單管雙重巢式聚合酶鏈反應(yīng)及基因測序技術(shù)鑒別呼吸道合胞病毒A，B亞型*

吳　意，金　嫻，樊春卉，陸學(xué)東，趙　毅

(1.深圳市第七人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳　518081；2.中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，廣東深圳　518033)

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)為有包膜的單股負(fù)鏈RNA病毒，屬于副黏病毒科，肺炎病毒屬，基因組有15 222個(gè)核苷酸。編碼8個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和2個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。病毒呈圓形或絲狀，大小100～350 nm，其核酸不分片段，核衣殼螺旋對稱，含RNA依賴的RNA多聚酶。有F，G，P和N四種蛋白，其中包膜上F蛋白能引起病毒包膜之間的融合，包膜上G蛋白對宿主細(xì)胞有吸附作用。NS1和NS2為非結(jié)構(gòu)蛋白，是干擾素系統(tǒng)的拮抗物；N是核殼蛋白；P是磷酸蛋白，是聚合酶復(fù)合物的重要成分；M是基質(zhì)蛋白；SH是一種小疏水橫跨膜表面糖蛋白；G是一種N端和O端糖基化的Ⅱ型橫跨膜黏附糖蛋白；F是N端糖基化的Ⅰ型橫跨膜糖蛋白，與細(xì)胞質(zhì)膜融合，在物質(zhì)通過胞膜時(shí)產(chǎn)生作用。RSV根據(jù)F和G蛋白上的抗原組分不同，分為A和B兩種亞型[1]。四種蛋白均具有抗原變異性，以G蛋白的可變性最高。目前RSV基因檢測技術(shù)有巢式PCR，RT- PCR，實(shí)時(shí)熒光定量PCR，DNA測序、核酸雜交技術(shù)、基因芯片技術(shù)和多重基因表達(dá)遺傳分析系統(tǒng)等。本次實(shí)驗(yàn)建立了單管雙重巢式PCR及基因測序技術(shù)鑒定RSV的A，B亞型，現(xiàn)報(bào)告如下：

1　材料與方法

1.1研究對象選擇2015年10月～2017年5月因呼吸道感染在深圳市第七人民醫(yī)院兒科住院治療的兒童，篩選出咽拭子RSV陽性患兒50例，年齡為10天～9歲。男患兒23例，女患兒27例。根據(jù)臨床疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)，按臨床癥狀、影像學(xué)和體征三者結(jié)合共確診四種疾病分別為急性喉氣管支氣管炎、支氣管肺炎、急性支氣管炎和急性上呼吸道感染。

1.2試劑和儀器RSV試劑盒購于中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，PCR引物和酶混合物由華大基因武漢分公司合成，微量加樣器購于德國Eppendorf公司，漩渦振蕩混勻器購于美國Vortex公司，C1301型迷你離心機(jī)購于美國Labnet公司，BSC- 1100A2X型生物安全柜購于濟(jì)南鑫貝西公司，DW- FL253低溫冰箱購于中科美菱低溫科技股份公司，Mastercyclerep realplex2熒光定量PCR儀購于德國Eppendorf公司，DYCP- 31F核酸電泳儀購于北京六一儀器廠，凝膠成像系統(tǒng)購于美國伯樂公司，ABI3730XL型DNA測序儀購于美國Applied Biosystems公司。

1.3方法

1.3.1樣本的收集：用鼻咽拭子取患者咽部分泌物，將標(biāo)本密封立即送檢，運(yùn)送采用0℃冰壺。標(biāo)本未及時(shí)檢測可保存于-20℃，保存期為12個(gè)月。

1.3.2RSV- RNA的提?。涸谘适米訕?biāo)本管內(nèi)加入1 000 μl生理鹽水震蕩洗脫分泌物，轉(zhuǎn)入1.5 ml的離心管內(nèi)；12 000 r/min離心5 min，吸掉上層液體留管底沉淀物100 μl；加入200 μl Trizol和100 μl RNA氯仿，震蕩20 s后，放置3 min，12 000 r/min離心2 min，吸取無色上層液體轉(zhuǎn)入新的1.5 ml離心管內(nèi)；加入10 μl RNA提取液A，充分震蕩混勻，8 000 r/min離心1 min；去上清液再加入400 μl溶液C(已加入18 ml無水乙醇)，震蕩混勻，8 000 r/min離心1 min；開蓋60℃干浴5 min，加30 μl DEPC水溶解沉淀備用。

