TGF-β/Smads信號(hào)通路在姜黃素改善糖尿病大鼠心肌纖維化中的作用

沈　豪，郭　霜，劉秀芬，鮑翠玉，徐　魁,

(湖北科技學(xué)院 1. 糖尿病心腦血管病變湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、2. 臨床醫(yī)學(xué)院內(nèi)科學(xué)教研室，湖北 咸寧　437100)

糖尿病心肌病(diabetic cardio myopathy，DCM)是在糖尿病情況下所導(dǎo)致的一種心臟并發(fā)癥。其中心肌結(jié)構(gòu)的異常變化主要表現(xiàn)在心肌肥大、凋亡和心肌間質(zhì)纖維化，其中心肌間質(zhì)纖維化是DCM主要的病理特征。研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)已被公認(rèn)與器官纖維化密切相關(guān)的因子[1]。而Smads蛋白是細(xì)胞內(nèi)TGF-β受體唯一的激酶底物，可介導(dǎo)下游細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)[2]，調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)的相關(guān)基因合成和轉(zhuǎn)錄，參與了心臟、腎臟等重要器官的組織纖維化的形成。轉(zhuǎn)化生長因子β Ⅲ型受體(type Ⅲ TGF-β receptor，TβR Ⅲ)是一種蛋白聚糖，一直以來被認(rèn)為是TGF-β超家族的輔助受體，研究表明，其既可以參與調(diào)控經(jīng)典的Smads信號(hào)通路，又可以調(diào)控其他信號(hào)通路，在纖維化、腫瘤、心血管系統(tǒng)等疾病中發(fā)揮重要作用，但其在糖尿病心肌纖維化中的研究甚少。姜黃素(curcumin，Cur)是從姜科植物根莖中提取的酚類姜黃色化合物。研究表明，Cur對2型糖尿病大鼠心肌病具有保護(hù)作用[3]。本研究通過建立體內(nèi)體外糖尿病心肌纖維化模型，探究Cur對糖尿病心肌纖維化的保護(hù)作用及可能的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物♂ Sprague-Dawley大鼠購于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物準(zhǔn)字號(hào)：SYXK(鄂)2013-0071，分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。

1.1.2藥品與試劑Cur、D-葡萄糖、TGF-β1抗體(Sigma公司)；CCK-8試劑盒(日本同仁)；天狼猩紅染液、熒光二抗、一抗稀釋液(武漢谷歌)；DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)；胎牛血清(Gibco公司)；Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ 抗體(Abcam公司)；p-Smad2、Smad2、p-Smad3、Smad3、TβR-Ⅲ、β-actin抗體(CST公司)。

1.1.3儀器超凈工作臺(tái)(蘇州安泰)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo)；熒光顯微鏡(日本奧林巴斯)；全波段多功能酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)；垂直電泳儀，電轉(zhuǎn)移槽(美國Bio-Rad公司)；自動(dòng)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(英國Syngene公司)。

1.1　方法

1.2.1糖尿病模型的制備Sprague Dawley大鼠，80只，♂，160～180 g，隨機(jī)分為正常對照組(Con，10只)、正常+Cur組(Cur 300 mg·kg·d-1，10只)和模型組(DM，60只)。Con和Cur組喂以正常飼料，DM組給予4周高糖高脂飼料喂養(yǎng)后，經(jīng)腹腔注射STZ(35 mg·kg-1，由pH 4.4的枸櫞酸鹽緩沖液配制)復(fù)制2型糖尿病模型，對照組給予等量的枸櫞酸鹽緩沖液。造模成功后(以隨機(jī)血糖≥16.7 mol·L-1作為模型成功標(biāo)準(zhǔn))，DM組隨機(jī)分為2組：DM組、DM+Cur組(DM+Cur 300 mg·kg·d-1)。其中，Cur由質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的羧甲基纖維素鈉配制。在實(shí)驗(yàn)過程中，大鼠自由進(jìn)食飲水，不使用其他藥物或胰島素進(jìn)行干預(yù)。給藥16周后，檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.2.2大鼠乳鼠心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts，CFs)原代提取培養(yǎng)新生Sprague Dawley大鼠(0～3 d)，♀♂不拘，體積分?jǐn)?shù)為0.75的乙醇消毒胸部后，迅速取出心臟，置于4℃ 預(yù)冷D-Hanks緩沖液中，剪成約1 mm3大小的組織碎塊，洗去污血，棄去上清。將心肌組織轉(zhuǎn)入安剖瓶中，加入5 mL 0.1%的Ⅱ型膠原酶，置于37℃水浴消化5～8 min，收集上清至含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)中終止消化，重復(fù)8～10次，直到心肌組織塊消化完全。收集每次消化完全的細(xì)胞懸液，1 000 r·min-1離心10 min，棄上清，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)皿中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～1.5 h后，棄上清，加入新鮮完全培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。待長至80%～90%融合度時(shí)，消化轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)所需的培養(yǎng)皿中或者凍存，本實(shí)驗(yàn)中使用第2～4代CFs。

