Taqman- 探針熒光定量PCR鑒定副溶血弧菌方法的建立*

侯兵兵，陳昌國，李　娜，趙強元，陳秋圓，劉新萍，董優(yōu)優(yōu)

(中國人民解放軍海軍總醫(yī)院檢驗科，北京　100048)

副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus，VP)于1953年最早發(fā)現(xiàn)于日本并于1963年正式命名[1]，該菌具有較強的嗜鹽性[2]，對人主要引起食物中毒、急性腸炎，少數(shù)情況下可引起敗血癥[3～5]。與沙門菌和志賀菌類似，副溶血弧菌通過食源性途徑引起的中毒事件受到廣泛關(guān)注[6，7]。在我國廣東省，副溶血弧菌導致食源性疾病疫情發(fā)生率為29.22%，是沿海地區(qū)主要的食源性致病菌之一[8]。

副溶血弧菌根據(jù)其血清型可分為非致病性菌株和致病性菌株，其中高致病性血清型共有14種[1]。耐熱直接溶血素(thermostable direct hemolysin，TDH)基因和TDH相關(guān)溶血素(TDH- related hemolysin，TRH)基因是檢測副溶血弧菌的常見分子靶點[9，10]，但有報道指出副溶血弧菌分離株中TDH基因和TRH基因有缺失的現(xiàn)象，會造成假陰性結(jié)果。副溶血弧菌毒素調(diào)控基因(toxin regulations，toxR)是近年來在副溶血弧菌中新發(fā)現(xiàn)的毒素調(diào)控基因，與副溶血弧菌的致病性有著密切關(guān)系，且在弧菌中同源性較低。在本次研究中，我們針對toxR基因相對保守區(qū)設計熒光定量引物和Taqman- 熒光探針，建立Taqman- 探針熒光定量PCR檢測副溶血弧菌的方法，結(jié)果報道如下。

1　材料與方法

1.1實驗菌株本實驗使用的菌株包括：副溶血弧菌ATCC- VPJS421，溶藻弧菌ATCC- 17749，創(chuàng)傷弧菌ATCC- CMCP6，梅氏弧菌ATCC- Vm8，弗尼斯弧菌ATCC- Vfns1，糞腸球菌ATCC- 29212，金黃色葡萄球菌ATCC- 25293，腐生葡萄球菌ATCC- BAA750，霍氏腸桿菌ATCC- 700323，銅綠假單胞菌ATCC- 27853，大腸埃希氏菌ATCC- 25922，菌株均為本科室保存。

1.2儀器與試劑熒光定量PCR儀為上海宏石公司SLAN- 96P real time PCR System生產(chǎn)，SYBR○RGreen QPCR Master Mix 購自天根生物科技有限公司；引物及Taqman探針由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，按照引物合成單要求進行后期處理。

1.3方法

1.3.1細菌核酸粗提物制備：將菌種從-80℃冰箱取出后置37℃水浴快速復溫，復溫后的菌種保存液接種在硫代硫酸鹽檸檬酸鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium，TCBS)和哥倫比亞血平板上，置37℃孵箱培養(yǎng)12 h。用無菌接種環(huán)取適量細菌至1.5 ml離心管中，加入100 μl核酸裂解液后室溫裂解15 min，100℃恒溫金屬浴加熱10 min，室溫13 000 r/min離心5 min(離心半徑=9.5 cm)，取上清作為模板。

1.3.2引物及Taqman- 探針設計：在NCBI網(wǎng)站輸入基因名稱獲取基因序列，運用生物軟件Beacon Designer 7和Primer Premier 5.0進行熒光定量PCR引物及Taqman熒光探針設計，探針5’端標記ROX，3’端標記BHQ2。上游引物：5’- CGCTTTCTTCAGACTCAA- 3’，下游引物：5’- CAAGGATTCACAGCAGAA- 3’，熒光探針：ROX- CCTGCTTCTGATAACAATGACGCC- BHQ2。

1.3.3PCR反應體系及擴增條件：取1 μl提取液上清為模板，以toxR特異性引物及Taqman- 探針進行熒光定量PCR檢測。PCR反應體系為：2× Mix 10 μl，引物對1μl，Taqman- 探針0.5 μl，模板1 μl，ddH2O 7.5 μl。PCR反應條件為：95℃5 min；94℃20 s～62℃30 s收集熒光，40個循環(huán)。

