T2DM并發(fā)NAFLD患者血清Nesfatin- 1水平變化及相關(guān)影響研究*

張　梅，李林娟，馮旭霞，李　亞，薛亞妮

(1.延安大學(xué)附屬醫(yī)院東關(guān)分院綜合內(nèi)科，陜西延安　716000；2.延安大學(xué)附屬醫(yī)院 a.CT/MR診斷科；b.呼吸內(nèi)科，陜西延安　716000)

目前全球罹患非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的人數(shù)已經(jīng)占到20%[1]，而2型糖尿病(T2DM)患者罹患NAFLD的嚴(yán)重程度與危險(xiǎn)程度比單純的NAFLD患者更高。流行病學(xué)研究報(bào)告指出，T2DM患者中罹患NAFLD的幾率高達(dá)21%～78%[2]。NAFLD是一種肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性后出現(xiàn)的脂肪堆積疾病，目前臨床對(duì)該病的發(fā)病機(jī)理仍然存在爭(zhēng)議。脂肪在體內(nèi)的作用不僅僅是存儲(chǔ)能量，更重要的是內(nèi)分泌作用，脂肪細(xì)胞分泌出的脂肪因子參與人體的各種新陳代謝過程，包括胰島素抵抗、T2DM，高凝狀態(tài)、血脂紊亂等。其中Nesfatin- 1是一種調(diào)節(jié)肝糖與胰島素分泌的胃腸調(diào)劑肽，能有效的減輕體質(zhì)量、抑制食物攝入、降低血糖等作用[3]。但是限于目前臨床研究T2DM對(duì)NAFLD患者血清水平Nesfatin- 1的變化影響并不多，所以本次研究旨在對(duì)Nesfatin- 1的生理作用進(jìn)行闡明，望能在今后的臨床工作中提供可靠的依據(jù)。

1　材料與方法

1.1研究對(duì)象選取2014年1月～2016年1月我院內(nèi)分泌科收治的T2DM患者300例作為本次研究的對(duì)象，根據(jù)患者是否并發(fā)非酒精性脂肪肝將其分為T2DM伴有NAFLD組150例與T2DM不伴有NAFLD組150例，另外選取同期在醫(yī)院進(jìn)行健康體檢的150例志愿者作為對(duì)照組(NGT組)。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：T2DM：患者均滿足1999年WHO對(duì)糖尿病的診斷，并滿足以下標(biāo)準(zhǔn)：①患者出現(xiàn)糖尿病標(biāo)準(zhǔn)，且任意時(shí)間段的血糖≥11.1 mmol/L；②患者空腹血糖≥7.0 mmol/L；③口服葡萄糖耐量試驗(yàn)患者2 h的血糖≥11.1 mmol/L；以上診斷不包含1型糖尿病與特殊糖尿病。NAFLD：所有患者均滿足2002年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)修訂的NAFLD診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，滿足以下診斷1～5項(xiàng)或是滿足第6項(xiàng)/7項(xiàng)中任一項(xiàng)均可判定為NAFLD，①患者無飲酒史或每周飲酒的酒精含量不超過40 g；②血轉(zhuǎn)氨酶以谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶增高明顯，或伴有鐵蛋白、尿酸、γ- 谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶增高；③自身有易患病因素包括2型糖尿病、肥胖、高血脂及女性等；④除原發(fā)病的臨床表現(xiàn)外，還出現(xiàn)肝區(qū)疼痛及乏力等癥狀；⑤無自身免疫性疾病、病毒性肝炎、藥物性肝炎、胃腸外營(yíng)養(yǎng)疾病等；⑥影像學(xué)檢查結(jié)果可確診；⑦肝臟組織學(xué)的變現(xiàn)典型。

三組研究對(duì)象Nesfatin- 1水平與一般情況的比較具體如下：T2DM組男性86例，女性64例，年齡51.4±7.6歲，病程6.7±1.1年；T2DM- NAFLD組男性92例，女性58例，年齡50.9±8.1歲，病程6.3±1.5年；NGT組男性80例，女性70例，年齡51.3±7.8歲。三組受試者的性別比、年齡及病程比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.37，0.73和0.94)，具有可比性。

