應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)分選單核細(xì)胞亞群不同預(yù)富集方法的探討*

楊紅艷，焉力方，王如剛，周　欣　

(1.北京市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究中心，北京　100020；2.武警天津市總隊(duì)第六支隊(duì)，天津　300402；3.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院心臟醫(yī)院，天津　300162)

單核細(xì)胞是調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞，其表型和功能具有異質(zhì)性，單核細(xì)胞的不同亞群參與了不同疾病的發(fā)生發(fā)展[1，2]。流式細(xì)胞術(shù)是20世紀(jì)60年代末發(fā)展起來的技術(shù)，其在免疫學(xué)的研究中起到了重要的作用[3]，尤其是分選技術(shù)的建立，為獲取目標(biāo)細(xì)胞提供了強(qiáng)有力的技術(shù)平臺(tái)。因此，流式細(xì)胞分選術(shù)可以作為不同亞群單核細(xì)胞功能學(xué)和組學(xué)研究的重要手段。其中樣本的預(yù)富集方法對于分選的純度和速度等起著舉足輕重的作用，常用方法主要有紅細(xì)胞裂解法[4]、羥乙基淀粉(hydroxyethy1 starch，HES)離心沉淀法[5]和Ficoll密度梯度離心[6]等。幾種預(yù)富集方法各有利弊，尚未有研究對其進(jìn)行比較。因此，本研究擬從細(xì)胞活力、細(xì)胞回收率、單核細(xì)胞分群情況等方面加以比較，從而尋找一種便于建立簡便、快捷而又高效的單核細(xì)胞流式分選技術(shù)的樣本預(yù)富集方法。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料和試劑采集15例健康志愿者外周靜脈血3 ml。抗CD14- 異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)，mIgG2a- FITC，抗CD16- 藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)，mIgG1- PE，抗CD86- PE- Cy5和mIgG2b- PE- Cy5等抗體均購自Biolegend公司；Ficoll分離液購自Sigma公司；Flow- CountTMFluorospheres(Flow- CountTM熒光微球)購自Beckman公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1抗體標(biāo)記后裂解紅細(xì)胞(Method 1)：50 μl血先加入單核細(xì)胞亞群抗體混合液(CD14- FITC 4 μl，CD16- PE 6 μl，CD86- PE- Cy5 3 μl及Staining Buffer 12 μl)；室溫避光孵育15 min，然后加入600 μl紅細(xì)胞裂解液，避光孵育10 min；最后上機(jī)前加入50 μl Flow- countTM熒光微球。

1.2.2抗體標(biāo)記前裂解紅細(xì)胞(Method 2)：500 μl外周血首先加入10 ml紅細(xì)胞裂解液，室溫孵育10 min后離心(250 g，10 min)；棄上清，加入1 ml磷酸緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)重懸細(xì)胞，離心(250 g，10 min)，棄上清；50 μl Staining Buffer重懸；細(xì)胞計(jì)數(shù)后加入抗體混合液(CD14- FITC，CD16- PE，CD86- PE- Cy5及Staining Buffer)，避光孵育15 min，最后上機(jī)前加入50 μl Flow- countTM熒光微球并充分混勻。

1.2.3羥乙基淀粉離心沉淀法(Method 3)：500 μl全血與6 mg/dl的羥乙基淀粉按照1∶4的比例混勻，37℃靜置1 h，取上清，離心(250 g，10 min)；1 ml PBS洗滌2次；其余步驟同1.2.2。

1.2.4Ficoll密度梯度離心法(Method 4)：取一個(gè)無菌離心管，先加入比重為1.077g/cm3的Ficoll溶液500 μl，然后緩慢加入稀釋后的全血(500 μl全血+500 μl Hank’s液)，離心(250 g，30 min)；小心吸取中間白膜層(外周血單個(gè)核細(xì)胞)，PBS洗滌2次，棄上清；其余步驟同1.2.2。