1.3.3PCR擴(kuò)增篩選陽性標(biāo)本：加10 μl RSV- RNA模板進(jìn)PCR試劑盒反應(yīng)管內(nèi)，高速離心數(shù)秒后上機(jī)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增循環(huán)條件為：40℃30 min，94℃3 min，然后93℃15 s，55℃45 s共10個(gè)循環(huán)，93℃15 s，55℃45 s共30個(gè)循環(huán)，采集熒光信號(hào)。結(jié)果分析及質(zhì)量控制：每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性質(zhì)控品、強(qiáng)陽性質(zhì)控品和臨界(弱)陽性質(zhì)控品作為質(zhì)量控制，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠性。RSV陰性質(zhì)控品熒光信號(hào)無增長，且無明顯S型擴(kuò)增曲線；RSV強(qiáng)陽性和臨界陽性質(zhì)控品熒光信號(hào)增幅明顯，呈典型S型擴(kuò)增曲線；且RSV強(qiáng)陽性質(zhì)控品Ct值在9～12范圍，臨界陽性質(zhì)控品Ct值在17～20范圍，此三項(xiàng)要求必須在同次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則實(shí)驗(yàn)無效，需重新檢測。

1.3.4RSV- RNA模板逆轉(zhuǎn)錄為cDNA模板：在0.5 ml PCR反應(yīng)管內(nèi)加入2 μl Random 6 mers，1 μl dNTP Mixture 和10 μl RNA模板，上機(jī)65℃5 min，取出放置冰盒內(nèi)1～2 min；在反應(yīng)管內(nèi)再加入4 μl的5× PrimeScript Buffer，0.5 μl的RNase Inhibitor，1 μl的PrimeScript RTase和1.5 μl的RNase Free dH2O，上機(jī)30℃10 min，42℃40 min，70℃15 min結(jié)束，逆轉(zhuǎn)錄的cDNA模板于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5RSV亞型PCR擴(kuò)增：RSV通用引物序列為：GGGGCAAATGCAAACATGTCC，A亞型特異性引物序列為：GGGGTTGTGTTCTTGATC，B亞型特異性引物序列為：GCTGTGGGTATTTGTGTG。在0.5 ml PCR反應(yīng)管內(nèi)加入12.5 μl 2× mix酶混合物，通用引物和A，B亞型引物各1 μl，cDNA模板2 μl，再加ddH2O至25 μl，高速離心10 s后上機(jī)擴(kuò)增。PCR反應(yīng)擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，52℃復(fù)性30 s，72℃延伸60 s，共32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，最后4℃forever。

1.3.6電泳及測序：2 g/dl的瓊脂糖凝膠120V電壓電泳45 min，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察電泳結(jié)果。PCR產(chǎn)物測序由華大基因武漢分公司和廣州分公司共同完成。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用卡方檢驗(yàn)對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義。

2　結(jié)果

2.1RSV亞型的檢測結(jié)果RSV通用引物與A亞型特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段為277 bp，RSV通用引物與B亞型特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段為863 bp，RSV的A，B亞型及混合感染產(chǎn)物電泳見圖1。

注：1，2，3，4，6，10為A亞型；7，9為B亞型；5，8為AB混合型；11為Marker。

圖1RSV亞型及混合感染電泳圖

2.2A亞型擴(kuò)增產(chǎn)物正向核苷酸序列及測序峰圖RSV的A亞型擴(kuò)增產(chǎn)物正向核苷酸序列：CCAGT TCACGCACCGCCAGACACTAGAAGAACCTG GGACACTCTCAATCATCTATTATTCATAT CATCGTGCTTATACAAGTTAAATCTTAAA TCTATAGCACAAATCACATTATCTATTTT GGCAATGATAATCTCAACCTCACTTATAA TTGCAGCCATCATATTCATAGCCTCGGCA AACCACAAAGTCACACTAACAACTGCAAT CATACAAGATGCAACGAACCAGATCAAGA ACACAACCCC。部分測序峰圖見圖2。

圖2　A亞型擴(kuò)增產(chǎn)物正向核苷酸序列測序峰圖

2.3A亞型擴(kuò)增產(chǎn)物反向核苷酸序列及測序峰圖RSV的A亞型擴(kuò)增產(chǎn)物反向核苷酸序列為：AGA TGAGATGCAGTTGTTAGTGTGACTTTGTG GTTATGCCGAGGCTATGAATATGATGGCT GCAATTATAAGTGAGGTTGAGATTATCAT TGCCAAAATAGATAATGTGATTTGTGCTA TAGATTTAAGATTTAACTTGTATAAGCAC GATGATATGAATAATAGATGATTGAGAG TGTCCCAGGTTCTTTCTAGTGTCTTGGCGG TGCGTTGGTCCTTGGTTTTGGACATGTTT GCATTTGCCCC。部分測序峰圖見圖3。

