線粒體治療在線粒體相關(guān)疾病治療中的應(yīng)用及展望

張華菁，趙孟楠，付　琛，付愛玲

(西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶　400715)

線粒體是哺乳動物細胞內(nèi)重要的“工廠”，能生產(chǎn)ATP和多種生物合成中間體。同時，其作為細胞生理功能網(wǎng)絡(luò)中的一個重要節(jié)點，能參與到許多細胞生理生化過程中，如Ca2+穩(wěn)態(tài)、凋亡、胞內(nèi)信號傳導(dǎo)等。因此，線粒體功能障礙可以引發(fā)包括神經(jīng)退行性病變和代謝性疾病在內(nèi)的一系列疾病。通過保護和恢復(fù)線粒體的功能，可以使細胞恢復(fù)正常功能并延緩疾病進程[1]。然而，在線粒體疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，線粒體往往受到了不可逆的損傷，所以線粒體保護劑或穩(wěn)定劑的作用非常有限。此外，也有許多研究表明線粒體在腫瘤的形成與發(fā)生過程中具有十分重要的作用，針對線粒體治療癌癥也成為了目前的一個研究熱點。

目前，已有多個實驗室觀察到，線粒體可以在不同細胞間進行轉(zhuǎn)移，這種現(xiàn)象被命名為線粒體傳遞(mitochondrial transfer)[2]。同時，我們實驗室的研究結(jié)果以及許多文獻表明，分離純化的線粒體可快速、直接進入到哺乳動物細胞中，并在受體細胞內(nèi)正常地發(fā)揮自身的功能。這種向體內(nèi)外細胞中進行線粒體傳遞的方法，被稱為線粒體移植(mitochondrial transplantation)[3]。而使用線粒體作為治療藥物，通過移植線粒體以替換細胞內(nèi)原有的缺陷線粒體，從而恢復(fù)細胞內(nèi)正常的線粒體功能的方法，被稱為線粒體治療(mitotherapy)。該方法為線粒體相關(guān)疾病的治療提供了一條具有潛力的新途徑。

1　外源線粒體能夠直接進入體外培養(yǎng)的細胞

1982年，Clark等[4]從耐受氯霉素的細胞中，提取純化出含有抗氯霉素基因的線粒體，并將該線粒體與對氯霉素敏感的細胞共孵育2周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)原本對氯霉素敏感的細胞表現(xiàn)出了對氯霉素抗性。這證明外源線粒體能夠進入細胞并發(fā)揮作用。此外，該實驗還提示外源線粒體可能是通過內(nèi)吞作用進入細胞。令人遺憾的是，該實驗結(jié)果一直未能引起關(guān)注。直至2007年，Katrangi等[5]將小鼠肝臟線粒體與缺乏線粒體DNA的人非小細胞肺癌A549細胞(A549 ρ0 cells)共孵育，結(jié)果表明，異源的鼠線粒體可進入到線粒體缺陷的人細胞中，并且可以明顯恢復(fù)后者的呼吸功能。

盡管已經(jīng)觀察到了外源線粒體可直接進入細胞這一事實，但這種現(xiàn)象的可靠性依舊引起了很大爭議，甚至有部分文獻報道在共孵育過程中無法檢測到分離的線粒體進入細胞[6]。近年來，隨著顯微鏡觀測技術(shù)的進步和發(fā)展，已有多個實驗室報道能夠觀察到線粒體可直接、快速地進入體外培養(yǎng)的細胞。例如，Kitani等[7-8]通過紅色熒光蛋白DsRed和綠色熒光蛋白(green fluorescence protein, GFP)對線粒體進行熒光標(biāo)記，隨后將熒光標(biāo)記的線粒體與被破壞了線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)的細胞進行共孵育，結(jié)果表明線粒體可以被該細胞攝取并恢復(fù)細胞的活力，其作用可以持續(xù)數(shù)日。我們實驗室將從人肝癌細胞HepG2中提取的線粒體與人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞進行共孵育，結(jié)果證實HepG2線粒體可以進入SH-SY5Y細胞，見Fig 1[9]。以上結(jié)果均證實了外源線粒體可直接進入另一細胞。

Fig 1　Mitochondria entered SH-SY5Y cells

A: Exogenous mitochondria were pre-stained with Mitotracker Red CMXRos; B: Exogenous mitochondria were isolated from pCMV/mito/GFP-transduced HepG2 cells.