1.2.3天狼猩紅染色各組心臟組織多聚甲醛固定以后，脫水，石蠟包埋，切片脫蠟至水，天狼猩紅染液染色5 min，無水乙醇稍洗后瀝干，脫水透明，中性黏合劑封片，于光鏡和偏振光顯微鏡下觀察。

1.2.4免疫熒光法石蠟包埋的心臟組織標(biāo)本連續(xù)切片，切片厚度4 μm，65℃烘干60 min，脫蠟，將切片放入沸騰的0.01 mol·L-1枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH 6.0)中加熱5 min，停3 min，反復(fù)3次后自然冷卻。PBS清洗，體積分?jǐn)?shù)為0.03的過氧化氫避光浸泡25 min，PBS清洗， 5%的BSA封片30 min，PBS清洗，加入Collange Ⅰ和Collagen Ⅲ 抗體(1 ∶200稀釋)，4℃過夜。PBS清洗，加入熒光二抗(1 ∶300稀釋)，避光，室溫靜置1 h，PBS清洗，脫水，中性樹膠封片，熒光顯微鏡下觀察切片。

1.2.5CCK-8法檢測細(xì)胞增殖①將CFs培養(yǎng)于96孔板中，無血清同步化以后，分別用不同濃度葡萄糖(5.5、20、25、30、35、50 mmol·L-1)誘導(dǎo)CFs 24 h，CCK-8試劑盒檢測各組細(xì)胞增殖情況確定最佳高糖造模濃度；②30 mmol·L-1高糖加不同濃度Cur(10、25、50、100、200 μmol·L-1)誘導(dǎo)CFs 24 h，CCK-8試劑盒檢測各組細(xì)胞增殖情況確定Cur最佳給藥濃度。

1.2.6Western blot高糖(30 mmol·L-1)和Cur(25 μmol·L-1)處理CFs 24 h后，棄去培養(yǎng)液，用4℃ 預(yù)冷PBS清洗2～3次。將培養(yǎng)皿置于冰上，每皿加入150 μL裂解液，細(xì)胞刮刀冰上收集細(xì)胞，轉(zhuǎn)至EP管中，冰上放置30 min繼續(xù)裂解。4℃、13 000 r·min-1離心20 min后，取上清液，按BCA法測定各組蛋白濃度。蛋白樣品與3×上樣緩沖液按體積比(2 ∶1)充分混勻后，95℃滅活5 min。樣本冰上冷卻后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，或者-20℃保存。加入按適當(dāng)比例稀釋的一抗，4℃搖床孵育過夜。用HRP標(biāo)記的二抗室溫下孵育1 h。用TBST 搖晃清洗后，采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影檢測條帶灰度值。

Fig 1　Sirius red staining for collagenA: Control; B: Cur; C: DM; D: DM+Cur

Fig 2　Immunofluorescence for CollagenⅠand Collagen Ⅲ

2　結(jié)果

2.1Cur對糖尿病大鼠心肌膠原沉積的影響顯微鏡下觀察顯示，膠原組織為紅色，心肌組織為黃色；對照組大鼠膠原纖維均勻纖細(xì)，DM組大鼠心肌間質(zhì)膠原纖維與對照組相比明顯增加，且分布雜亂；DM+Cur組較DM組間質(zhì)纖維化明顯減少，纖維較為均勻細(xì)薄(Fig 1)。

2.2Cur對糖尿病大鼠心肌組織CollagenⅠ和CollagenⅢ表達(dá)的影響免疫熒光檢測心肌組織切片發(fā)現(xiàn)，Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ主要分布在細(xì)胞外基質(zhì)。DM組大鼠心肌組織中CollagenⅠ和Collagen Ⅲ明顯增多。DM+Cur組較DM組間質(zhì)Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ有所減少(Fig 2)。

2.3不同濃度高糖對CFs增殖率的影響Fig 3的CCK-8結(jié)果表明，以對照組(葡萄糖5.5 mmol·L-1)細(xì)胞存活率為100%作為參照，高糖條件下，CFs的增殖率隨著高糖濃度(≤30 mmol·L-1)的升高而逐漸上升，而高糖濃度在50 mmol·L-1刺激后，CFs的增殖率明顯下降，部分細(xì)胞出現(xiàn)死亡。其中，30 mmol·L-1高糖刺激24 h后存活率最高，與對照組比較差異具有顯著性(P<0.05)。本研究選取的最佳高糖造模濃度是30 mmol·L-1。

Fig 3　Influence of high glucose on cell viability in cardiac fibroblasts(n=10)

*P<0.05vscontrol group

2.4不同濃度Cur對CFs增殖率的影響Fig 4的CCK-8結(jié)果表明，以對照組(葡萄糖5.5 mmol·L-1)細(xì)胞增殖率以100%作為參照，30 mmol·L-1高糖刺激24 h后存活率最高，與對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著Cur濃度的增大，CFs的存活率明顯下降。HG+Cur(10 μmol·L-1)刺激24 h后存活率開始下降，與HG組比較差異具有顯著性(P<0.05)。為了確定給藥的穩(wěn)定性，本研究選取的最佳Cur給藥濃度是25 μmol·L-1。