圖3　A亞型擴(kuò)增產(chǎn)物反向核苷酸序列測序峰圖

2.4B亞型擴(kuò)增產(chǎn)物正向核苷酸序列及測序峰圖B亞型擴(kuò)增產(chǎn)物正向核苷酸序列：CCGGGTCAC GGGCAATGATAATCTCAACCTCTCTTATA ATTGCAGCCATAATATTGCCAATCACAAA GTTACACTAACAACTGTCACAGTTCAAAC AATAAAAAACCACACTGAGAAAAACATAA CCACTTACCTTACTCAGGTCTCACCAGAAA GGGTTGGCCCATCCAAACAACCCACAGCCA CACCACCAATCCACACAAACTCAGCCACA ATATCACCCAATACAAAATCAGAAACACA CCATACAACAGCACAAACCAAAGGCACA ACCTCTATTCCAACACAGAACAACAAGCC AAGCACAAAACCACGTCCAAAAAATCCAC CAAAAAAAGATGATTACCATTTTGAAGTG TTCAACTTTGTTCCCTGTAGTATATGTGG CAACAATCAACTCTGCAAATCCATTTGC AAAACAATACCAAGCAATAAACCAAAGA AAAAACCAACTACAAAACCCACAAACAA ACCACCTACCAAAACCACAAACAAAAGA GACCCCAAAACACTAGCCAAAACACCGAA AAAAGAAACCACCATTAACCCAACAAAA AAACCAACCCCCAAGACTACAGAAAGAGA CACCAGCACCCCACAATCCACTGTGCTCG ACATAACCACATCAAAACACACAGAAAGG GACACCAGCACCTCACAATCCATTGCGCT TGACACAACCACATCAAAACACACAACCC AACAGCAATCTCTCTACTCAACCATCCCC GAAAACACACCCAACTCCACACAATTTCC CCCCCCAGCA。部分測序峰圖見圖4。

圖4B亞型擴(kuò)增產(chǎn)物正向核苷酸序列測序峰圖

2.5B亞型擴(kuò)增產(chǎn)物反向核苷酸序列及測序峰圖B亞型擴(kuò)增產(chǎn)物反向核苷酸序列：CATTTCGAC CAGGTTGAGTAGAGAGTTGCTGTTGGGTT GTGTGTTTTGATGTGGTTGTGTCAAGCGC AATGGATTGTGAGGTGCTGGTGTCCCTTT CTGTGTGTTTTGATGTGGTTATGTCGAGC ACAGTGGATTGTGGGGTGCTGGTGTCTCT TTCTGTAGTCTTGGGGGTTGGTTTTTTTG TTGGGTTAATGGTGGTTTCTTTTTTCGGT GTTTTGGCTAGTGTTTTGGGGTCTCTTTT GTTTGTGGTTTTGGTAGGTGGTTTGTTTG TGGGTTTTGTAGTTGGTTTTTTCTTTGGT TTATTGCTTGGTATTGTTTTGCAAATGGA TTTGCAGAGTTGATTGTTGCCACATATAC TACAGGGAACAAAGTTGAACACTTCAAAA TGGTAATCATCTTTTTTTGGTGGATTTTT TGGACGTGGTTTTGTGCTTGGCTTGTTGT TCTGTGTTGGAATAGAGGTTGTGCCTTTG GTTTGTGCTGTTGTATGGTGTGTTTCTGA TTTTGTATTGGGTGATATTGTGGCTGAGT TTGTGTGGATTGGTGGTGTGGCTGTGGGT TGTTTGGATGGGCCAACCCTTTCTGGTGA GACCTGAGTAAGGTAAGTGGTTATGTTTT TCTCAGTGTGGTTTTTTATTGTTTGAACT GTGACAGTTGTTAGTGTAACTTTGTGATT GGCAGAGATGATGAATATTATGGCTGCA ATTATAAGAGAGGTTGAGATTATCATTGC CAAAACTGATAGTGCTATTTGTGCTATAG ATTTTAAATTTAATTTGTATAAACAAGAG GATATTACAATTAGATGATTAAGAGTATC CCAGGTCTTCTTCTAAAGTCCTGGCAGTGC GTTGA。部分測序峰圖見圖5。

圖5　B亞型擴(kuò)增產(chǎn)物反向核苷酸序列測序峰圖

2.6呼吸道合胞病毒A，B亞型及混合感染率50例咽拭子RSV陽性患兒呼吸道合胞病毒A，B亞型及AB亞型混合感染率分別為82.00%(41/50)，14.00%(7/50)和4.00%(2/50)，各亞型之間感染率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義(χ2=81.06，P<0.05)。

