血清miRNA- 21，miRNA- 126表達(dá)在診斷PCI術(shù)后冠狀動脈再狹窄的臨床應(yīng)用價值*

程　濤，黃　剛

(1.涇陽縣醫(yī)院檢驗科，陜西涇陽　713700；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，陜西咸陽　712000)

動脈粥樣硬化(AS)導(dǎo)致的冠脈管腔狹窄或閉塞是引起冠心病患者心肌缺血缺氧或壞死的主要原因，冠狀動脈介入術(shù)(PCI)已成為冠心病治療的重要手段之一，但PCI術(shù)后仍有20%的患者出現(xiàn)支架內(nèi)再狹窄(ISR)或血栓形成等不良缺血性事件[1]。微小RNA(MicroRNAs，miRNAs)通過調(diào)控基因表達(dá)，來參與機體各種疾病的發(fā)生發(fā)展過程。有報道認(rèn)為，miRNAs能夠調(diào)控多種心臟疾病的病理過程，其在缺血性心臟病的病理過程中呈現(xiàn)差異性表達(dá)[2]。研究發(fā)現(xiàn)miRNAs可穩(wěn)定存在與血液循環(huán)中，并且可能作為診斷疾病的生物學(xué)標(biāo)志物[3]。筆者通過檢測100例接受PCI術(shù)的急性冠脈綜合征(ACS)患者的血清miRNA- 21，miRNA- 126的表達(dá)水平，旨在探討其對于缺血缺氧條件下心肌細(xì)胞凋亡水平的調(diào)節(jié)，及對心肌梗死后心功能及心肌細(xì)胞凋亡水平的影響，并為PCI術(shù)后ISR的早期發(fā)現(xiàn)提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1研究對象選取2015年7月～2017年7月我們醫(yī)院心血管內(nèi)科住院接受PCI治療的ACS患者82例為研究對象，按術(shù)后是否出現(xiàn)ISR分為兩組：狹窄組30例，未狹窄組52例，其中男性51例，女性31例，平均年齡52.3±12.2歲。ACS的診斷依據(jù)世界衛(wèi)生組織關(guān)于ACS及急性心肌梗死(AMI)、不穩(wěn)定型心絞痛的診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時補充2007年全球心肌梗死工作組關(guān)于ACS及AMI的修正定義[4]。ACS患者中AMI 43例，UA 39例。對照組選取冠狀動脈造影陰性的患者，男27例，女22例，平均年齡55．3±13.7歲。所有患者病變位于前降支者53例，病變位于右冠脈者23例；位于回旋支者6例。PCI術(shù)后ISR診斷標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)冠脈造影顯示患者原病變部位支架內(nèi)和節(jié)段內(nèi)血管管腔直徑狹窄≥50%。選取同期在本院體檢中心體檢健康者33例作為對照組，其中男性20例，女性13例，平均年齡51.9±12.9歲。兩病例組患者均于支架置入術(shù)后服用阿司匹林100 mg/d 及波力維 75 mg/d。所有試驗對象排除瓣膜性心臟病、擴張型心肌病、肥厚型心肌病、心肌炎、腫瘤、肌肉疾病、肝腎功能不全及感染性疾病。各組患者性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象簽署知情同意書。

1.2試劑和儀器RNA提取采用mirVANA PARIS試劑盒。PCR試劑盒采用上海起福生物科技有限公司產(chǎn)品。lightCycler熒光PCR儀采用德國Roche公司產(chǎn)品。血管內(nèi)超聲檢查采用Boston Scientific Clearview血管內(nèi)超聲儀。介入系統(tǒng)為德國SIEMENSCOROSKOP TOP心血管造影系統(tǒng)。

1.3方法

1.3.2標(biāo)本采集：PCI患者于術(shù)后6個月行IVUS檢查的當(dāng)天采集靜脈血5 ml，對照組研究對象于體檢時采集靜脈血5 ml。所有研究對象采集的血液于2 h內(nèi)分離血清，4℃,3 000 r/min離心10 min，取上清液4℃，3 000 r/min離心10 min，將所得的血清標(biāo)本分裝于無RNA酶的凍存管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3miRNAs表達(dá)量檢測：采用實時逆轉(zhuǎn)錄- 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)研究甲亢患者血清miRNA- 21，miRNA- 126表達(dá)水平。