盡管如此，線粒體進入細胞的機制仍尚需進一步的確定。有研究認為，細胞通過向外伸展的細胞膜攝取外源線粒體，而這種攝取可被巨胞飲抑制劑阿米洛利所阻斷，網(wǎng)格蛋白抑制劑則對此沒有影響，提示線粒體可能是通過巨胞飲途徑進入細胞[10]。此外，線粒體結(jié)構(gòu)的完整性是決定線粒體是否被攝取的關(guān)鍵。如果線粒體外膜被破壞或者膜蛋白功能受損，線粒體則不能進入細胞。這就對線粒體的提取分離、純化過程有較高要求。我們實驗室的經(jīng)驗為線粒體的提取需要在低溫(0～4℃)、60 min內(nèi)完成；并且線粒體在放置時活力會快速下降，需現(xiàn)提現(xiàn)用。

2　不同細胞間線粒體的傳遞

健康細胞向其他細胞傳遞細胞器，可增加細胞間聯(lián)系、促進受體細胞生長和增殖。例如外體(exosome)在細胞間的傳遞促進了細胞間RNA和蛋白質(zhì)的交換，從而調(diào)節(jié)特定受體細胞中的分子信號[11]。目前，已有多個實驗室觀察到了線粒體在細胞間的傳遞，這使得人們對于細胞間的信息聯(lián)系以及細胞損傷恢復(fù)機制有了更深刻的認識。

Rustom等[12]研究了大鼠嗜鉻細胞瘤細胞(PC12)以及人胚胎腎細胞(HEK293)和正常大鼠腎細胞之間，通過隧道納米管(tunneling nanotubes, TNTs)進行的選擇性細胞器傳遞。TNTs主要由F-肌動蛋白構(gòu)成，并且各種細胞間的TNTs類似結(jié)構(gòu)有著不同的構(gòu)型，這表明其具有多種亞類結(jié)構(gòu)。同時，實驗也提示TNTs在細胞間是普遍存在的，它在細胞正常生理活動中具有重要的意義[13]。TNTs的發(fā)現(xiàn)改變了人們對細胞間線粒體的水平傳遞的認知，隨后的一系列研究均證明了線粒體的傳遞在動物體內(nèi)是屬于普遍事件，可出現(xiàn)于諸多生理病理狀態(tài)中[2]。

2.1干細胞中的線粒體向線粒體受損細胞的傳遞間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSC)是一種具有自我更新和分化能力的原型成體干細胞，其在組織間廣泛分布，參與體內(nèi)多種生理過程。近年來的研究顯示，MSC在組織再生等治療方面有著良好的前景[14]。

在MSC修復(fù)組織功能的研究中，有報道MSC還能通過傳遞線粒體的方式修復(fù)其他受損的細胞。例如，將小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(mouse bone mesenchymal stem cells，mBMSCs)和人間充質(zhì)干細胞(human bone mesenchymal stem cells, hBMSCs)分別通過氣道對小鼠進行滴注，使其進入由脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷模型的肺組織中[15]。在顯微鏡下可觀察到，mBMSCs和hBMSCs均能與肺上皮細胞形成間隙連接通道，線粒體由此進入受損的肺上皮細胞，從而明顯地消除肺部損傷。如果間隙連接通道無法形成，或者線粒體的功能不完整，MSCs則無法對肺損傷產(chǎn)生治療效果。

為驗證多功能干細胞衍生間充質(zhì)干細胞(human derived MSC，iPSC-MSCs)的線粒體傳遞效果，Zhang等[16]將iPSC-MSCs與蒽環(huán)霉素損傷的心肌細胞進行共培養(yǎng)，并以BMSCs作為實驗對照。結(jié)果表明，iPSC-MSCs在線粒體的傳遞方面要優(yōu)于BMSCs。進一步的研究顯示，其傳遞的優(yōu)越性是由于內(nèi)源性Rho GTPase 1(MIRO1)和TNF-αIP2高表達，后者使得iPSC-MSCs對于腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)誘導(dǎo)的TNTs的響應(yīng)更為靈敏，從而更易產(chǎn)生TNTs，利于線粒體進行傳遞的進行。

2.2腫瘤細胞間以及腫瘤細胞與正常細胞間的線粒體傳遞腫瘤是在不同因素的作用下，細胞生長失去控制，以至于產(chǎn)生異常增生而形成的疾病。而線粒體作為參與細胞生長的重要細胞器，在腫瘤的生長、侵襲等過程中有著一定的作用。目前，有很多關(guān)于線粒體在腫瘤的病理過程中的作用的假說，但腫瘤細胞線粒體的傳遞仍是一個充滿未知的領(lǐng)域。

