念珠菌類細(xì)菌樣變異株基因特征初步研究*

王　華，蒼金榮，王　曦，劉家云，任健康，蘇寶鳳，張利俠，閆福堂，歸巧娣

(1.陜西省人民醫(yī)院，a.陜西省臨床檢驗(yàn)中心；b.檢驗(yàn)科，西安　710068； 2.西安市紅會(huì)醫(yī)院，西安　710054；3.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院，西安　710032)

念珠菌可因生長(zhǎng)的微環(huán)境和體內(nèi)某些因素都可能引起念珠菌發(fā)生變異，使其培養(yǎng)特性、染色性、形態(tài)結(jié)構(gòu)特征、生化反應(yīng)、耐藥性等發(fā)生改變[1]，這些生物學(xué)性狀的改變，會(huì)給念珠菌病的實(shí)驗(yàn)診斷、臨床治療帶來(lái)困擾，極易引起誤診或漏診而貽誤治療。我們將這些念珠菌變異株稱之為“念珠菌類細(xì)菌樣變異株”。對(duì)念珠菌發(fā)生變異前后生物學(xué)性狀及遺傳學(xué)特征進(jìn)行了深入研究[1～5]發(fā)現(xiàn)：念珠菌極易發(fā)生類細(xì)菌樣變異，變異株無(wú)論菌落、菌體形態(tài)、核結(jié)構(gòu)、生化反應(yīng)、藥敏試驗(yàn)均失去念珠菌固有的生物學(xué)特征而與普通細(xì)菌的生物學(xué)性狀酷似。但是其基因特征尚不清楚，為此，我們對(duì)這些念珠菌類細(xì)菌樣變異株的16S RNA序列、真菌18S RNA序列進(jìn)行了分析比較。

1　材料與方法

1.1材料ATCC10231白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，源于陜西省疾病預(yù)防控制中心；念珠菌類細(xì)菌樣變異株是白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株在低溫、營(yíng)養(yǎng)缺乏條件或氟康唑誘導(dǎo)下獲得。Premix Taq PCR試劑為Takara產(chǎn)品。細(xì)菌保守基因序列16S RNA通用引物，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約1 400 bp，引物序列27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1429R：GGTTACCTTGTTACGACTT；真菌保守基因序列18S RNA通用引物，擴(kuò)增片斷約500bp，引物序列FF：ATTGGAGGGCAAGTCTGGTG，F(xiàn)R：CCGA TCCCTAGTCGGCATAG。上述PCR引物及測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2方法

1.2.1念珠菌變異株的實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)和臨床分離：在低溫、營(yíng)養(yǎng)缺乏條件下誘導(dǎo)白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株使其變異；用不同濃度梯度的氟康唑等臨床常用抗真菌藥物誘導(dǎo)白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株變異。

1.2.2真菌基因模板制備：采用煮沸法制備模板，取培養(yǎng)平板上的菌落于盛有去離子水的1.5 ml離心管中，充分懸浮菌體，置100℃沸水中煮沸10 min，10 000 r/min離心5 min后取上清液2 μl作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.3細(xì)菌保守基因16S RNA序列的PCR反應(yīng)體系和參數(shù)：細(xì)菌保守基因16S RNA序列和真菌保守基因18S RNA序列均采用相同的反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件：2×Taq PCR MasterMix(Takara公司產(chǎn)品)進(jìn)行PCR，2×Taq PCR MasterMix 25 μl，模板DNA 2 μl，正向引物F(100 μmol/L) 0.2 μl，反向引物R(100 μmol/L) 0.2 μl，無(wú)菌雙蒸水22.6 μl，總體積50 μl。PCR參數(shù)：在Bio- Rad T100型PCR儀上反應(yīng)的參數(shù)為：94℃預(yù)變性5 min，94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。擴(kuò)增結(jié)束后取PCR產(chǎn)物10 μl在1.2 g/dl瓊脂糖凝膠上電泳，觀察并記錄結(jié)果。

1.2.4真菌保守基因18S RNA序列的擴(kuò)增：采用與16S RNA反應(yīng)體系和參數(shù)相同的條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析。

1.2.5細(xì)菌保守基因16S RNA測(cè)序分析：將細(xì)菌保守基因16S RNA擴(kuò)增片段送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，所得序列進(jìn)行BLAST(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對(duì)分析。