1.3.4RNA的提取及保存：首先吸取200 μl血液樣品、750 μl的RNA提取試劑和 20 μl冰醋酸，常溫下孵育5 min。再加入 0.2 ml氯仿，常溫下孵育3 min。然后離心取上清倒在無RNA酶的Eppondorf管中，加入等量異丙醇，常溫放置10 min。再離心，棄上清，室溫干燥。再通過RNA溶解步驟，獲得RNA溶液-20℃保存。

1.3.5PCR擴增：用pfimer5軟件設(shè)計引物。miRNA- 21的引物序列為：正義鏈5’- GATGATGCGCGAGAAGGAGGAGTT- 3’，反義鏈 5’- GGGGCGGGGGTGCTGTCAT- 3’；產(chǎn)物長度590 bp。miRNA- 126的引物序列為：正義鏈5’- GGGGTCGTACCGTGAGT- 3’，反義鏈 5’- CAGT GCGTGTCGTGGAGT- 3’，產(chǎn)物長度620 bp。U6作為內(nèi)參照，引物序列為：正義鏈5’- GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT- 3’，反義鏈5’- CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT- 3’，產(chǎn)物長度320 bp，反應(yīng)條件：94℃3min→94℃60 s，58℃60 s，72℃1.5 min，40個循環(huán)→72℃15min→4℃保存。

1.3.6標(biāo)志物相對表達(dá)量計算：對擴增的目的片斷進(jìn)行凝膠電泳，通過紫外光凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描并記錄，測定各組的cDNA的特異性，miRNA表達(dá)量用Ct值變化表示。△Ct=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)。由2-△Ct得出相應(yīng)的miRNA相對表達(dá)量。

(3)BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)能夠?qū)DEA溶液吸收能力進(jìn)行較準(zhǔn)確的預(yù)測，其平均相對誤差與最大相對誤差普遍較小，說明預(yù)測值與真實值比較接近，完全滿足誤差小于10%的相關(guān)要求。

2　結(jié)果

2.1各組IVUS結(jié)果比較見表1。狹窄組的PLA與未狹窄組比較顯著增高，而MLA顯著降低，其差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。

項　目未狹窄組(n=52)狹窄組(n=30)tPPLAMLA626±183596±2101097±236356±192113959300000000

注：PLA：斑塊面積；MLA：最小管腔面積。

2.2各組血清miRNA- 21，miRNA- 126水平比較見表2。與對照組比較，血清miRNA- 21在狹窄組與未狹窄組的表達(dá)量明顯增高，而miRNA- 126水平則顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。狹窄組與未狹窄組比較miRNA- 21水平明顯增高，而miRNA- 126水平則顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表2 PCI患者術(shù)后血清miRNA- 21，miRNA- 126水平比較

注：miRNA- 21：微小RNA- 21；miRNA- 126：微小RNA- 126；*與對照組比較P=0.000；#與未狹窄組比較P=0.000。

2.3相關(guān)性分析見圖1～5。狹窄組中miRNA- 126與miRNA- 21水平呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.919，P<0.01)。該組中miRNA- 126和miRNA- 21水平分別與PLA和MLA具有相關(guān)性(r=-0.945，0.926，P<0.01)，(r=0.933，-0.917，P<0.01)。

