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    克老素抑制地塞米松誘導(dǎo)的MC3T3-E1成骨細(xì)胞凋亡

    2018-04-12 06:44:03李寶善馬厚勛
    中國藥理學(xué)通報(bào) 2018年4期
    關(guān)鍵詞:骨細(xì)胞成骨細(xì)胞存活率

    黃 倩,李寶善,梁 霄,劉 丹,馬厚勛

    (1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年病科,重慶 400016;2. 重慶市急救醫(yī)療中心老年病科,重慶 400014)

    地塞米松(dexamethasone, DEX)等糖皮質(zhì)激素作為臨床上極為常用的抗炎藥、免疫抑制藥,廣泛用于諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、慢性阻塞性肺疾病等疾病的治療。大劑量或者長期低劑量的使用糖皮質(zhì)激素可能導(dǎo)致多種骨相關(guān)性不良反應(yīng),包括骨質(zhì)疏松和骨壞死,該效應(yīng)具有劑量與時(shí)間依賴性。盡管糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)性骨質(zhì)疏松已經(jīng)成為臨床上最常見的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松,然而就其治療干預(yù)性研究仍需做深入探討[1-2]。已有研究表明,糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)性骨質(zhì)疏松及其并發(fā)骨折的原因在于糖皮質(zhì)激素使成骨細(xì)胞數(shù)量減少,其具體機(jī)制是抑制成骨細(xì)胞形成,促使其凋亡[3]。

    克老素(Klotho, KL)基因及其表達(dá)與人類包括骨質(zhì)疏松在內(nèi)的數(shù)種衰老表型關(guān)系極為緊密[5]。本課題組前期就攜帶KL基因的腺相關(guān)病毒感染骨質(zhì)疏松模型大鼠進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究,發(fā)現(xiàn)大鼠骨質(zhì)疏松病情及其骨微結(jié)構(gòu)的破壞可通過上調(diào)KL表達(dá)得以緩解[4];同時(shí),通過上調(diào)大鼠原代成骨細(xì)胞的KL基因表達(dá)水平的體外實(shí)驗(yàn)研究,發(fā)現(xiàn)KL可以增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性[6]。而有關(guān)人類KL基因研究結(jié)果還證實(shí),在老年人群中,血漿KL濃度較低人群更易致骨量丟失,這與骨礦物質(zhì)密度降低致使骨折風(fēng)險(xiǎn)增加密切相關(guān)[7]。盡管已有研究證實(shí)KL基因表達(dá)調(diào)節(jié)在原發(fā)性骨質(zhì)疏松的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了極其重要作用,但有關(guān)KL基因表達(dá)在以糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)性骨質(zhì)疏松為代表的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松發(fā)生、發(fā)展中的分子生物學(xué)機(jī)制研究報(bào)道甚少。為此,本研究通過轉(zhuǎn)染攜帶KL基因的重組腺病毒(recombination adenovirus containing KL gene, Ad-KL)于MC3T3-E1成骨細(xì)胞,并構(gòu)建DEX誘導(dǎo)性骨質(zhì)疏松的細(xì)胞模型,探究KL表達(dá)上調(diào)對MC3T3-E1成骨細(xì)胞凋亡的影響,為糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)性骨質(zhì)疏松的預(yù)防及治療提供新的依據(jù)及基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1細(xì)胞與試劑MC3T3-E1細(xì)胞購自上海和元生物。DEX(5 g·L-1)購自重慶太極集團(tuán)西南藥業(yè),相對分子質(zhì)量516.41,批次:170109;帶綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因的重組腺病毒(recombination adenovirus containing GFP gene, Ad-GFP)及Ad-KL購自上海吉?jiǎng)P公司;qPCR相關(guān)試劑均購自大連TaKaRa公司;Cell Counting Kit-8(CCK-8)分析試劑盒買于日本同仁研究所;ɑ-MEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司;胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自德國PAN公司;青霉素-鏈霉素(雙抗)溶液、0.25%胰酶、配膠試劑盒等購自碧云天公司;兔抗鼠KL多克隆抗體購自英國Abcam;兔抗鼠Bcl-2抗體購自美國CST;兔抗鼠caspase-9抗體購自博奧森生物;辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG、兔抗鼠Bax抗體購自武漢三鷹生物;兔抗鼠GAPDH購于杭州賢至生物;山羊抗兔IgG熒光二抗購自美國Abbkine公司。

