健康人外周血白念珠菌烯醇化酶抗原特異性T細(xì)胞檢測*

蔣曦旻，張　斌，史利寧，商秀娟，張彩云，王靜瑜，胡毓安

(1.中國人民解放軍南京總醫(yī)院a.醫(yī)學(xué)信息科；b.臨床中心實(shí)驗(yàn)科，南京　210002； 2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院藥學(xué)部，南京　210008)

近二十年來，在ICU病人和免疫抑制患者(如艾滋病、臨床惡性腫瘤、器官移植患者)中，侵襲性念珠菌病(invasive candiasis，IC)感染率逐年增高。受限于缺少特異臨床癥狀和早期實(shí)驗(yàn)室診斷指標(biāo)，IC死亡率高達(dá)40%～50%，臨床結(jié)局并未獲得明顯改善[1]。免疫輔助治療和預(yù)防接種被認(rèn)為可能是將來改善IC臨床治療結(jié)局的有效策略[2]，尋找有效的念珠菌疫苗分子是目前的研究熱點(diǎn)之一。

白念珠菌烯醇化酶(enolase，Eno)由440個(gè)氨基酸組成，分子量在45～48 kD之間，是白念珠菌中含量最豐富的可溶性蛋白之一。Eno催化糖酵解過程中2- 磷酸甘油酸脫水生成磷酸烯醇式丙酮酸，并在糖異生過程中催化逆向反應(yīng)，參與念珠菌的能量代謝。Eno定位于白念珠菌細(xì)胞壁和胞漿內(nèi)，白念珠菌出現(xiàn)菌絲相生長時(shí)Eno表達(dá)顯著增多，提示Eno與侵襲性感染相關(guān)[3]。白念珠菌Eno具有強(qiáng)免疫原性，在IC病人體內(nèi)可檢出高滴度的抗Eno- IgG抗體，并可引起細(xì)胞免疫應(yīng)答[4～6]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，Eno抗體對IC可以提供保護(hù)性作用[7～10]，因此Eno被認(rèn)為是一個(gè)具有研究價(jià)值的IC疫苗候選分子。

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)(ELISPOT)具有高敏感度(可以檢出1/105細(xì)胞)和高特異度，可以在單細(xì)胞水平測定抗原特異性T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的功能和數(shù)量，適用于特異性T細(xì)胞應(yīng)答的測定，客觀反映免疫細(xì)胞的應(yīng)答規(guī)律，被廣泛應(yīng)用于疫苗機(jī)制研究和疫苗效應(yīng)評價(jià)。本研究采用實(shí)驗(yàn)室自制的Eno基因重組抗原，通過建立ELISPOT方法檢測健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中分泌干擾素- γ(IFN- γ)，白介素- 4(IL- 4)與白介素- 17A(IL- 17A)的Eno抗原特異性T淋巴細(xì)胞頻數(shù)，分析健康受試者PBMC在其刺激下產(chǎn)生的細(xì)胞免疫應(yīng)答類型，以了解Eno抗原特異性T 淋巴細(xì)胞在IC中是否具有提供細(xì)胞免疫保護(hù)作用的可能性。

1　材料與方法

1.1研究對象選取南京軍區(qū)南京總醫(yī)院生殖中心門診男性健康體檢者25例，年齡25～48歲(31.64±5.25歲)。

1.2試劑與儀器Eno重組抗原由本課題組自制，ELISPOT試劑(mabtech公司)，PVDF板(Milipore公司)，RPMI1640培養(yǎng)液、EZ- Culture無血清培養(yǎng)液和全套人ELISPOT輔助試劑盒(深圳達(dá)科為公司)，F(xiàn)icoll淋巴細(xì)胞分離液(上海華精生物公司)，Biosys Bioreader 4000 PRO斑點(diǎn)分析儀及分析軟件均為深圳市達(dá)科為生物技術(shù)有限公司提供。