1.2試劑和儀器本次研究使用試劑盒由武漢優(yōu)爾生生物工程有限公司提供，低溫高速臺(tái)式離心機(jī)由美國(guó) ICE公司提供，ZD- 420電熱恒溫水浴箱由杭州中拓儀器有限公司提供，日立7020全自動(dòng)生化分析儀由日本HITACHI公司提供，-40℃低溫冰箱由美國(guó)FORMA公司提供，酶標(biāo)儀由美國(guó)BIOTEK公司提供，GC- 911γ放射免疫計(jì)數(shù)儀由北京順杰欣隆科技公司提供，DEM- Ⅲ型自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)由北京拓普分析儀器有限公司提供，YD- HY8微量震蕩器由北京中諾遠(yuǎn)東科技公司提供。

1.3方法所有研究對(duì)象均于檢查前禁食8 h以上，于第二日清晨對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行空腹采血，采用葡萄糖氧化酶法對(duì)其空腹血糖進(jìn)行測(cè)定，高壓液相離子層析法對(duì)其糖化血紅蛋白進(jìn)行測(cè)定，放射免疫法對(duì)其空腹胰島素進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)監(jiān)測(cè)法對(duì)其肝功能進(jìn)行測(cè)定，比色法對(duì)血脂四項(xiàng)(總膽固醇、總?cè)８视?、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固?進(jìn)行測(cè)定。另外取2 ml靜脈血標(biāo)本對(duì)其進(jìn)行低溫高速離心，待血清分離后放置于-40℃進(jìn)行統(tǒng)一檢測(cè)。

血清Nesfatin- 1水平采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行測(cè)定，本次研究使用試劑盒由武漢優(yōu)爾生生物工程有限公司提供，分別向96孔微板(已經(jīng)進(jìn)行了人NES1抗體包被)加入標(biāo)準(zhǔn)品與標(biāo)本，再向其中加入生物素化的NES1抗體進(jìn)行免疫復(fù)合物合成。將尚未結(jié)合的抗體進(jìn)行清洗，再加入有HRP標(biāo)記的親和素，隨后洗凈后進(jìn)行顯色。底物在氧化物酶的作用下會(huì)變成藍(lán)色，經(jīng)酸性環(huán)境后變成黃色。微孔中通過黃色體現(xiàn)出的深淺度對(duì)NES1濃度進(jìn)行判斷，兩者屬于正相關(guān)關(guān)系[5]。

記錄所有患者的身高體重，并計(jì)算身高體質(zhì)指數(shù)，具體公式BMI=體質(zhì)量(kg)/身高2(m2)。記錄患者的空腹血糖(FBG)、空腹血漿胰島素(FIN)，并使用穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)計(jì)算公式對(duì)胰島素抵抗指數(shù)進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算公式：胰島素抵抗指數(shù)=空腹血胰島素×空腹血糖/22.5[6]。

2　結(jié)果

2.1三組研究對(duì)象Nesfatin- 1水平及相關(guān)生化指標(biāo)的比較見表1。本研究對(duì)T2DM，T2DM- NAFLD和NGT組的各種生化指標(biāo)和Nesfatin- 1水平進(jìn)行測(cè)定。三組對(duì)比具有顯著性差異的指標(biāo)結(jié)果如下：BMI，TG，ALT和INS水平，T2DM組與NGT組顯著低于T2DM- NAFLD組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P=0.00)；FBG，HbAlc，LDL- C，HOMA- IR和血清Nesfatin- 1水平：T2DM組與T2DM- NAFLD組顯著高于NGT組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P=0.00)。

表1 三組研究對(duì)象Nesfatin- 1水平及相關(guān)生化指標(biāo)的比較

注：▲與T2DM組比較，P<0.05；▼與NGT組比較，P<0.05。BMI：身體質(zhì)量指數(shù)，F(xiàn)BG：空腹血糖，HbA1c：糖化血紅蛋白，TG：三酰甘油，TC：膽固醇，HDL- C：高密度脂蛋白膽固醇，LDL- C：低密度脂蛋白膽固醇，ALT：谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，INS：胰島素，HOMA- IR：穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)。