    1.1.2儀器CFX96實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國Bio-Rad公司),倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司),低溫高速離心機(jī)(美國Sigma公司),熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司),流式細(xì)胞儀FACSVantage (美國BD公司),全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)。

    1.2細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、DEX濃度篩選與分組

    1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染MC3T3-E1成骨細(xì)胞于37℃、5% CO2的環(huán)境下培養(yǎng)于α-MEM完全培養(yǎng)基中。按每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板。待細(xì)胞緊密貼壁后,按感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)=60、80、100、120分別加入Ad-KL和Ad-GFP,各組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。24 h后,常規(guī)培養(yǎng)基替代含病毒液的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24、48 h的形態(tài)學(xué)特征。200倍物鏡下各孔隨機(jī)取3個(gè)視野,分別于綠光及白光下數(shù)同一視野下表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù),并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率,取均值。轉(zhuǎn)染效率=綠色熒光細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。按照以上方法篩選出轉(zhuǎn)染最適的MOI值。

    1.2.2誘導(dǎo)MC3T3-E1凋亡的DEX濃度篩選將MC3T3-E1成骨細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種于96孔板,每孔加入100 μL培養(yǎng)基。次日,更換至含所需濃度DEX的培養(yǎng)基,分別將濃度為0.125、0.25、0.5、1、2、4 mmol·L-1的DEX加入孔內(nèi),培養(yǎng)48 h后,每孔加入CCK-8液10 μL,于原培養(yǎng)環(huán)境下孵育1~1.5 h后分析吸光度。

    1.2.3實(shí)驗(yàn)分組依據(jù)研究需要,設(shè)立5個(gè)實(shí)驗(yàn)組:對照組(Control組)、DEX誘導(dǎo)組(DEX組)、Ad-KL轉(zhuǎn)染組(KL組)、Ad-KL轉(zhuǎn)染DEX誘導(dǎo)組(KL+DEX組)、Ad-GFP轉(zhuǎn)染DEX誘導(dǎo)組(GFP+DEX組)。本研究以每瓶5×105個(gè)細(xì)胞的密度將細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶內(nèi),待細(xì)胞貼壁后,按如下順序開展實(shí)驗(yàn):(1)根據(jù)MOI =100的濃度,分別計(jì)算出每孔需加入的Ad-KL和Ad-GFP病毒液的量。各組細(xì)胞換液后,按每瓶1 mL加入培養(yǎng)基,KL組、KL+DEX組添加計(jì)算劑量的Ad-KL病毒液,GFP+DEX組添加Ad-GFP病毒液轉(zhuǎn)染24 h;(2)按每瓶2 mL的劑量更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h;(3)更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 d,此時(shí),使用含優(yōu)化濃度DEX的培養(yǎng)基培養(yǎng)DEX組、KL+DEX組、GFP+DEX組成骨細(xì)胞。

    1.3CCK-8法檢測細(xì)胞存活率依據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求,將Control組、DEX組、KL組、KL+DEX組、GFP+DEX組的細(xì)胞分別培養(yǎng)于96孔板,按照設(shè)計(jì)方案的相應(yīng)處理方法處理細(xì)胞,細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)測定其相對存活率。細(xì)胞相對存活率計(jì)算參見文獻(xiàn)[8]。