1.2.5臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)法檢測細(xì)胞活力：分別取Method 2，Method 3和 Method 4方法制備的單細(xì)胞懸液，與0.4 mg/dl臺(tái)盼藍(lán)溶液按9∶1混合均勻，3 min內(nèi)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞，每個(gè)樣本計(jì)數(shù)3次，取平均值，計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力(%)=活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測：FITC，PE，PE- Cy5三色熒光染料經(jīng)488 nm激發(fā)光激發(fā)后，分別產(chǎn)生波長為525，572，675 nm的熒光，分別用Cytomics FC 500流式細(xì)胞儀的FL1，F(xiàn)L2和FL4三個(gè)通道收集熒光信號(hào)。使用前向散射光(FSC)和側(cè)向散射光(SSC)二維散點(diǎn)圖(dot plot)初步顯示外周血各群細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)分析的設(shè)門策略詳見本實(shí)驗(yàn)室前期工作[7]。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞活力檢測鏡下觀察，活細(xì)胞光亮無色，死細(xì)胞被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色且細(xì)胞發(fā)暗、無光澤。幾種方法所得的細(xì)胞，細(xì)胞活力均在95%以上。

2.2人外周血流式細(xì)胞分析檢測單核細(xì)胞及亞群流式細(xì)胞儀分析結(jié)果見圖1。其中A，B，C圖圈定的細(xì)胞群為單核細(xì)胞，E，F(xiàn)，G圖圈定的細(xì)胞群為單核細(xì)胞三個(gè)亞群的分布情況。結(jié)果顯示，與Method 1相比，Method 2和Method 4均能顯示外周血單核細(xì)胞亞群分布情況，而Method 3沒有明顯細(xì)胞分群，故此種方法不適合用于流式細(xì)胞分選技術(shù)的樣品預(yù)富集。

圖1　單核細(xì)胞亞群的流式分析圖

2.3不同預(yù)富集方法的單核細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，同一個(gè)志愿者，等量外周血，與Method 1相比， Method 2檢測的單核細(xì)胞數(shù)目與其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(24 602±7 207 vs 24 458±6 347，P>0.05)，而Method 4檢測的單核細(xì)胞則明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(24 602±7 207 vs 6 576±3 231，P<0.05)。

2.4不同預(yù)富集方法獲取樣本的流式分選上機(jī)檢測結(jié)果分別采集1 ml外周血，按照上述步驟處理，分選所需抗體及獲取單核細(xì)胞計(jì)數(shù)見表1。流式細(xì)胞分選結(jié)果顯示：與Method 1相比，Method 2獲取的單核細(xì)胞數(shù)量無明顯差異，但其所需抗體量僅為前者的1/30；而Method 4獲取的單核細(xì)胞數(shù)量則明顯減少，僅為其他方法的25%左右。

表1 不同預(yù)富集方法流式分選時(shí)獲取的單核細(xì)胞計(jì)數(shù)及抗體量

注：a代表與Method 1比較。

3　討論

單核細(xì)胞由骨髓中的造血干細(xì)胞分化而來，骨髓中的單核細(xì)胞成熟后進(jìn)入外周血，構(gòu)成了外周血中吞噬細(xì)胞的主要組成成分[1]。單核細(xì)胞能吞噬細(xì)菌、異物等，并參與機(jī)體的免疫反應(yīng)。單核細(xì)胞具有遷移性，當(dāng)機(jī)體受到抗原刺激時(shí)，在趨化因子的作用下，能夠吞噬、吞飲和受體介導(dǎo)的方式將抗原攝入細(xì)胞內(nèi)，并發(fā)揮殺傷作用。2010年國際免疫學(xué)會(huì)命名委員會(huì)依據(jù)單核細(xì)胞表面標(biāo)記物和流式細(xì)胞術(shù)對人類和鼠類單核細(xì)胞亞群進(jìn)行命名，人類單核細(xì)胞主要分為3個(gè)亞群：經(jīng)典型(CD14++CD16-單核細(xì)胞)[Mon l]；中間型(CD14++CD16+單核細(xì)胞)[Mon 2]；非經(jīng)典型(CD14+CD16++單核細(xì)胞)[Mon 3]，不同亞群具有不同的生理和病理生理學(xué)作用，其中具有促炎癥表型的Mon2亞群在心血管疾病病理生理學(xué)過程中發(fā)揮的作用備受關(guān)注[2]。