1.3.4引物濃度的優(yōu)化：上下游引物濃度分別配置成20，15，10 nmol/L工作液進行熒光定量PCR檢測，擴增條件同前。

1.3.5探針濃度的優(yōu)化：合成的熒光探針按照合成單要求加入ddH2O配成母液，然后取5 μl探針母液至95 μl ddH2O中作為工作液。在20 μl PCR反應體系中分別加入1，0.5 μl熒光探針，擴增條件同前。

1.3.6特異度評價：以優(yōu)化后的反應體系檢測副溶血弧菌標準菌株及其他10種細菌的標準株。

1.3.7靈敏度評價：以副溶血弧菌標準菌株系列濃度梯度為模板(102～10- 4mg/L)，每個濃度梯度取1 μl核酸為模板，以優(yōu)化后的反應體系和反應條件進行熒光定量PCR。以出現(xiàn)典型擴增曲線并在循環(huán)數(shù)內(nèi)出現(xiàn)Ct值為陽性。

2　結(jié)果

2.1實驗參數(shù)的優(yōu)化

2.1.1引物濃度的優(yōu)化：經(jīng)過多次實驗引物最佳濃度約為10 nmol/L，經(jīng)2 g/dl凝膠電泳顯示引物二聚體較少且擴增效率能夠滿足實驗要求，見圖1。

圖1　PCR產(chǎn)物2 mg/dl凝膠電泳圖

2.1.2探針濃度的優(yōu)化：實驗結(jié)果顯示，20 μl PCR反應體系中加入0.5 μl熒光探針的反應曲線較體系中加入1 μl熒光探針的效果更好，這與之前研究結(jié)果一致[11]，見圖2。因此，優(yōu)化后的副溶血弧菌Taqman- 探針熒光定量PCR反應條件為：20μl體系(ddH2O 7.5 μl，2× Mix 10 μl，模板1 μl，引物對1 μl，探針0.5 μl)。95℃5 min；94℃20 s～62℃30 s收集熒光，40個循環(huán)。

圖2　不同濃度的探針PCR擴增曲線

2.2Taqman- 探針熒光定量PCR反應體系評價

2.2.1特異度評價：用優(yōu)化后的反應體系檢測副溶血弧菌標準菌株及其他10種細菌的標準菌株，以副溶血弧菌的標準菌株為陽性對照。結(jié)果除副溶血弧菌標準株陽性擴增外，其它10種細菌標準株均無陽性擴增。因此，該方法的特異度為100%。見圖3～圖4。

圖3　副溶血弧菌標準株與其他10種細菌PCR擴增曲線

注：1.溶藻弧菌ATCC- 17749；2.創(chuàng)傷弧菌ATCC- CMCP6；3.梅氏弧菌ATCC- Vm8；4.弗尼斯弧菌ATCC- Vfns1；5.糞腸球菌ATCC- 29212；6.金黃色葡萄球菌ATCC- 25293；7.腐生葡萄球菌ATCC- BAA750；8.霍氏腸桿菌ATCC- 700323；9.銅綠假單胞菌ATCC- 27853；10.大腸埃希氏菌ATCC- 259221；11.副溶血弧菌ATCC- VPJS421。

圖4副溶血弧菌Taqman- 探針熒光定量PCR特異度檢測

2.2.2靈敏度評價：以副溶血弧菌標準株核酸系列稀釋樣本為模板進行熒光定量PCR，當模板濃度為102～10- 1mg/L時，每個濃度均有典型擴增曲線，當模板濃度為10- 2～10- 4mg/L時，每個濃度未出現(xiàn)典型擴增曲線。所以，本研究建立的方法對副溶血弧菌toxR基因的檢測靈敏度為10- 1mg/L，有較好的檢測靈敏度。見圖5。

圖5　副溶血弧菌(ATCC- VPJS421)Taqman- 探針熒光定量PCR靈敏度檢測

3　討論

近年來，隨著生物化學、免疫學、微生物學、分子生物學技術(shù)的快速發(fā)展，目前已經(jīng)有很多技術(shù)用于副溶血弧菌的檢測，如細菌培養(yǎng)法、培養(yǎng)基顯色法、血清學分型鑒定[12]、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)[13]、電化學發(fā)光技術(shù)[14]、免疫熒光技術(shù)[15，16]、免疫印跡[17]、常規(guī)PCR，RAPD- PCR，PCR- ELISA，SYBRGreen熒光定量PCR和多重PCR等。然而，常規(guī)分離鑒定操作復雜、費時，不能做到早期診斷；免疫學方法其靈敏度和特異度受限且影響因素較多；常規(guī)PCR，RAPD- PCR，PCR- ELISA和多重PCR技術(shù)均不能進行定量分析，擴增完仍需凝膠電泳進行鑒定，操作繁瑣，同時擴增產(chǎn)物易被污染造成假陽性[12]。Taqman- 探針熒光定量PCR技術(shù)是在普通熒光定量PCR基礎上加入一條特異的熒光探針，具有更高的特異度[11]。

