人在探究釀酒酵母接種量對(duì)酒香氣成分的影響中也證實(shí)只有適當(dāng)?shù)慕臃N量，才能使酒的香味最好；葉勁松[18]在研究發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵豬耳西式火腿品質(zhì)的影響中也表明發(fā)酵時(shí)間的選擇對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量至關(guān)重要，發(fā)酵時(shí)間太長會(huì)使代謝產(chǎn)物積累，產(chǎn)生不良風(fēng)味；發(fā)酵時(shí)間太短，微生物和酶沒有充分發(fā)揮作用，生成的風(fēng)味物質(zhì)種類單一，特征風(fēng)味不夠明顯，所以發(fā)酵時(shí)間在22～24 h時(shí)，發(fā)酵液感官評(píng)分比較高。從而也說明這個(gè)模型可以很好的反映感官評(píng)分和這3個(gè)因素的關(guān)系。

2.2.4.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用Design Expert軟件對(duì)回歸方程進(jìn)行分析，得到南極磷蝦復(fù)合發(fā)酵的最佳工藝條件為：發(fā)酵溫度30.71 ℃，發(fā)酵時(shí)間21.71 h，接種量3.87%，感官評(píng)分的預(yù)測值為4.28，結(jié)合實(shí)際，選用發(fā)酵溫度為31 ℃，發(fā)酵時(shí)間22 h，接種量4%為最佳條件。為了檢測模型預(yù)測結(jié)果的可靠性，在最優(yōu)條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測得的感官評(píng)分為4.39±0.061，與預(yù)測值之間的相對(duì)誤差為2.57%，誤差較小，說明該模型可以準(zhǔn)確預(yù)測南極磷蝦發(fā)酵液的感官評(píng)分。

圖1　發(fā)酵溫度和接種量對(duì)感官評(píng)分影響的響應(yīng)曲面(左)和等高線 (右)Fig.1　The suiface plot(left) and contour plot(right) for effectsof fermentation time and inoculums on the sensory score

圖2　發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)感官評(píng)分影響的響應(yīng)曲面(左)和等高線 (右)Fig.2　The suiface plot(left) and contour plot(right) for effectsof fermentation time and temperature on the sensory score

圖3　發(fā)酵時(shí)間和接種量對(duì)感官評(píng)分影響的響應(yīng)曲面(左)和等高線 (右)Fig.3　The suiface plot(left) and contour plot(right) for effectsof fermentation time and inoculums on the sensory score

3　結(jié)論

以南極磷蝦為原料，按木糖葡萄球菌∶植物乳酸桿菌∶魯氏酵母菌=1∶2∶3的比例進(jìn)行混合發(fā)酵，通過模糊感官評(píng)價(jià)及響應(yīng)面分析，得到發(fā)酵的最佳工藝條件為發(fā)酵溫度31 ℃，發(fā)酵時(shí)間21 h, 接種量4%，此條件下，不僅保留了蝦的鮮味，同時(shí)增加了特殊的發(fā)酵香味，得到的產(chǎn)品不僅營養(yǎng)豐富，而且風(fēng)味飽滿、口感協(xié)調(diào)，促進(jìn)了南極磷蝦的進(jìn)一步開發(fā)利用。

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