目前，單核細(xì)胞的相關(guān)研究已成為當(dāng)前免疫學(xué)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。傳統(tǒng)方法分離單核細(xì)胞需要反復(fù)離心清洗，且操作繁瑣，對分離試劑的要求高。近年來，隨著流式分選技術(shù)的應(yīng)用，基于細(xì)胞的大小及胞內(nèi)顆粒度等特征，對單核細(xì)胞進(jìn)行流式分選，得到較高純度的單核細(xì)胞亞群。而在流式分選技術(shù)中，樣本的預(yù)富集處理尤其重要。目前流式分選的樣本預(yù)富集方法很多，各有自身的優(yōu)缺點(diǎn)。本課題小組分別先采用紅細(xì)胞裂解法(Method 2)、羥乙基淀粉離心沉淀法(Method 3)和Ficoll密度梯度離心法(Method 4)預(yù)富集樣本，以抗體加入后再裂解紅細(xì)胞(Method 1)作為對照，然后分別用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析和分選。我們采用定量的方法，將三種方法分別與Method 1進(jìn)行了對比研究，力求在不影響細(xì)胞活力、數(shù)量及形態(tài)的前提下，找到一種預(yù)富集的最佳方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Method 2，即用紅細(xì)胞裂解液裂解獲取白細(xì)胞，再加入抗體孵育能達(dá)到后期流式分選的要求，不僅細(xì)胞的回收率與Method 1接近，而且能有效的減少抗體用量，縮短上機(jī)時(shí)間，故此方法可以用于少量臨床血液樣本進(jìn)行流式細(xì)胞分選出不同亞群的單核細(xì)胞，為深入研究單核細(xì)胞與疾病之間的關(guān)系提供了良好的技術(shù)平臺(tái)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Jakubzick CV，Randolph GJ，Henson PM．Monocyte differentiation and antigen- presenting functions[J]．Nature Reviews Immunology，2017，17(6)：349- 362．

[2]Ziegler- Heitbrock L．Blood monocytes and their subsets：established features and open questions[J]．Frontiers in Immunology，2015(6)：423．

[3]李玲，魏大鵬，張平，等．流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血白細(xì)胞內(nèi)的磷酸化STAT3[J]．現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，26(3)：96- 98．

Li L，Wei DP，Zhang P，et al．Detecting the tyrosine phosphorylated of STAT3 in white blood cells of human peripheral blood by flow cytometry[J]．Journal of Modern Laboratory Medicine，2011，26(3)：96- 98．

[4]Einwallner E，Subasic A，Strasser A，et al．Lysis matters：red cell lysis with FACS lyse affects the flow cytometric enumeration of circulating leukemic blasts[J]．Journal of Immunology Methods，2013，390(1/2)：127- 132．

[5]史艷利，高嶺，張憲偉，等．羥乙基淀粉沉降法制備外周血富白細(xì)胞血漿的條件優(yōu)化[J]．浙江臨床醫(yī)學(xué)，2015，17(7)：1204- 1205．

Shi YL，Gao L，Zhang XW，et al．Optimization of preparation of peripheral blood leukocytes in plasma by hydroxyethyl starch sedimentation[J]．Zhejiang Clinical Medical Journal，2015，17(7)：1204- 1205．

[6]Maqbool M，Vidyadaran S，George E，et al．Optimisation of laboratory procedures for isolating human peripheral blood derived neutrophils[J]．Medical Journal of Malaysia，2011，66(4)：296- 299．

[7]Ji WJ，Lu RY，Liu JX，et al．The influence of different anticoagulants and time- delayed sample processing and measurements on human monocyte subset and monocyte- platelet aggregate analyses[J]．Cytometry Part B Clinical Cytometry，2017，92(5)：371- 379．