3　討論

呼吸道合胞病毒是臨床常見的引起嬰幼兒下呼吸道感染與院內(nèi)感染的重要病原菌之一[2，3]，發(fā)病率高，傳染性強(qiáng)[4]。RSV為有包膜單股負(fù)鏈RNA病毒，主要是通過呼吸道、手和污染物品傳播，臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、喘息和呼吸困難，重癥病例還可造成多系統(tǒng)損害。由于G蛋白基因在不同亞型間，甚至在同一亞型內(nèi)均明顯變異，半數(shù)以上兒童可發(fā)生反復(fù)感染。病毒的分離培養(yǎng)一直是診斷RSV感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但該法繁瑣，周期時(shí)間長，且不能鑒定其亞型，難以廣泛應(yīng)用于臨床檢測中。

目前RSV的檢測方法有直接免疫熒光法、間接免疫熒光法、橋聯(lián)酶標(biāo)免疫法、ELISA，RT- PCR，實(shí)時(shí)定量PCR、免疫層析分析技術(shù)等。郭虹等[5]報(bào)道了直接免疫熒光法比金標(biāo)法檢測RSV靈敏度高，但結(jié)果基本一致。張?jiān)势娴萚6]運(yùn)用GeXP多重RT- PCR技術(shù)檢測呼吸道病毒具有快速、高通量等特點(diǎn)。本次實(shí)驗(yàn)研究先運(yùn)用FQ- PCR技術(shù)篩選出RSV- RNA陽性標(biāo)本，再根據(jù)RSV的G蛋白編碼基因核苷酸序列設(shè)計(jì)了單管雙重巢式PCR引物進(jìn)行基因分型；其A，B亞型產(chǎn)物經(jīng)電泳后觀察其片段大小，再經(jīng)DNA測序與GeneBank庫中核苷酸序列進(jìn)行比對分析鑒定，其結(jié)果完全吻合，說明其特異度、重復(fù)性和準(zhǔn)確度都非常高，解決了常規(guī)PCR存在的假陰性和假陽性。同時(shí)我們單管一次能檢測出A，B亞型雙重感染，無需分兩管進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物電泳后所剩標(biāo)本還可以進(jìn)行DNA測序分析，對不同亞型之間的核苷酸同源性進(jìn)行比對，同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)突變的堿基。此次實(shí)驗(yàn)研究過程中未發(fā)現(xiàn)非特異性擴(kuò)增片段，再次證明其方法技術(shù)具有很高的特異度。

此次研究主要是以A亞型為主，同時(shí)也檢出混合感染2例，這與周平等[7]報(bào)道的A亞型35.5%和劉文寬等[8]報(bào)道的15.0%差異甚遠(yuǎn)，但與季健等[9]報(bào)道的80.15%比較接近，其原因可能是與地域、溫度氣候及流行季差異有關(guān)。近年來RSV的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，A，B兩個(gè)亞型在一個(gè)地區(qū)的某個(gè)流行季節(jié)里以一個(gè)亞型占優(yōu)勢，兩個(gè)亞型交替流行。RSV表面的G蛋白是刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體最主要的病毒抗原之一，而不同的RSV亞型G蛋白所產(chǎn)生的保護(hù)性抗體不能有效的提供交叉保護(hù)作用，因此RSV亞型的存在可能就是引起反復(fù)感染的重要原因。喬瑞娟等[10]研究發(fā)現(xiàn)A，B亞型優(yōu)勢交替進(jìn)行，這與Cui等[11]對北京地區(qū)和Agoti等[12]對肯尼亞地區(qū)的監(jiān)測結(jié)果一致。有人推測，之所以世界大部分國家和地區(qū)總表現(xiàn)以A基因型流行為主，可能是由于B基因型致病力較A基因型弱，因此B基因型往往表現(xiàn)為亞臨床狀態(tài)或隱性無癥狀感染，但這個(gè)結(jié)論目前還存在許多爭議。還有學(xué)者認(rèn)為可能是由于A基因型內(nèi)部的變異要多于B基因型內(nèi)部的變異，造成了大部分時(shí)間和大部分地區(qū)以A基因型流行占優(yōu)勢。此次測序結(jié)果未發(fā)明顯突變基因序列。混合感染在國內(nèi)少見報(bào)道，可能是由于其方法學(xué)局限性的原因，而單管雙重巢式PCR彌補(bǔ)了常規(guī)PCR技術(shù)的不足，實(shí)現(xiàn)了一管兩項(xiàng)結(jié)果的檢測，充分體現(xiàn)其高效性。

此方法學(xué)的建立可運(yùn)用于RSV的分子流行病學(xué)研究，對疫苗的研制可提供一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，綜上所述，單管雙重巢式聚合酶鏈反應(yīng)及基因測序技術(shù)適用于RSV的A，B亞型鑒別，具有靈敏度高、特異度強(qiáng)和準(zhǔn)確率高的特點(diǎn)。

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