1.3方法PBMC分離和分泌IFN- γ，IL- 4和IL- 17A的Eno- 特異性淋巴細(xì)胞頻數(shù)檢測，按說明書和文獻(xiàn)進(jìn)行操作[11]。無菌條件下細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)每孔先后加入細(xì)胞懸液100 μl(濃度為2×106/ml)和刺激物10 μl。特異性抗原刺激物為Eno抗原(10 μg)，陽性對照孔的刺激物為PHA，陰性對照孔的刺激物為無血清培養(yǎng)液，試劑對照孔加EZ- Culture無血清培養(yǎng)液，不加入刺激物。每份標(biāo)本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。每次檢測同時(shí)設(shè)2個(gè)陽性對照孔、2個(gè)陰性對照孔、2個(gè)試劑對照孔，陰、陽性對照孔細(xì)胞濃度為2×105細(xì)胞/孔，檢測抗體濃度分別為：IFN- γ：1 μg/ml，IL- 4：1 μg/ml和IL- 17A：0.5 μg/ml。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 18.0軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。偏態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)(四分位數(shù))[M(P25，P75)]表示，計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)、百分?jǐn)?shù)表示。偏態(tài)分布的計(jì)量資料多組間比較用Kruscal- Wallis法，如各組間有顯著性差異，進(jìn)一步采用Mann- WhitneyU檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較，采用Bonferroni法校正P值判斷有無顯著性差異。計(jì)數(shù)資料組間比較采用Fisher’s exact test檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1Eno抗原特異性T淋巴細(xì)胞分泌IFN- γ，IL- 17A和IL- 4的陽性斑點(diǎn)形成細(xì)胞(SFC)ELISPOT檢測結(jié)果見圖1。Eno刺激后，分泌IFN- γ，IL- 4和IL- 17A的抗原特異性T淋巴細(xì)胞頻數(shù)分別為14.00(8.5，39.00)個(gè)、0(0，0)個(gè)和2(1，4.5)個(gè)，Kruscal- Wallis法顯示三組間SFC差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=60.919，P=0)，隨后采用Mann- WhitneyU檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較，發(fā)現(xiàn)各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義(IFN- γ vs IL- 17A：U=35.5，IFN- γ vs IL- 4：U=0，IFN- γ vs IL- 4：U=41.0，均P<0.01)，見圖2。Eno刺激后產(chǎn)生強(qiáng)IFN- γ應(yīng)答(SFC≥20)的健康人占40.00%(10/25)，無受試者產(chǎn)生強(qiáng)IL- 17A和IL- 4應(yīng)答。

圖1　重組人Eno刺激健康人PBMC產(chǎn)生的細(xì)胞

2.2Eno抗原特異性T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答模式分析Eno刺激后，25例健康受試者分泌IL- 4，IL- 17A和IFN- γ的應(yīng)答率分別為4%(1/25)、88%(22/25)和100%(25/25)，IFN- γ和IL- 17A應(yīng)答率均高于IL- 4，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，見圖3。健康受試者PBMC細(xì)胞免疫應(yīng)答模式以同時(shí)產(chǎn)生Th1和Th17型應(yīng)答為主，占84%(21/25)；3例研究對象僅產(chǎn)生Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答(12.00%，3/25)，4%(1/25)同時(shí)產(chǎn)生Th1，Th2和Th17型3種細(xì)胞免疫應(yīng)答，未觀察到單獨(dú)產(chǎn)生Th2型或Th17型細(xì)胞免疫應(yīng)答者，見圖4。

圖2　IFN- γ，IL- 4和IL- 17A的頻數(shù)比較

圖3　IFN- γ，IL- 4和IL- 17A應(yīng)答陽性率

圖4　健康人對白念珠菌Eno的細(xì)胞免疫應(yīng)答類型

3　討論

白念珠菌是常見的院內(nèi)血流感染病原菌[1]，目前IC不斷升高的感染率和居高不下的死亡率[12]，使得學(xué)者們不斷尋找可以改善IC治療結(jié)局的新策略，比如免疫輔助治療和預(yù)防接種。而尋找理想的念珠菌保護(hù)性疫苗分子并闡明其保護(hù)機(jī)制是IC疫苗研發(fā)領(lǐng)域的熱點(diǎn)[2]。

Eno是念珠菌能量代謝的重要酶類[5]，其表達(dá)水平和白念珠菌侵襲性生長相關(guān)[3]，被認(rèn)為可能是IC的診斷標(biāo)志物[5，6]，因此，Eno是IC診斷、治療和預(yù)防研究中的一個(gè)熱門分子。在IC感染過程中，白念珠菌Eno及其重組蛋白均被證實(shí)具有較強(qiáng)的免疫原性，可以引發(fā)人體和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫應(yīng)答。如血清蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，IC病人血清中存在高滴度的抗Eno- IgG[5，6]，重組Eno免疫小鼠和家兔，均能產(chǎn)生高滴度的抗Eno- IgG。動(dòng)物模型的研究結(jié)果顯示，Eno在念珠菌感染過程中誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體具有保護(hù)作用。重組Eno或Eno近N端14個(gè)氨基酸多肽免疫后的小鼠對致死性念珠菌血流感染具有抵抗力，其腎臟、肝臟、脾臟、腦等器官真菌載量下降，小鼠生存期延長。在對實(shí)驗(yàn)小鼠實(shí)施致死劑量白念珠菌的靜脈注射前，被動(dòng)轉(zhuǎn)移抗Eno- IgG抗體、抗Eno單抗或Eno免疫后動(dòng)物血清，觀察到實(shí)驗(yàn)小鼠臟器真菌載量明顯降低甚至完全清除，可顯著提高小鼠生存率[4，7，10]?？赡苡捎谘芯克捎玫男∈笃废怠啄钪榫腥揪旰兔庖叻桨覆煌?，盡管有研究認(rèn)為Eno對IC的保護(hù)效果為中等，但Eno仍被認(rèn)為是一個(gè)有潛力的疫苗分子。