    1.4qPCR檢測各組細(xì)胞KL、Bcl-2、BaxmRNA的表達(dá)依據(jù)前述處理方法建立各組,開展以下實(shí)驗(yàn)。參考試劑盒的詳細(xì)說明,根據(jù)研究需要提取處理組MC3T3-E1成骨細(xì)胞的總RNA、逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并進(jìn)行cDNA擴(kuò)增。擴(kuò)增樣本為10 μL體系。擴(kuò)增條件均為:95℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s,60℃退火30 s,50個(gè)循環(huán);65℃ 5 s,95℃ 50 s終止。以GAPDH為內(nèi)參,計(jì)算KL、Bcl-2和Bax mRNA的相對表達(dá)量。小鼠KL上游引物為5′-GTTGGGTCACTGGGTCAATC-3′,下游引物為5′- TCATCGTACAGATGCCAAGC-3′;小鼠Bcl-2上游引物為5′-CCACCTGTGGTCCATCTGAC-3′,下游引物為5′-GGTGCAGCTGACTGGACATC-3′;Bax上游引物為5′-CTGAGCTGACCTTGGAGCAG-3′,下游引物為5′-CCACGTCAGCAATCATCCTC-3′;內(nèi)參基因GAPDH上游引物為5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′,下游引物為5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3′。

    1.5Westernblot檢測細(xì)胞中KL、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)各研究組細(xì)胞按前述方式培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品加樣,SDS-PAGE電泳,將蛋白條帶轉(zhuǎn)到PVDF膜上,250 mA電流轉(zhuǎn)膜30 min,5%脫脂奶封閉2 h,4℃孵育一抗過夜,復(fù)溫、漂洗一抗,然后37℃下孵育二抗,ECL發(fā)光試劑顯影,分析各組KL、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況。

    1.6免疫熒光分析caspase-9熒光蛋白的表達(dá)以每孔5×103個(gè)的密度將成骨細(xì)胞接種于96孔板內(nèi),按照每孔100 μL的量加入培養(yǎng)基,各研究組細(xì)胞均采取前述干預(yù)方式。免疫熒光檢測具體操作方法如下:PBS洗3次,多聚甲醛固定細(xì)胞15 min,按每孔100 μL加入Triton破膜10 min,接著PBS洗4次(輕拍孔板),甩干孔板,加入適量山羊血清(孔底鋪滿即可)于37℃封閉1 h;吸去封閉液并甩干孔板,按每孔40 μL加入兔抗鼠caspase-9抗體(1 ∶100稀釋),4℃過夜;37℃復(fù)溫30 min,PBS洗4次;以下步驟均要求暗室內(nèi)操作,稀釋山羊抗兔熒光二抗(1 ∶200)、DAPI(1 ∶100),按每孔50 μL加入二抗,37℃孵育1 h;吸凈液體,PBS洗4次,滴加DAPI 50 μL作用10 min;PBS洗4次,甩干孔板,加入抗淬滅劑,鋪滿孔底即可。在熒光倒置顯微鏡下觀察研究組細(xì)胞熒光強(qiáng)弱及熒光顯示部位,依據(jù)檢測熒光強(qiáng)度反映其caspase-9熒光蛋白的表達(dá)水平。

    1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率各研究組細(xì)胞按前述分組操作結(jié)束后,均進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)操作:(1)收集瓶內(nèi)培養(yǎng)基,PBS清洗1次;(2)消化收集細(xì)胞,以1 500 r·min-1離心5 min;(3)預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次,棄上清。根據(jù)Annexin V-PE/ 7-AAD雙染細(xì)胞凋亡試劑盒的指示做相應(yīng)處理后,上機(jī)檢測各組細(xì)胞凋亡率。

    2 結(jié)果

    2.1DEX對MC3T3-E1成骨細(xì)胞存活率的影響不同DEX濃度處理細(xì)胞后,其存活率隨著DEX濃度的遞增而呈現(xiàn)出遞減的趨勢。當(dāng)DEX濃度為0.5 mmol· L-1時(shí),存活細(xì)胞數(shù)目明顯降低(P<0.01)。當(dāng)DEX濃度增至2 mmol·L-1時(shí),導(dǎo)致40%~60%細(xì)胞死亡,故本實(shí)驗(yàn)選取該濃度值做后續(xù)研究的DEX濃度標(biāo)準(zhǔn)(Fig 1)。