2.5Cur對高糖誘導(dǎo)的CFs內(nèi)TβRⅢ/TGF-β/Smads信號(hào)通路的影響為進(jìn)一步探討高糖誘導(dǎo)心肌纖維化的可能機(jī)制，我們研究與纖維化密切相關(guān)的蛋白。如Fig 5所示，CFs經(jīng)過高糖刺激24 h后，Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、TβR-Ⅲ明顯增多，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給予Cur后，以上各蛋白表達(dá)明顯減少，與HG組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Fig 4　Influence of curcumin on cell viability in cardiac fibroblasts(n=10)

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHG group

3　討論

DCM是一種獨(dú)立于高血壓和冠狀動(dòng)脈疾病的心肌病，其主要病理改變包括心肌膠原沉積、心肌肥厚及心肌間質(zhì)纖維化[4]。其中，心肌間質(zhì)纖維化可引起心臟舒張及收縮功能障礙，最終引起心臟結(jié)構(gòu)和功能的異常，是導(dǎo)致晚期糖尿病患者發(fā)生死亡的主要因素之一[5]。分布在心臟細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白主要有Collagen I、Collagen Ⅲ、Collagen Ⅳ、Collagen V型等，其中Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ占大部分。在生理情況下，心肌中的膠原蛋白處于不斷合成與降解的平衡狀態(tài)，這種狀態(tài)可以維持心臟結(jié)構(gòu)和功能的完整性和協(xié)調(diào)性，任何一種膠原蛋白改變都可能引起心肌功能的改變。本研究中糖尿病大鼠心肌和高糖誘導(dǎo)的CFs內(nèi)的Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ表達(dá)都增多，引起心肌間質(zhì)纖維化，和已知文獻(xiàn)[10]保持一致。

研究表明，TGF-β/Smads信號(hào)通路參與糖尿病心肌纖維化的發(fā)生與發(fā)展[6]。TGF-β1有3種廣泛分布在細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白，分別是Ⅰ型(TβR-Ⅰ)、Ⅱ型(TβR-Ⅱ)和Ⅲ型(TβR-Ⅲ)。其中TβR-Ⅲ是由二硫鍵鏈接的蛋白聚糖，含量最多，與TGF-β1結(jié)合后，可將TGF-β1傳遞給TβR-Ⅰ或者TβR-Ⅱ，但是TβR-Ⅲ本身無信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，主要與TGF-β的儲(chǔ)存有關(guān)[7]?；罨蟮腡βR-Ⅰ則調(diào)控下游Smad2/3磷酸化，然后與Smad4結(jié)合產(chǎn)物共同進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，刺激成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞從而導(dǎo)致器官纖維化的發(fā)生與發(fā)展[8-9]。

前期研究顯示，高糖刺激人心肌成纖維細(xì)胞(HCFs)24 h后，細(xì)胞內(nèi)Collagen I、Collagen Ⅲ、TGF-β1、p-Smad2/3、TβR-Ⅱ表達(dá)明顯增多[10]。本研究表明，在大鼠糖尿病心肌纖維化過程中，Collagen I和Collagen Ⅲ表達(dá)逐漸升高；高糖誘導(dǎo)24 h后的CFs，Collagen I、Collagen Ⅲ、TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3的表達(dá)也逐漸升高，給予Cur干預(yù)后，上述各蛋白均具有逐漸降低的趨勢。提示，在糖尿病心肌纖維化過程中，高糖可以激活TGF-β/Smads信號(hào)通路，膠原表達(dá)增加，促進(jìn)纖維化的過程，而Cur對糖尿病心肌纖維化具有保護(hù)作用。其中，TβR-Ⅲ的表達(dá)明顯增多，說明TβR-Ⅲ發(fā)揮受體作用，與TGF-β1結(jié)合后，將TGF-β1傳遞下去，激活TGF-β/Smads信號(hào)通路，而Cur則可以逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象，其具體機(jī)制，還需進(jìn)一步研究。總之，在CFs上，Cur可以通過減少TβR-Ⅲ的表達(dá)，阻斷高糖誘導(dǎo)的TGF-β/Smads信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而抑制CFs膠原的合成，減少心肌纖維化的發(fā)生。

綜上所述，Cur在體內(nèi)和體外均對糖尿病心肌纖維化具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制膠原的合成和TGF-β/Smads信號(hào)通路的傳導(dǎo)有關(guān)，本研究為開發(fā)新型抗糖尿病心肌纖維化的藥物的研究提供了新的理論基礎(chǔ)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在湖北科技學(xué)院糖尿病心腦血管病變湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝實(shí)驗(yàn)室的老師對本實(shí)驗(yàn)的幫助與指導(dǎo)。)

Fig 5　Influence of curcumin on expression of collagen Ⅰ, collagen Ⅲ, Smad2, Smad3 and TβRⅢ in cardiac fibroblasts (n=3)*P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs HG group

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