Li等[7]發(fā)現(xiàn)Eno- IgG通過抗體介導(dǎo)的調(diào)理作用促進(jìn)吞噬細(xì)胞清除和中性粒細(xì)胞對白念珠菌的殺傷實(shí)現(xiàn)保護(hù)作用。Montagnoli等[4]用重組Eno聯(lián)合IL- 12佐劑免疫B細(xì)胞缺陷的BALB/c b- /b- 小鼠，在這種不能產(chǎn)生抗體的小鼠品系中也觀察到了與野生型小鼠類似的保護(hù)作用，他們進(jìn)一步用Eno或熱滅活的白念珠菌刺激Eno免疫后小鼠CD4+T細(xì)胞，檢測到細(xì)胞培養(yǎng)上清中Th1型細(xì)胞因子IFN- γ和IL- 2分泌增多，因此他們認(rèn)為Eno的保護(hù)作用是通過細(xì)胞免疫功能發(fā)揮的。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Eno對IC的保護(hù)作用機(jī)制可以通過體液免疫和細(xì)胞免疫作用單獨(dú)或共同實(shí)現(xiàn)。

在某種抗原刺激下，機(jī)體內(nèi)針對該抗原的特異性T淋巴細(xì)胞克隆會(huì)發(fā)生活化和擴(kuò)增，ELISPOT 技術(shù)可通過檢測活化后抗原特異性T淋巴細(xì)胞所分泌的特定細(xì)胞因子，直觀地反映T細(xì)胞的免疫反應(yīng)類型，并具有較高的靈敏度及特異度，可彌補(bǔ)ELISA檢測血清或培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的含量時(shí)，易受其半衰期、代謝等因素的影響，且無法精確估算分泌細(xì)胞因子的T細(xì)胞數(shù)量的缺點(diǎn)。本研究證實(shí)，在健康人群中普遍存在白念珠菌Eno抗原特異性T淋巴細(xì)胞克隆，白念珠菌Eno在健康人群中可引起細(xì)胞免疫應(yīng)答，細(xì)胞免疫應(yīng)答類型以Th1型和Th17型為主，幾乎不引起Th2型應(yīng)答。

在機(jī)體抵御白念珠菌感染中，由Th1和Th17細(xì)胞亞群介導(dǎo)細(xì)胞免疫發(fā)揮了重要的保護(hù)性作用[13]。Th1細(xì)胞亞群通過分泌IFN- γ，IL- 2，IL- 12和TNF- β等細(xì)胞因子，促進(jìn)中性粒細(xì)胞和吞噬細(xì)胞募集和激活，發(fā)揮吞噬和清除念珠菌的活性；Th17細(xì)胞亞群可以分泌IL- 17A，通過募集中性粒細(xì)胞至感染部位和上調(diào)抗微生物多肽表達(dá)發(fā)揮抗念珠菌活性；Th2細(xì)胞亞群分泌IL- 4，IL- 5和IL- 10等細(xì)胞因子，可抑制Th1細(xì)胞和吞噬細(xì)胞活性，誘導(dǎo)吞噬細(xì)胞的不完全吞噬，降低對念珠菌的抵抗力；還可通過上調(diào)精氨酸酶1活性，降低具有抗真菌活性的NO水平[2，14]，此外Th2細(xì)胞應(yīng)答還與病理免疫應(yīng)答相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)Eno刺激后，健康受試者PBMC中IFN- γ和IL- 17A的應(yīng)答率和SFC頻數(shù)均顯著高于IL- 4(P均=0)，84%(21/25)的受試對象PBMC同時(shí)產(chǎn)生Th1型和Th17型細(xì)胞免疫應(yīng)答，12%(3/25)的研究對象僅產(chǎn)生Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答，1例受試者(4%，1/25)同時(shí)產(chǎn)生Th1，Th2和Th17型三種細(xì)胞免疫應(yīng)答，未觀察到單獨(dú)產(chǎn)生Th2型或Th17型細(xì)胞免疫應(yīng)答者。其中Eno刺激后產(chǎn)生強(qiáng)IFN- γ應(yīng)答(SFC≥20)的健康人占40.00%(10/25)，無人產(chǎn)生強(qiáng)IL- 17A和IL- 4應(yīng)答。說明白念珠菌Eno引起機(jī)體PBMC產(chǎn)生的細(xì)胞免疫應(yīng)答以保護(hù)性的Th1型和Th17型應(yīng)答為主，幾乎不引起對IC易感的Th2應(yīng)答。結(jié)合以往白念珠菌Eno引發(fā)強(qiáng)烈的體液免疫應(yīng)答研究結(jié)果，我們認(rèn)為Eno暴露于機(jī)體免疫系統(tǒng)后，既可以產(chǎn)生保護(hù)性的體液免疫應(yīng)答，也可以產(chǎn)生保護(hù)性的細(xì)胞免疫應(yīng)答，提示Eno是一個(gè)理想的IC疫苗分子。

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