    Fig 1 Effect of different concentrations of DEX on MC3T3-E1 cell viability

    **P<0.01vsDEX 0 mmol·L-1

    2.2重組腺病毒感染細(xì)胞情況及細(xì)胞形態(tài)特征病毒感染細(xì)胞24 h后可見少量熒光表達(dá),48 h后,熒光強(qiáng)度隨MOI值增加而增強(qiáng);在MOI=100時(shí),Ad-GFP和Ad-KL轉(zhuǎn)染效率分別為92.9%、94.7%,且細(xì)胞狀態(tài)良好(Fig 2)。

    Fig 2 Transfection efficiency of Ad-GFP and Ad-KL in MC3T3-E1 cells and cell morphology(× 200)

    2.3各組細(xì)胞KLmRNA和蛋白表達(dá)情況qPCR和Western blot法分別檢測各研究組細(xì)胞KL mRNA和蛋白的表達(dá)情況。Fig 3結(jié)果顯示,KL轉(zhuǎn)染組與KL+DEX組細(xì)胞KL mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.01),Control組、DEX組與GFP+DEX組細(xì)胞也有少量KL mRNA表達(dá);KL組和KL+DEX組細(xì)胞有明顯的KL蛋白表達(dá)(P<0.01),其余各組細(xì)胞未檢測出KL蛋白表達(dá)。提示重組KL腺病毒成功感染了MC3T3-E1成骨細(xì)胞,并且其攜帶的KL基因在MC3T3-E1成骨細(xì)胞內(nèi)明顯表達(dá)KL蛋白。

    2.4各組細(xì)胞的存活率情況各研究組細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后分析其存活率,F(xiàn)ig 4結(jié)果顯示,KL組成骨細(xì)胞細(xì)胞存活率與Control組細(xì)胞相當(dāng),DEX組其成骨細(xì)胞存活率較Control組明顯降低(P<0.01);KL+DEX組存活率較DEX組、GFP+DEX組均明顯升高(P<0.01),而對比DEX組,GFP+DEX組成骨細(xì)胞存活率差異無顯著性。

    2.5各組細(xì)胞凋亡率Fig 5結(jié)果顯示,與Control組對比,DEX組凋亡率明顯升高(P<0.01),KL組與Control組相當(dāng);與DEX組、GFP+DEX組對比,KL+DEX組凋亡率均明顯降低(P<0.01),而相比于DEX組,GFP+DEX組凋亡率差異無顯著性。

    2.6各組細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白BaxmRNA、蛋白的表達(dá)情況Fig 6結(jié)果顯示,與Control組相比,KL組成骨細(xì)胞Bcl-2 mRNA和蛋白水平明顯增加(P<0.01),Bax mRNA和蛋白水平均明顯降低(P<0.01);DEX處理組成骨細(xì)胞Bcl-2 mRNA和蛋白水平均明顯降低(P<0.01),Bax mRNA和蛋白水平均明顯增加(P<0.01)。與DEX處理組對比,KL+DEX組成骨細(xì)胞表達(dá)Bcl-2 mRNA和蛋白水平增高(P<0.01),而Bax mRNA和蛋白水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與GFP+DEX組相比,KL+DEX組成骨細(xì)胞Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.01),而Bax mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.01)。研究還發(fā)現(xiàn),對比DEX組,GFP+DEX組表達(dá)Bcl-2、Bax mRNA和蛋白無明顯差異。

    Fig 3 Expression of KL mRNA(A) and protein(B) detected by qPCR and Western blot

    **P<0.01vscontrol

    Fig 4 Cell viability in different groups

    **P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDEX;▲▲P<0.01vsKL+DEX

    Fig 5 Apoptotic rate of MC3T3-E1 cells in different groups detected by flow cytometry

    A: Control; B: DEX; C: KL; D: KL+DEX; E: GFP+DEX; F: Apoptosis rate.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDEX;▲▲P<0.01vsKL+DEX

    Fig 6 Expression of Bcl-2 and Bax mRNA(A) and protein(B) detected by qPCR and Western blot