Lu等[17]將2種不同的膀胱癌細胞RT4和T24進行共培養(yǎng)，觀測到了兩種細胞間TNTs的存在，見Fig 2。進一步的研究顯示，線粒體從T24到RT4細胞是自發(fā)的單向傳遞，并且遷移后的線粒體分布與RT4細胞中的原始線粒體一致，這意味著遷移的線粒體可能與原始線粒體進行了融合。他們還發(fā)現(xiàn)，受體膀胱癌細胞中的Akt和mTOR通路被激活，下游介質(zhì)數(shù)量增加，其侵襲能力在體內(nèi)和體外實驗中均被證明得到增強。Pasquier等[18]通過3D培養(yǎng)以及腫瘤外植體培養(yǎng)，證明TNTs會在多種癌細胞之間，以及基質(zhì)細胞和癌基質(zhì)細胞系之間產(chǎn)生。實驗結(jié)果表明，線粒體的交換會優(yōu)先在內(nèi)皮細胞和癌細胞之間發(fā)生。癌細胞獲得內(nèi)皮細胞傳遞的線粒體后，會具有更強的化學(xué)藥物耐受性。

Fig 2　Mitochondria transfer by TNTs.

A: Representation of TNTs-mediated mitochondria transfer; B: TNTs (black arrows)observed between T24 cells andRT4 cells; C: Spontaneous mitochondria trafficking from T24 cells to RT4 cells obtained by capturing “double positive” (red and green) RT4 cells under fluorescence microscopy.

2.3星形膠質(zhì)細胞的線粒體向神經(jīng)元細胞的傳遞線粒體傳遞的現(xiàn)象不僅存在于干細胞、癌細胞等細胞之間，現(xiàn)有證據(jù)表明神經(jīng)細胞間也存在著類似的現(xiàn)象。星形膠質(zhì)細胞是神經(jīng)膠質(zhì)細胞中的一種，具有引導(dǎo)神經(jīng)元移動、提供神經(jīng)元所需營養(yǎng)等重要功能。受損線粒體會從神經(jīng)元細胞向星形膠質(zhì)細胞進行傳遞，并在星形膠質(zhì)細胞中通過溶酶體自噬途徑降解[19]。

近期，Hayakawa等[20]發(fā)現(xiàn)小鼠星形膠質(zhì)細胞可以通過分泌囊泡，釋放功能性線粒體進入神經(jīng)元細胞。他們收集含有上述囊泡的培養(yǎng)基，并將囊泡中的線粒體用膜電位依賴性熒光染料(MitoTracker Red CMXRos)進行標(biāo)記。隨后，將該培養(yǎng)基與通過葡萄糖損傷的神經(jīng)元進行共培養(yǎng)。一段時間后，神經(jīng)細胞中可觀察到熒光顆粒，同時神經(jīng)元內(nèi)ATP等生物能量數(shù)值小幅增加。機制研究表明，該釋放過程是由鈣依賴性機制介導(dǎo)的，其中涉及到CD38和循環(huán)ADP核糖信號。小鼠的瞬時局灶性腦缺血可以誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞線粒體進入相鄰的神經(jīng)細胞，由此增強神經(jīng)細胞的存活信號。

3　線粒體治療在動物體內(nèi)的應(yīng)用

3.1局部注射或冠狀動脈灌注治療心肌缺血/再灌注由于心肌細胞特殊的生理功能，其胞內(nèi)線粒體的含量要高于其他細胞。心肌細胞缺血以及再灌注過程會對線粒體帶來嚴(yán)重的損傷，最終導(dǎo)致心肌細胞壞死[21]。將功能完整的線粒體移植入受損的心肌細胞，將為心肌缺血及再灌注損傷的治療提供新的方法。

近期臨床試驗報道，從患者自身肌肉組織中分離出的線粒體，能夠進行自體的線粒體治療[3,22]。由于心肌缺血在臨床上具有突發(fā)性，而普通的線粒體提取方法耗時偏長(60～90 min)。實驗人員重新設(shè)計了一種多次過濾單次離心的分離方案，使線粒體的提取能夠在30 min內(nèi)完成。隨后，立即將分離的線粒體局部注射入受損的心肌組織中，并監(jiān)測心肌細胞的改善情況。研究結(jié)果證明，自體線粒體治療可以增強細胞活力和心肌缺血后功能的恢復(fù)。并且，通過冠狀動脈進行線粒體灌注可以使線粒體在10 min內(nèi)迅速地分布整個心臟，從而可以更快地為缺血/再灌注損傷的心臟提供保護作用。這種自體線粒體治療的技術(shù)已經(jīng)在兒科患者體內(nèi)進行了臨床試驗[23]。報告顯示，治療后的患者沒有出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)，以及心律不齊、血腫等并發(fā)癥。在治療后的數(shù)日內(nèi)，患者心室功能均得到了有效的改善。這初步證明了該技術(shù)在臨床應(yīng)用的可行性。