副溶血弧菌TDH基因、TRH基因、gyrB(DNA回旋酶B亞單位)基因以及16S rRNA等都曾被用做副溶血弧菌檢測的分子靶點。其中16S rRNA基因保守性極強，其分化程度不夠，在鑒定親緣關(guān)系較近的物種間容易出現(xiàn)假陽性；而TDH基因和TRH基因在引起食物中毒的副溶血弧菌分離株中約30.77%副溶血弧菌為陰性[18]。toxR基因由國外學者近年來在副溶血性弧菌中新發(fā)現(xiàn)的致病基因，它在弧菌科內(nèi)序列非常保守，可表達于所有副溶血弧菌中[2]，并且不同的弧菌種間toxR基因同源性較低[19]。因此，采用副溶血弧菌toxR基因作為檢測靶點比tdh基因、trh基因和gyrB基因及16S rRNA具有明顯的優(yōu)勢。

本研究針對副溶血弧菌toxR基因設計特異性引物與Taqman- 探針，建立和優(yōu)化了實時熒光定量PCR反應體系，并對該體系檢測特異度和靈敏度進行了評價，檢測時間僅需要50 min。2 mg/dl凝膠電泳結(jié)果顯示，我們設計的引物不但能夠擴增出特異性的條帶，并且反應完成后引物二聚體較少，能夠滿足后續(xù)添加Taqman- 探針的實驗要求；在進行探針濃度優(yōu)化時，20 μl PCR反應體系中添加0.5 μl熒光探針的Ct值較添加1.0 μl熒光探針的Ct值小且本底熒光較低，能滿足實驗要求。本研究建立的實時熒光定量PCR反應體系經(jīng)過上述優(yōu)化后為評價該檢測系統(tǒng)的特異度和靈敏度，我們采用該反應體系對副溶血弧菌標準株及其它10種常見細菌標準株進行檢測，僅副溶血弧菌產(chǎn)生陽性擴增，顯示出良好的特異度。為進一步探求該反應體系的檢測靈敏度，我們將副溶血弧菌標準株核酸定量后進行系列稀釋(濃度范圍為：102～104mg/L)，發(fā)現(xiàn)在核酸濃度為10-1mg/L時能夠產(chǎn)生穩(wěn)定擴增，而10-2mg/L時無穩(wěn)定擴增，提示該反應體系的檢測靈敏度為10-1mg/L。

綜上所述，本研究建立的Taqman- 探針熒光定量PCR技術(shù)與常規(guī)分離培養(yǎng)、常規(guī)PCR以及免疫學方法相比，特異度和靈敏度高、檢測速度快(檢測僅需要50min)，適用于副溶血弧菌的快速檢測，在副溶血性弧菌診斷上將具有良好的應用前景和應用價值。

參考文獻：

[1]韓艷青，侯鳳伶，張淑紅，等．基于多重PCR的副溶血弧菌大流行菌群及其毒力基因檢測方法的建立與評價[J]．疾病監(jiān)測，2016，31(9)：750- 754．

Han YQ，Hou FL，Zhang SH，et al．Establishment and evaluation of a novel multiplex PCR assay in detection of pandemic group ofvibrioparahaemolyticusand toxic genes[J]．Disease Surveillance，2016，31(9)：750- 754．

[2]Chen S，Ge B．Development of a toxR- based loop- mediated isothermal amplification assay for detectingVibrioparahaemolyticus[J]．BMC Microbiology，2010，10(41)：1- 9．

[3]Zhang L，Orth K．Virulence determinants forVibrioparahaemolyticusinfection[J]．Curr Opin Microbiol，2013，16(1)：70- 77．

[4]Whitaker WB，Parent MA，Boyd A，et al．TheVibrioparahaemolyticusToxRS regulator is required for stress tolerance and colonization in a novel orogastric streptomycin- induced adult murine model[J]．Infect Immun，2012，80(5)：1834- 1845．

[5]Pan J，Chen R，Li C，et al．Global analysis of protein lysine succinylation profiles and their overlap with lysine acetylation in the marine bacterium vibrio parahemolyticus[J]．J Proteome Res，2015，14(10)：4309- 4318．