    **P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDEX;▲▲P<0.01vsKL+DEX

    2.7各組細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白caspase-9的熒光表達(dá)情況各研究組細(xì)胞采用免疫熒光法處理后,倒置熒光顯微鏡下觀察促凋亡蛋白caspase-9在細(xì)胞內(nèi)的熒光表達(dá)情況。Fig 7結(jié)果顯示,成骨細(xì)胞質(zhì)中充滿紅色熒光,提示蛋白表達(dá)于胞質(zhì)內(nèi)。與Control組相比,DEX組成骨細(xì)胞促凋亡蛋白caspase-9熒光表達(dá)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(P<0.01),而KL組成骨細(xì)胞促凋亡蛋白caspase-9熒光表達(dá)強(qiáng)度較Control組降低,但差異無顯著性;與DEX組對比,KL+DEX組成骨細(xì)胞caspase-9熒光表達(dá)強(qiáng)度顯著性降低(P<0.01);相比于GFP+DEX組,KL+DEX組成骨細(xì)胞caspase-9熒光表達(dá)強(qiáng)度也顯著性降低(P<0.01),而DEX組成骨細(xì)胞caspase-9熒光表達(dá)強(qiáng)度并無差異。

    Fig 7 Caspasee-9 protein expression detected using immunofluorescence(×200)

    A: Control; B: DEX; C:KL; D:KL+DEX; E:GFP+DEX; F:Fluorescence level of caspase-9 protein.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDEX;▲▲P<0.01vsKL+DEX

    3 討論

    近年來,糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)性骨質(zhì)疏松作為使用糖皮質(zhì)激素所帶來的最嚴(yán)重的副反應(yīng)之一,已引起臨床研究者的高度重視。研究表明,致使糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)性骨質(zhì)疏松發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制主要包括:① 通過增強(qiáng)caspase家族成員的促凋亡活性,促進(jìn)成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的凋亡,致使骨強(qiáng)度和骨質(zhì)量減低[3];② 通過影響Wnt信號(hào)通路[9]、減少骨形成蛋白的表達(dá)[10]等途徑,抑制成骨細(xì)胞分化并促進(jìn)其凋亡,從而降低骨質(zhì)量;③ 通過減少破骨細(xì)胞自身凋亡,最終致使骨質(zhì)量減少[11]。研究表明糖皮質(zhì)激素對破骨細(xì)胞的影響,其機(jī)制可能與其延長破骨細(xì)胞壽命的同時(shí)還降低了其細(xì)胞活性,進(jìn)而影響骨的重吸收過程有關(guān)。除此之外,糖皮質(zhì)激素還參與鈣在小腸和腎小管內(nèi)的重吸收過程的調(diào)節(jié),進(jìn)而對骨代謝過程形成干擾[3]。

    KL基因作為衰老抑制基因,自1997年Kuro-o等研究發(fā)現(xiàn)以來,已得到廣泛關(guān)注并進(jìn)行了深入研究。研究發(fā)現(xiàn)KL基因其主要表達(dá)在腎臟、血液、腦脊液等組織器官內(nèi),其通過跨膜蛋白和分泌蛋白兩種形式發(fā)揮其生物學(xué)作用[5]。KL除其抗衰老外,還抑制氧化應(yīng)激、Wnt信號(hào)通路和insulin/IGF-1信號(hào)通路,促使FoxO轉(zhuǎn)錄因子激活,誘導(dǎo)血管生成,以及通過調(diào)節(jié)骨礦物質(zhì)來干擾鈣磷代謝過程[12],提示KL與骨質(zhì)疏松的發(fā)生、發(fā)展緊密相關(guān)。