圖1　miRNA- 126與miRNA- 21相關(guān)性散點圖　　　　圖2　miRNA- 126與MLA相關(guān)性散點圖

圖3　miRNA- 21與MLA相關(guān)性散點圖　　　　　圖4　miRNA- 21與PLA相關(guān)性散點圖

3　討論

研究表明支架介入術(shù)容易引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。這種損傷引起機體的自我修復(fù)，而修復(fù)過度則可能引起血管再狹窄。PCI治療過程中導(dǎo)致動脈血管壁的直接損傷，可能引起炎癥反應(yīng)的發(fā)生、血栓形成以及血管內(nèi)膜過度增殖等。血管壁的這些變化最終引起血管新生內(nèi)膜形成及血管重塑，導(dǎo)致PCI術(shù)后再狹窄的發(fā)生[5]。miRNA在癌癥等疾病中已得到廣泛應(yīng)用，在冠心病領(lǐng)域也一直成為人們關(guān)注的焦點。miRNA- 21被證實通過影響心肌細(xì)胞的凋亡來參與心臟疾病的進(jìn)展，其表達(dá)水平在心肌梗死患者的心臟組織中呈現(xiàn)顯著上調(diào)[6]。miRNA- 21的表達(dá)在正常心肌組織中表達(dá)很低，但在各種心衰、心肌肥厚、缺血缺氧等條件下表達(dá)水平明顯增高。研究認(rèn)為心絞痛患者外周循環(huán)miRNA- 21表達(dá)較對照組上調(diào)1.9倍，而AMI患者則上調(diào)3.2倍[7]。Zhang等[8]對412例下肢動脈閉塞性疾病患者的研究顯示在介入治療術(shù)后再狹窄組外周循環(huán)miRNA- 21水平顯著增高，在術(shù)后無狹窄組則明顯降低。研究分析70例PCI術(shù)后的冠心病患者的結(jié)果顯示冠脈支架術(shù)后狹窄組患者血清 miRNA- 21水平明顯增高[5]。以上研究提示miRNA- 21水平在血管出現(xiàn)狹窄或閉塞時呈現(xiàn)過量表達(dá)。本研究結(jié)果顯示冠脈支架術(shù)后狹窄組miRNA- 21水平高于未狹窄組(P<0.01)，推測PCI術(shù)后的冠狀動脈損傷引起血管內(nèi)膜過度增殖可能與PCI術(shù)后冠脈狹窄的發(fā)生有密切的關(guān)系。進(jìn)一步的研究顯示未狹窄組患者血清miRNA- 21水平顯著高于對照組(P<0.01)，提示PCI術(shù)后患者可能存在再狹窄的風(fēng)險。miRNA- 21在缺血性心臟病的研究尚處于起步階段，隨著對miRNA- 2l研究的不斷深入，相信miRNA- 21對于缺血性心臟病及ISR發(fā)生的防治值得期待。

圖5　miRNA- 126與PLA相關(guān)性散點圖

既往的研究表明動脈粥樣硬化可能導(dǎo)致冠脈管腔的狹窄或閉塞，其可能與PCI術(shù)后再狹窄的病理過程有關(guān)[1]。miRNA- 126在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的特異性表達(dá)已被證實，其表達(dá)的下調(diào)可提高細(xì)胞黏附分子- 1活性，促進(jìn)新生血管的形成，維持血管壁的完整性[9]。另外，miRNA- 126調(diào)控血管黏附細(xì)胞因子- 1的表達(dá)，影響著動脈粥樣硬化斑塊形成的發(fā)展過程。研究顯示靜脈注射miRNA- 126可以抑制小鼠主動脈粥樣硬化病變，其結(jié)果使主動脈粥狀硬化斑塊的面積減小，表明miRNA- 126與動脈粥樣硬化斑塊的形成有密切關(guān)系[10]。推測miRNA- 126在血管炎癥及動脈粥樣硬化的發(fā)展中起著重要的保護作用。Wang等[11]采用RT- PCR技術(shù)研究miRNA- 126，瑞舒伐他汀以及血管內(nèi)皮生長因子三者間的關(guān)系。他們的實驗結(jié)果顯示心肌梗死小鼠模型中miRNA- 126的表達(dá)顯著減少，但血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)水平增加。miRNA- 126在PCI術(shù)患者外周血液的表達(dá)也有報道。PCI術(shù)后心肌梗死患者通過增強型體外反搏療法后循環(huán)miRNA- 126水平較未采用該療法的患者顯著增高[12]，證明增強型體外反搏療法治療心肌梗死患者的有效性，另一方面也印證了miRNA- 126在心肌缺血缺氧中的保護性作用。本實驗結(jié)果顯示狹窄組患者血清miRNA- 126表達(dá)顯著低于未狹窄組和對照組患者(P<0.01)，未狹窄組與對照組比較，血清miRNA- 126表達(dá)明顯降低(P<0.01)。提示冠脈造影陽性患者經(jīng)過PCI術(shù)后冠狀動脈的缺血得到緩解，發(fā)生心肌梗死的風(fēng)險明顯降低。因此認(rèn)為檢測血清miRNA- 126表達(dá)可用于ACS疾病的早期診斷，并可能成為預(yù)測AMI疾病發(fā)生的分子標(biāo)記物。

本研究相關(guān)性分析的結(jié)果顯示，狹窄組中miRNA- 21和miRNA- 126表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。該組中miRNA- 126和miRNA- 21水平分別與PLA 和MLA具有相關(guān)性。提示兩個標(biāo)志物與PCI術(shù)后的ISR發(fā)生密切相關(guān)。其變化可以反映PCI術(shù)后患者癥狀的改善狀況。

綜上所述，血清miRNA- 21和miRNA- 126的檢測可應(yīng)用于PCI術(shù)后ISR的預(yù)測，并可能為其提供有效的基因?qū)W依據(jù)。

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