2.2T2DM組患者Nefastin- 1和病程的相關(guān)性分析T2DM組患者與T2DM- NAFLD組患者的血清Nesfatin- 1水平和病程系正態(tài)分布，采用Pearson系數(shù)對(duì)患者進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示呈現(xiàn)中度相關(guān)性(r=-0.421，P<0.05)。

2.3T2DM組患者出現(xiàn)脂肪肝的回歸分析見表2。將脂肪肝作為T2DM患者的因變量，將BMI，TG，HDL- C，ALT，INS，HOMA- IR和血清Nesfatin- 1水平作為自變量，采用Logistic回歸分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMI，TG，血清Nesfatin- 1水平和脂肪肝的發(fā)生有密切的聯(lián)系(r值分別為-0.402，-0.273，-0.284；P值分別為0.01，0.00和0.00)。

表2 T2DM組患者出現(xiàn)脂肪肝的回歸分析

3　討論

3.1NAFLD的流行病學(xué)分析NAFLD是臨床上最常見的肝臟代謝紊亂性疾病，其發(fā)病率為20%～30%，在2型糖尿病的發(fā)病率中則高達(dá)70%～80%[7]，其中造成NAFLD病理特征最主要的原因是三酰甘油在肝臟內(nèi)的堆積。其發(fā)病范疇從既往的脂肪性轉(zhuǎn)化為非酒精性脂肪性肝炎(NAFLD)，現(xiàn)階段認(rèn)為造成NAFLD的主要因素為胰島素抵抗，游離脂肪酸會(huì)增加糖類與脂肪代謝紊亂的幾率[8]，造成肝臟細(xì)胞發(fā)生炎性反應(yīng)以及損傷。目前NAFLD在我國(guó)的發(fā)病率直線上升，其中糖尿病患者比同齡人發(fā)生脂肪肝的幾率高出80%[9]，臨床治療的主要手段在于阻止疾病的惡化，同時(shí)對(duì)引發(fā)代謝性綜合征的各種危險(xiǎn)因素進(jìn)行預(yù)防，包括血脂紊亂、胰島素抵抗等。其中血脂紊亂、胰島素抵抗與肥胖都與能量的消耗及食物的攝入有密切的關(guān)系，且NAFLD被作為2型糖尿病的危險(xiǎn)獨(dú)立因素[10]。NAFLD患者的脂質(zhì)在肝臟內(nèi)發(fā)生沉積，其重量超過自身肝臟的5%[11]，經(jīng)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)圖形特征主要是彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪病變，病理類型除了單純性的脂肪肝外，還包括脂肪性肝炎與肝硬化，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)惡性腫瘤。NAFLD患者通過肝臟穿刺后行病理活檢即可確診，其影像學(xué)檢查也是臨床常用的診斷輔助方式之一，但對(duì)于單純性的脂肪肝和脂肪性肝炎并不能進(jìn)行良好的區(qū)別。NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，現(xiàn)階段臨床較為認(rèn)可的為“二次打擊”學(xué)說[12]，第一次打擊為以胰島素抵抗為主因造成的三酰甘油在肝臟內(nèi)進(jìn)行沉積；第二次打擊為以氧化應(yīng)激為主因造成的纖維化病變與炎性病變。國(guó)外學(xué)者Varricchio等[13]研究發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗會(huì)隨著肝臟內(nèi)脂肪的增加而增加，而酒精性脂肪肝與T2DM的治療仍然處于不斷的探索與研究中，現(xiàn)階段對(duì)于酒精性脂肪肝與T2DM患者的治療主要是通過對(duì)其生活方式的干預(yù)來控制病情，包括飲食、運(yùn)動(dòng)等。NAFLD患者通常伴有T2DM、肥胖與脂質(zhì)紊亂，同時(shí)糖尿病、胰島素抵抗也參與了NAFLD的發(fā)生及發(fā)展，由于脂肪肝還會(huì)刺激胰島素的分泌，由此胰島素抵抗也會(huì)隨之明顯，所以形成了惡性循環(huán)[10]。