    研究表明,長期使用糖皮質(zhì)激素是醫(yī)源性骨質(zhì)疏松最常見的病因,與其相關(guān)性骨折發(fā)生率也相應(yīng)增加了30%-50%[13]。流行病學(xué)證據(jù)表明,KL基因多態(tài)性與骨鈣素、骨礦物質(zhì)密度、骨質(zhì)疏松等緊密相關(guān)。KL表達(dá)的蛋白主要以分泌型蛋白和跨膜蛋白兩種形式存在,其中分泌型蛋白作為一種激素,主要通過血液、組織液作用于組織器官;而KL表達(dá)的跨膜蛋白被證實(shí)為內(nèi)源性成纖維細(xì)胞生長因子23(fibroblast growth factor 23, FGF23)發(fā)揮功能的重要媒介,與成纖維細(xì)胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor, FGFR)結(jié)合,共同調(diào)節(jié)FGF23信號(hào)通路,進(jìn)而發(fā)揮骨代謝調(diào)節(jié)效應(yīng)[14]。鑒于糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)性骨質(zhì)疏松已引起臨床醫(yī)療工作者的高度重視,而KL基因表達(dá)調(diào)節(jié)與骨質(zhì)疏松發(fā)生、發(fā)展緊密相關(guān),因而探討KL基因表達(dá)調(diào)節(jié)在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)性骨質(zhì)疏松中的作用具有十分重要的臨床價(jià)值。

    凋亡是細(xì)胞在炎癥和損傷性環(huán)境中,細(xì)胞內(nèi)組件發(fā)生分解的程序性死亡過程??沟蛲龅鞍譈cl-2通過與促凋亡蛋白Bax結(jié)合,阻斷其分子同源二聚化過程來發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)。與之相反,Bax同源二聚化后,誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C,隨后活化促凋亡蛋白caspase家族成員蛋白酶,從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序[3]。研究證實(shí),caspase家族成員中,caspase-3、6、7、8、9參與調(diào)控哺乳動(dòng)物內(nèi)細(xì)胞程序性死亡過程,其中由caspase-8、9啟動(dòng)凋亡程序,caspase-3、6、7執(zhí)行凋亡過程[15]。

    本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),DEX組相比于Control組成骨細(xì)胞存活率明顯降低,而凋亡率明顯增加;KL+DEX組相比于DEX組存活率明顯增加,而凋亡率明顯降低;此外,相比于GFP+DEX組,KL+DEX組存活率也增加,其細(xì)胞凋亡率也明顯降低;提示KL基因轉(zhuǎn)染發(fā)揮了抗DEX誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),KL+DEX組其成骨細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)較DEX組明顯增加,而促凋亡蛋白Bax的mRNA和蛋白表達(dá)較DEX組明顯降低,同時(shí)還發(fā)現(xiàn)KL+DEX組其成骨細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白caspase-9也較DEX組明顯降低,提示KL基因表達(dá)上調(diào)可能增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)或促進(jìn)其生物學(xué)功能,其抗凋亡效應(yīng)可能通過影響B(tài)cl-2與Bax的結(jié)合過程實(shí)現(xiàn);也可能抑制促凋亡蛋白Bax的表達(dá),或者直接通過影響B(tài)ax的同源二聚化過程或下調(diào)Bax的活性,從而減少下游caspase-9等凋亡啟動(dòng)蛋白的活化來發(fā)揮其抗凋亡效應(yīng)。另外,KL也可能直接通過減少促凋亡蛋白caspase-9的表達(dá),抑制其啟動(dòng)凋亡程序,最終產(chǎn)生抑制細(xì)胞凋亡的作用,然而KL具體通過何種機(jī)制來調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax、caspase-9的表達(dá)尚需要進(jìn)一步研究。

    綜上,DEX可能通過減少抗凋亡蛋白Bcl-2、增加促凋亡蛋白Bax和caspase-9的表達(dá),啟動(dòng)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的凋亡程序,誘發(fā)細(xì)胞凋亡。本研究證實(shí)KL蛋白發(fā)揮了抵抗DEX誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的效應(yīng),其機(jī)制可能是通過上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2,與抑制促凋亡蛋白Bax、caspase-9表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的,這為糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松的研究、預(yù)防及治療提供了一個(gè)新的參考方向。已有研究證實(shí),DEX還通過影響Wnt通路而誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡[9],而KL參與調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路[12],推測KL也可能通過調(diào)控Wnt信號(hào)通路來抑制DEX誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡過程,但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

    (致謝:本實(shí)驗(yàn)完成于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心,感謝研究中心鄧曉娟老師的悉心指導(dǎo)!)