2　結(jié)果

2.1念珠菌類細(xì)菌樣變異株16S RNA序列擴(kuò)增陽(yáng)性念珠菌類細(xì)菌樣變異株經(jīng)16S RNA引物擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)念珠菌類細(xì)菌樣變異株16S RNA序列均擴(kuò)增陽(yáng)性，而白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株未出現(xiàn)相應(yīng)的擴(kuò)增條帶(圖1)。表明念珠菌類細(xì)菌樣變異株基因組中具有16S RNA序列。

E.coli1 2 3 M 4 5Negative

E.coli：大腸埃希菌ATCC25922；M：100～6 000 bp DNA marker (100，250，500，750，1 000，2 000，4 000，5 000，6 000 bp)；1：ATCC10231白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株；2：ATCC10231白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，斜面?zhèn)鞔? 灰白粗大G+桿菌，類似芽孢狀；3：ATCC10231白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，4℃?zhèn)鞔? 黃色G+桿菌；4：ATCC90029白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株氟康唑誘導(dǎo)- 灰白粗大G+桿菌，類芽孢狀；5：ATCC90029白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株氟康唑誘導(dǎo)- 灰白粗大G+桿菌，類芽孢狀傳代- 黃色G+桿菌。

圖1念珠菌類細(xì)菌樣變異株16S RNA基因擴(kuò)增結(jié)果

2.2念珠菌類細(xì)菌樣變異株18S RNA序列擴(kuò)增結(jié)果念珠菌類細(xì)菌樣變異株經(jīng)18S RNA引物擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)念珠菌類細(xì)菌樣變異株除2號(hào)菌株有微弱的條帶外，其余變異株18S RNA序列均未擴(kuò)增出目的條帶，而白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株則出現(xiàn)相應(yīng)的擴(kuò)增條帶(圖2)。表明念珠菌類細(xì)菌樣變異株基因組中18S RNA序列所占比例不多或是因多次傳代遺失。

E.coli1 2 3 M 4 5Negative

圖2　念珠菌類細(xì)菌樣變異株18S RNA基因擴(kuò)增結(jié)果

2.3念珠菌類細(xì)菌樣變異株16S RNA序列比對(duì)結(jié)果念珠菌類細(xì)菌樣變異株16S RNA擴(kuò)增片段經(jīng)純化后進(jìn)行DNA序列測(cè)定，BLAST進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)念珠菌類細(xì)菌樣變異株序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中細(xì)菌序列有較高的相似性，其中2，4分別為內(nèi)生芽胞桿菌(Bacillus endophyticus)；3，5為假棒形桿菌屬(Pseudoclavibacter terrae)。部分菌株的BLAST比對(duì)結(jié)果見圖3。

3　討論

微生物的鑒定除傳統(tǒng)的生化反應(yīng)外，還可以采用測(cè)序方法對(duì)包括16S rRNA或18S rRNA等基因進(jìn)行分析比對(duì)。16S rRNA基因是細(xì)菌染色體上編碼rRNA相對(duì)應(yīng)的DNA序列，約1 542 bp，存在于所有細(xì)菌的染色體基因組中。在 16S rRNA 分子中，既含有高度保守的序列區(qū)域，又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域，不同的物種16S 序列具有一定的特異性，常用于細(xì)菌分類和進(jìn)化分析[6]。18S rRNA片段相對(duì)比較長(zhǎng)，分辨能力也較強(qiáng)。由于片段中含有同源性較強(qiáng)的保守區(qū)和變異性較大的可變區(qū)，因此利用不同的區(qū)域可以進(jìn)行不同真菌的親緣關(guān)系比對(duì)。目前已用于真菌的不同分類級(jí)別的鑒定，包括目、科、屬的鑒別[6]。