3.2靜脈注射線粒體治療多器官的線粒體疾病外源線粒體通過靜脈給予小鼠后，可快速分布到小鼠多個組織器官，并且沒有明顯的不良反應(yīng)。這意味著線粒體治療可用于治療涉及多組織病變的線粒體相關(guān)疾病。

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一種常見的中老年神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病機制與線粒體功能障礙有著密切的聯(lián)系。將外源線粒體靜脈注射到PD模型小鼠中，動物行為學(xué)和生化指標(biāo)結(jié)果顯示，外源性線粒體能明顯改善PD模型小鼠的癥狀，其機制與增加電子傳遞鏈活性、降低活性氧自由基水平、阻止細胞凋亡和壞死等有關(guān)[8]。在非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)模型小鼠中，外源性線粒體可明顯消除肝臟脂質(zhì)淤積、降低血清轉(zhuǎn)氨酶活性和膽固醇水平、減輕NAFLD模型小鼠肝臟的氧化損傷，從而恢復(fù)肝細胞的正常功能，見Fig 3[24]。以上結(jié)果均表明，外源性線粒體在體內(nèi)對疾病具有治療應(yīng)用價值。

Fig 3　Mitotherapy for nonalcoholic fatty liver disease

Pathological changes of the liver tissues of the mice treated with high-fat diets and mitochondria. A: Liver tissues were stained with Oil Red O. The excessive accumulation of lipid droplets in mouse liver appeared after the mice were fed with high-fat diet. Mice in mitotherapy group 1 were intravenously injected mitochondria three times in 9 days (once in 3 days), while mice in mitotherapy group 2 received mitochondria six times in 18 days. Representative photomicrographs (×200). B: Ultrathin sections for mitochondrial observation under TEM. The red arrows pointed to normal mitochondria, while the blue one to the swelling mitochondria, and the yellow ones to the restored mitochondria.

4　線粒體治療的毒性和免疫反應(yīng)

適當(dāng)劑量的線粒體可發(fā)揮治療作用，但當(dāng)線粒體濃度過高時，則會產(chǎn)生細胞毒性。且受到損傷的線粒體沒有提高細胞活力的作用，例如，經(jīng)超聲和(或)凍融的破碎的線粒體對體外培養(yǎng)的細胞沒有任何影響；通過靜脈注射到小鼠體內(nèi)時，則會加重對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝損傷。

目前，已經(jīng)證明了從自身分離的線粒體靜脈注射到人體后，機體對自身的線粒體不產(chǎn)生免疫反應(yīng)[3]。例如，從患者自身分離的線粒體重新注射到患者體內(nèi)后，并不產(chǎn)生免疫反應(yīng)，血清中也沒有檢測到免疫相關(guān)的細胞因子水平的提高。已知線粒體在體內(nèi)產(chǎn)生自身抗體的主要原因，在于線粒體丙酮酸脫氫酶E2亞基、側(cè)鏈2含氧酸脫氫酶、2-含氧戊二酸脫氫酶的氧化修飾，最終造成機體產(chǎn)生自主免疫反應(yīng)。結(jié)構(gòu)和功能正常的同物種線粒體或跨物種的線粒體是否能對機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，尚需要實驗進行驗證。

5　總結(jié)與展望

目前的證據(jù)已證明，線粒體傳遞是普遍存在的現(xiàn)象?；蛟S該現(xiàn)象是線粒體在進化過程中形成的一種特殊的細胞間物質(zhì)和信息聯(lián)系模式。線粒體傳遞現(xiàn)象與多種生理病理現(xiàn)象息息相關(guān)，如腫瘤的形成與發(fā)展等。在不同的條件下，其傳遞的機制方法也各有不同。線粒體治療作為線粒體移植的治療應(yīng)用，具有廣闊的應(yīng)用前景。尤其在線粒體疾病的治療方面，由于臨床癥狀的多樣性，現(xiàn)階段還沒有有效的治療方案，但線粒體疾病的共同特征是線粒體受損而導(dǎo)致其功能障礙。線粒體治療能夠有效地替換或補充受損的線粒體，為細胞提供能量，并恢復(fù)正常的生理功能。這種把細胞器作為藥物的治療方法目前已在動物實驗和臨床試驗中得到了驗證，可能不久將會得到應(yīng)用的重視和進一步的推廣應(yīng)用。

參考文獻：

[1]付愛玲. 靶向哺乳動物細胞線粒體的核酸轉(zhuǎn)運[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2016,32(1):1-4.