    參考文獻(xiàn):

    [1]劉洋, 陳珺, 翟玉瑩, 等. 阿魏酸鈉治療糖皮質(zhì)性骨質(zhì)疏松的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國藥理學(xué)通報(bào), 2016,32(3):394-8.

    [1]Liu Y, Chen J, Zhai Y Y, et al. Effect of sodium ferulate on glucocorticoid-induced osteoporosis[J].ChinPharmacolBull, 2016,32(3):394-8.

    [2]Lin H, Gao X, Chen G, et al. Indole-3-carbinol as inhibitors of glucocorticoid-induced apoptosis inosteoblastic cells through blocking ROS-mediated Nrf2 pathway[J].BiochemBiophysResCommun, 2015,460(2):422-7.

    [3]Liu Y, Porta A, Peng X, et al. Prevention of glucocorticoid-induced apoptosis in osteocytes and osteoblasts by calbindin-D28k[J].JBoneMinerRes, 2004,19(3):479-90.

    [4]王艷嬌, 馬厚勛, 李寶善, 等. 腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的Klotho基因表達(dá)對去勢大鼠骨Runx2及MMP-13表達(dá)的影響[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2012,32(5):487-92.

    [4]Wang Y J, Ma H X, Li B S, et al. Effects of adeno-associated virus-mediated klotho gene delivery on the expression of Runx2 and MMP-13 gene in the bone of the ovariectomy rats[J].BasicMedSciClin, 2012,32(5):487-92.

    [5]Kuro-o M, Matsumura Y, Aizawa H, et al. Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing[J].Nature, 1997,390(6655):45-51.

    [6]楊秋晨, 馬厚勛, 李運(yùn)奎, 等. 體外轉(zhuǎn)染Klotho基因?qū)υ晒羌?xì)胞活性的影響[J]. 中國老年醫(yī)學(xué)雜志, 2015,35(7):1866-9.

    [6]Yang Q C, Ma H X, Li Y K, et al. The effect of Klotho gene transfection on the vitality of primary osteoblasts[J].ChinJGeriatr, 2015,35(7):1866-9.

    [7]Chalhoub D, Marques E, Meirelles O, et al. Association of serum Klotho with Loss of bone mineral density and fracture risk in older adults[J].JAmGeriatrSoc, 2016,64(12):e304-8.

    [8]呂峰, 王偉, 艾麥提·牙森, 等. MicroRNA-155在肝細(xì)胞癌對索拉非尼抗藥中的作用研究[J]. 中國藥理學(xué)通報(bào), 2017,33(5):657-62.

    [8]Lyu F, Wang W, Ai Mai Ti·Y S, et al. Effect of microRNA-155 on sorafenib resistance in hepatocellular carcinoma[J].ChinPharmacolBull, 2017,33(5):657-62.

    [9]Yun S I, Yoon H Y, Jeong S Y, et al. Glucocorticoid induces apoptosis of osteoblast cells through the activation of glycogen synthase kinase 3beta[J].JBoneMinerMetab, 2009,27(2):140-8.

    [10] Pereira R C, Delany A M, Canalis E. Effects of cortisol and bone morphogenetic protein-2 on stromal cell differentiation: correlation with CCAAT-enhancer binding protein expression[J].Bone, 2002,30(5):685-91.

    [11] den Uyl D, Bultink I E, Lems W F. Glucocorticoid-induced osteoporosis[J].ClinExpRheumatol, 2011,29(5 Suppl 68):S93-8.

    [12] Buendía P, Ramírez R, Aljama P, et al. Klotho prevents translocation of NF-κB[J].VitamHorm, 2016,101:119-50.

    [13] Briot K, Roux C. Glucocorticoid-induced osteoporosis[J].RMDOpen, 2015,1(1):e000014.

    [14] Zhang W, Xue D, Hu D, et al. Secreted klotho protein attenuates osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cellsinvitrovia inactivation of the FGFR1/ERK signaling pathway[J].GrowthFactors, 2015,33(5-6):356-65.

    [15] McIlwain D R, Berger T, Mak T W. Caspase functions in cell death and disease[J].ColdSpringHarbPerspectBiol, 2013,5(4): a008656.

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