圖3　部分念珠菌類細(xì)菌樣變異株16S RNA序列比對(duì)結(jié)果

隨著人口老齡化及疾病結(jié)構(gòu)的改變，念珠菌已成為機(jī)會(huì)感染的常見病原菌，以往教科書未見對(duì)念珠菌類原核生物樣變異方面的記載。目前臨床常用的唑類、多烯類抗真菌藥物抗真菌機(jī)理是與真菌細(xì)胞壁的麥角固醇結(jié)合而影響其細(xì)胞壁的合成，因此，不合理的抗真菌治療及體內(nèi)某些因素可能是引起念珠菌發(fā)生變異的一個(gè)重要因素，這從我們的實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)和臨床分離出念珠菌變異株的事實(shí)得到驗(yàn)證[1～3]。本次實(shí)驗(yàn)中念珠菌類細(xì)菌樣變異株經(jīng)18S RNA引物擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)念珠菌類細(xì)菌樣變異株除2號(hào)菌株有微弱的條帶外，其余變異株18S RNA序列均未擴(kuò)增出目的條帶，而白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株則出現(xiàn)相應(yīng)的擴(kuò)增條帶；4號(hào)菌株曾經(jīng)擴(kuò)增出較強(qiáng)的18S RNA序列條帶，經(jīng)過數(shù)年20次傳代后再擴(kuò)增未見此條帶，表明念珠菌類細(xì)菌樣變異株基因組中18S RNA序列所占比例不多或是因多次傳代遺失。電鏡觀察具有明確親緣關(guān)系的念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、念珠菌類細(xì)菌樣變異株、變異菌返祖株在核物質(zhì)存在形式上確有質(zhì)的改變，失去真核生物應(yīng)有的特征，而與原核細(xì)胞生物學(xué)特性酷似，這種遺傳學(xué)特征的改變可能是念珠菌發(fā)生類原核生物樣變異的根源[7]。實(shí)驗(yàn)[4]還證實(shí)，念珠菌和其類細(xì)菌樣變異體在條件合適時(shí)可在真核細(xì)胞與原核細(xì)胞之間互變，此研究在生物進(jìn)化特別是在原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的進(jìn)化聯(lián)系上有非常重要的意義，念珠菌很可能是真核生物和原核生物間的一個(gè)過渡體。16S RNA和18S RNA序列分析表明，念珠菌類細(xì)菌樣變異株基因組含有細(xì)菌保守基因及少量真菌保守基因，證明具有原核生物學(xué)性狀的念珠菌類細(xì)菌樣變異株是源于真核生物的念珠菌。念珠菌類細(xì)菌樣變異是一個(gè)復(fù)雜且少有的研究課題，我們期待獲得更多分子生物學(xué)信息，來(lái)進(jìn)一步闡明原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的進(jìn)化相互關(guān)系。

參考文獻(xiàn)：

[1]王華，蒼金榮，任健康，等．念珠菌類細(xì)菌樣變異形態(tài)學(xué)特征[J]．現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，28(3)：61- 64，67．

Wang H，Cang JR，Ren JK，et al．Study on morphology of mutable candida like bacteria[J]．JModLabMed，2013，28(3)：61-64，67．

[2]蒼金榮，任健康，蘇保鳳，等．臨床分離類細(xì)菌樣變異念珠菌的實(shí)驗(yàn)室診斷[J]．現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2009，24(1)：59- 61．

Cang JR，Ren JK，Su BF，et al．J Mod Lab Med，2009，24(1)：59- 61．

[3]蒼金榮，王華，任健康，等．變異念珠菌常見菌落和菌體形態(tài)[J]．現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，26(2)：12- 14，18．

Cang JR，Wang H，Ren JK，et al．Variable candida albicans common morphology of colonies and mycelium[J]．J Mod Lab Med，2011，26(2)：12- 14，18．

[4]王華，蒼金榮，任健康，等．類細(xì)菌樣念珠菌變異株真菌保守基因檢測(cè)[J]．現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，26(3)：39- 40，43．

Wang H，Cang JR，Ren JK，et al．Detection of conserved gene in bacteria- like canidia albicans variants[J]．J Mod Lab Med，2011，26(3)：39- 40，43．

[5]王華，蒼金榮，任健康，等．類細(xì)菌樣念珠菌變異株對(duì)普通抗細(xì)菌藥物敏感性觀察[J]．現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，26(4)：45- 47．

Wang H，Cang JR，Ren JK，et al．Observation of the sensitivity of bacteria- like candida to normal antibiotics[J]．J Mod Lab Med，2011，26(4)：45- 47．

[6]Karst SM，Dueholm MS，McIlroy SJ，et al．Retrieval of a million high- quality，full- length microbial 16S and 18S rRNA gene sequences without primer bias[J]．Nat Biotechnol，2018，1(1)．doi：10．1038/nbt．4045．[Epub ahead of print]

[7]王華，蒼金榮，任健康，等．類細(xì)菌樣念珠菌變異株生物學(xué)形狀及遺傳學(xué)特征研究[J]．現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2015，30(4)：47- 49，52．

Wang H，Cang JR，Ren JK，et al．Study on biological characters and genetic characteristics of oidiomycetes mutant strains like bacterial morphology[J]．J Mod Lab Med，2015，30(4)：47- 49，52．