[1]Fu A L. Targeting delivery nucleic acid into mammalian mitochondria[J].ChinPharmacolBull, 2016,32(1):1-4.

[2]Berridge M V, McConnell M J, Grasso C, et al. Horizontal transfer of mitochondria between mammalian cells: beyond co-culture approaches[J].CurrOpinGenetDev, 2016,38:75-82.

[3]McCully J D, Levitsky S, Del Nido P J, et al. Mitochondrial transplantation for therapeutic use[J].ClinTranslMed, 2016,5(1):16.

[4]Clark M A, Shay J W. Mitochondrial transformation of mammalian cells[J].Nature, 1982,295(5850):605-7.

[5]Katrangi E, D'Souza G, Boddapati S V, et al. Xenogenic transfer of isolated murine mitochondria into human rho0 cells can improve respiratory function[J].RejuvenationRes, 2007,10(4):561-70.

[6]Chang J C, Liu K H, Chuang C S, et al. Treatment of human cells derived from MERRF syndrome by peptide-mediated mitochondrial delivery[J].Cytotherapy, 2013,15(12):1580-96.

[7]Kitani T, Kami D, Matoba S, et al. Internalization of isolated functional mitochondria: involvement of macropinocytosis[J].JCellMolMed, 2014,18(8):1694-703.

[8]Kitani T, Kami D, Kawasaki T, et al. Direct human mitochondrial transfer: a novel concept based on the endosymbiotic theory[J].TransplantProc, 2014,46(4):1233-6.

[9]Shi X, Zhao M, Fu C, et al. Intravenous administration of mitochondria for treating experimental Parkinson's disease[J].Mitochondrion, 2017,34:91-100.

[10] Kesner E E, Saada-Reich A, Lorberboum-Galski H. Characteristics of mitochondrial transformation into human cells[J].SciRep, 2016,6:26057.

[11] Syn N, Wang L, Sethi G, et al. Exosome-mediated metastasis: from epithelial-mesenchymal transition to escape from immunosurveillance[J].TrendsPharmacolSci, 2016,37(7):606-17.

[12] Rustom A, Saffrich R, Markovic I, et al. Nanotubular highways for intercellular organelle transport[J].Science, 2004,303(5660):1007-10.

[13] Gerdes H H, Carvalho R N. Intercellular transfer mediated by tunneling nanotubes[J].CurrOpinCellBiol, 2008,20(4):470-5.

[14] Williams A R, Hare J M. Mesenchymal stem cells: biology, pathophysiology, translational findings, and therapeutic implications for cardiac disease[J].CircRes, 2011,109(8):923-40.

[15] Islam M N, Das S R, Emin M T, et al. Mitochondrial transfer from bone-marrow-derived stromal cells to pulmonary alveoli protects against acute lung injury[J].NatMed, 2012,18(5):759-65.

[16] Zhang Y, Yu Z, Jiang D, et al. iPSC-MSCs with high intrinsic MIRO1 and sensitivity to TNF-alpha yield efficacious mitochondrial transfer to rescue anthracycline-induced cardiomyopathy[J].StemCellRep, 2016,7(4):749-63.

[17] Lu J, Zheng X, Li F, et al. Tunneling nanotubes promote intercellular mitochondria transfer followed by increased invasiveness in bladder cancer cells[J].Oncotarget, 2017,8(9):15539-52.

[18] Pasquier J, Guerrouahen B S, Al Thawadi H, et al. Preferential transfer of mitochondria from endothelial to cancer cells through tunneling nanotubes modulates chemoresistance[J].JTranslMed, 2013,11:94.

[19] Davis C H, Kim K Y, Bushong E A, et al. Transcellular degradation of axonal mitochondria[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2014,111(26):9633-8.

[20] Hayakawa K, Esposito E, Wang X, et al. Transfer of mitochondria from astrocytes to neurons after stroke[J].Nature, 2016,535(7613):551-5.

[21] Honda H M, Korge P, Weiss J N. Mitochondria and ischemia/reperfusion injury[J].AnnNYAcadSci, 2005,1047:248-58.

[22] Cowan D B, Yao R, Akurathi V, et al. Intracoronary delivery of mitochondria to the ischemic heart for cardioprotection[J].PLoSOne, 2016,11(8):e0160889.

[23] Emani S M, Piekarski B L, Harrild D, et al. Autologous mitochondrial transplantation for dysfunction after ischemia-reperfusion injury[J].JThoracCardiovascSurg, 2017,154(1):286-9.

[24] Fu A, Shi X, Zhang H, et al. Mitotherapy for fatty liver by intravenous administration of exogenous mitochondria in male mice[J].FrontPharmacol, 2017,8:241.