[6]周方滿，謝紅意，葉鴻雁，等．臨床來源副溶血弧菌毒力基因及耐藥性分析[J]．現(xiàn)代實用醫(yī)學，2016，28(7)：949- 950．

Zhou FM，Xie HY，Ye HY，et al．Virulence genes and resistance analysis ofVibrioparahaemolyticusisolated from clinical sample[J]．Modern Practical Medicine，2016，28(7)：949- 950．

[7]Wu S，Wang Y，Duan N，et al．Colorimetric aptasensor based on enzyme for the detection ofVibrioparahemolyticus[J]．J Agric Food Chem，2015，63(35)：7849- 7854．

[8]張冬生，王鐵強，辜潔妮，等．廣東省2007～2011年食物中毒事件流行病學特征分析[J]．華南預防醫(yī)學，2013，39(3)：74- 76．

Zhang DS，Wang TQ，Gu JN．Epidemiological analysis on food poisoning in Guangdong 2007～2011[J]．South China J Prev Med，2013，39(3)：74- 76．

[9]Gutierrez West CK，Klein SL，Lovell CR，et al．High frequency of virulence factor genes tdh，trh，and tlh invibrioparahaemolyticusstrains isolated from a pristine estuary[J]．Appl Environ Microbiol，2013，79(7)：2247- 2225．

[10]Li L，Wong HC，Nong W，et al．Comparative genomic analysis of clinical and environmental strains provides insight into the pathogenicity and evolution ofVibrioparahaemolyticus[J]．BMC Genomics，2014，15(1)：1135．

[11]陳昌國，侯兵兵，陳秋園，等．Taqman- 探針熒光定量PCR鑒定溶藻弧菌方法的建立[J]．實用檢驗醫(yī)師雜志，2017，9(1)：1- 4．

Chen CG，Hou BB，Chen QY，et al．Establishment of a method for the identification ofVibriopalginolyticusby Taqman- Probe fluorescence quantitative PCR analysis[J]．Chin J Clin Pathol，2017，9(1)：1- 4．

[12]張倩華．副溶血性弧菌實驗室檢測研究進展[J]．吉林醫(yī)學，2014，35(25)，5720- 5721．

Zhang QH．Research progress on the detection me- thods of the vibrio palginolyticus[J]．Jilin Medical Journal，2014，35(25)，5720- 5721．

[13]Khawsuk W，Soonklang N，Grams R，et al．Production and characterization of a monoclonal antibody against recombinant glutathione S- transferase(GST) of Fasciola gigantica[J]．Asian Pac J Allergy Immunol，2002，20(4)：257- 266．

[14]Sun W，Zhang Y，Ju X，et al．Electrochemical deoxyribonucleic acid biosensor based on carboxyl functionalized graphene oxide and poly- L- lysine modified electrode for the detection of tlh gene sequence related toVibrioparahaemolyticus[J]．Anal Chim Acta，2012，752(21)：39- 44．

[15]Wang L，Zhang J，Bai H，et al．Specific detection ofVibrioparahaemolyticusby fluorescence quenching immunoassay based on quantum dots[J]．Appl Biochem Biotechnol，2014，173(5)：1073- 1082．

[16]Yi MY，Ling L，Neogi SB，et al．Real time loop- mediated isothermal amplification using a portable fluorescence scanner for rapid and simple detection ofVibrioparahaemolyticus[J]．Food Control，2014，41(1)：91- 95．

[17]Sakata J，Kawatsu K，Iwasaki T，et al．Production and characterization of a novel monoclonal antibody againstVibrioparahaemolyticusF0F1 ATP synthase’s delta subunit and its application for rapid identification of the pathogen[J]．J Microbiol Methods，2012，88(1)：77- 82．

[18]駱艷婷，梁景濤，陳愛貞，等．佛山市副溶血弧菌病原學與分子流行病學特征[J]．熱帶醫(yī)學雜志，2016，16(5)：677- 680．

Luo YT，Liang JT，Chen AZ，et al．Etiology and molecular epidemiology ofVibrioparahaemolyticusin Foshan[J]．Journal of Trpical Medicine，2016，16(5)：677- 680．

[19]黃晨陽，于龍，蘭智杰，等．基于toxR基因的PCR檢測副溶血性弧菌的方法建立[J]．河南預防醫(yī)學雜志，2013，24(5)，327- 330．

Huang CY，Yu L，Lan ZJ，et al．Development of a to- xR- based PCR assay for detectingVibrioparahaemolyticus[J]．Henan Journal of Preventive Medicine，2013，24(5)：327- 330．