3.2Nesfatin- 1的生理作用Nesfatin- 1是日本學(xué)者在2006年時(shí)初次發(fā)現(xiàn)的一種在下丘腦的神經(jīng)肽，可對(duì)攝食進(jìn)行調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn)[14]，Nesfatin- 1是核組蛋白的前身，由于大鼠、小鼠及人的氨基酸序列的同源性較高，所以研究采用大鼠進(jìn)行了核組蛋白注入，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠在注入核組蛋白后體重出現(xiàn)減少，同時(shí)攝食的劑量依賴性也隨之降低；采用激素元轉(zhuǎn)換酶對(duì)核組蛋白進(jìn)行裂解，可得到三個(gè)片段，分別為Nesfatin- 1，Nesfatin- 2和Nesfatin- 3，將這三種片段分別注入大鼠的側(cè)腦室，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Nesfatin- 1組大鼠出現(xiàn)劑量依賴性抑食作用，且相比另外兩組大鼠差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨后將Nesfatin- 1的特異性抗體再次注入大鼠的腦室，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠的攝食出現(xiàn)增加，學(xué)者推斷Nesfatin- 1屬于一種飽食分子，具有降低體重、抑制攝食的作用。另外有研究發(fā)現(xiàn)[14]，Nesfatin- 1不僅存在于下丘腦，其中心臟、胰島、胃黏膜、脂肪等多種外周組織中均存在Nesfatin- 1，進(jìn)一步說明了Nesfatin- 1對(duì)于食物的攝入具有控制作用，同時(shí)還能調(diào)節(jié)能量的代謝、改善胰島素抵抗以及調(diào)節(jié)糖類與脂肪的代謝，所以Nesfatin- 1在糖尿病與脂類代謝紊亂疾病中具有重要的作用。目前對(duì)于Nesfatin- 1的作用機(jī)制尚未完全明確，但多數(shù)研究都證實(shí)了以上的觀點(diǎn)。大多數(shù)學(xué)者發(fā)現(xiàn)血清Nesfatin- 1水平與BMI，血糖、胰島素抵抗及NAFLD等有明顯關(guān)系。國(guó)外學(xué)者Basar等[15]對(duì)糖耐量正常的NAFLD及非NAFLD患者血清Nesfatin- 1濃度進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NAFLD患者血清Nesfatin- 1濃度相比健康人群含量明顯減少(P<0.05)，同時(shí)NAFLD組中存在胰島素抵抗患者顯著低于胰島素敏感的患者，所以推斷Nesfatin- 1或與NAFLD的發(fā)病相關(guān)。本次研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，T2DM患者的血清Nesfatin- 1水平顯著高于健康對(duì)照組，且低于T2DM- NAFLD組；并且T2DM患者的血清Nesfatin- 1水平與其病程有中度相關(guān)；而患者發(fā)生脂肪肝的幾率與其BMI，TG和血清Nesfatin- 1水平也存在明顯的關(guān)系。這一結(jié)論也與大多數(shù)學(xué)者的研究觀點(diǎn)相一致。

隨著目前對(duì)血清Nesfatin- 1研究的深入，國(guó)內(nèi)外Nesfatin- 1的研究也有一定的爭(zhēng)議，由于在NAFLD患者中研究其Nesfatin- 1水平的相對(duì)較少，所以對(duì)于T2DM并發(fā)NAFLD的血清Nesfatin- 1水平尚未見報(bào)道。本次研究發(fā)現(xiàn)，血清Nesfatin- 1可能參與T2DM與NAFLD的發(fā)生，旨在探究T2DM患者、NAFLD患者的血清Nesfatin- 1水平，同時(shí)研究Nesfatin- 1水平與患者發(fā)生胰島素抵抗的關(guān)系。由于本次研究的樣本含量較小，研究結(jié)果有一定的局限性，希望通過今后更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆治觯瑢?duì)T2DM患者及NAFLD患者的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入的研究。

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