EPCR對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移的影響及機(jī)制

徐炎炎,卓倩，湯洋洋，王慶苓

(徐州醫(yī)科大學(xué)，江蘇徐州 221004)

內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(EPCR)是一種血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的I型跨膜糖蛋白[1]。最初研究認(rèn)為EPCR主要定位于大血管的內(nèi)皮細(xì)胞上，在多數(shù)組織的微血管內(nèi)皮中表達(dá)極低或不存在，還特異性表達(dá)于人支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞。EPCR是蛋白C(PC)和活化蛋白C(APC)的細(xì)胞受體，EPCR能與PC特異性結(jié)合，使PC活化效率提高4～20倍，APC繼而活化蛋白酶激活受體1(PAR-1)，且APC與其輔因子蛋白S一起降解凝血因子Va和Ⅷa，從而干擾凝血酶產(chǎn)生并抑制凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)[1～7]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)EPCR在部分腫瘤組織及細(xì)胞中表達(dá)[8]。EPCR在腫瘤細(xì)胞中的作用復(fù)雜，大部分研究認(rèn)為EPCR促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，但亦有極少部分研究結(jié)果相反。另外EPCR在乳腺癌進(jìn)展中的作用尚未闡明。2016年9月，我們探討EPCR在乳腺癌MBA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移中的作用及分子機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1材料人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞所，DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自日本株式會(huì)社同仁化學(xué)，Transwell 小室購(gòu)自Millipore公司，Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑、opti-MEM和 EPCR siRNA片段GCACUCG-GUAUGAACUGCGGGAAU及無(wú)關(guān)序列對(duì)照購(gòu)自Invitrogen公司，RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天公司， 鼠抗人EPCR單克隆抗體、兔抗人GAPDH單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司，兔抗人Erk1/2單克隆抗體、兔抗人p-Erk1/2單克隆抗體、兔抗人AKT、兔抗人p-AKT(S473)、兔抗人p-AKT(T308)購(gòu)自Cell signaling，辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG隆抗體、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG隆抗體購(gòu)自中杉金橋公司。抗未裂解型PAR-1抗體委托Abgent Biotechnology公司設(shè)計(jì)并制備。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及抗體阻斷處理 用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加2 mL細(xì)胞懸浮液培養(yǎng)過(guò)夜。將MDA-MB-231分為EPCR轉(zhuǎn)染組、無(wú)關(guān)序列轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組，每組3個(gè)孔。分別加入5 μL/孔EPCR-siRNA、5 μL/孔 siRNA-NC、5 μL/孔空脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h，更換細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間。同樣，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加2 mL細(xì)胞懸浮液培養(yǎng)過(guò)夜。將MDA-MB-231分為抗體處理組與對(duì)照組，每組3個(gè)孔。一組加入10 μg Anti-PAR1 抗體，一組為空白對(duì)照組。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，更換細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間。

1.3細(xì)胞中PAR-1蛋白表達(dá)檢測(cè)采用Western blotting法。提取各組細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入抗體EPCR(1∶1 000)、PAR-1(1∶1 000)、p-Erk1/2(1∶2 000)、p-Erk1/2(1∶2 000)、Akt(1∶1 500)、p-Akt(1∶1 000)、GAPDH(1∶10 000)，4 ℃過(guò)夜。二抗室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)目的條帶，并采用Image J圖像分析系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行分析。

1.4細(xì)胞增殖能力檢測(cè)將成功轉(zhuǎn)染或抗體處理24 h后的細(xì)胞，調(diào)整濃度為3.0×103/mL。按每孔100 μL接種細(xì)胞懸液至96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，取出培養(yǎng)板，吸棄培養(yǎng)基，將DMEM和CCK-8按10∶1的比例預(yù)先混勻，每孔加入100 μL，另設(shè)一個(gè)空白對(duì)照孔，無(wú)細(xì)胞生長(zhǎng)孔，只加100 μL混合液，于37 ℃孵育2 h，酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)光密度值(OD值)。

1.5細(xì)胞遷移能力檢測(cè)將成功轉(zhuǎn)染或抗體處理24 h后的細(xì)胞，調(diào)整密度為1×104/孔，接種于Transwell小室的上室。每孔下室內(nèi)加入完全培養(yǎng)液600 μL，將其放于24孔板上，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室，甲醇固定30 min，晾干后于1%結(jié)晶紫染液染色25 min，PBS洗滌后用棉簽輕輕擦去上室細(xì)胞。倒置顯微鏡拍照計(jì)數(shù)(×200)，每個(gè)小室隨機(jī)取10個(gè)視野，計(jì)算穿至小室膜下的細(xì)胞數(shù)后統(tǒng)計(jì)分析。

1.6MDA-MB-231細(xì)胞表面未裂解活化的PAR-1檢測(cè)采用Cell-ELISA法。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加2 mL細(xì)胞懸浮液培養(yǎng)過(guò)夜。將MDA-MB-231分為EPCR轉(zhuǎn)染組、無(wú)關(guān)序列轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組。分別加入5 μL/孔EPCR-siRNA、5 μL/孔 siRNA-NC、5 μL/孔空脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、5 μL/孔凝血酶，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h，更換細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。調(diào)整細(xì)胞密度至3×104細(xì)胞/mL，將細(xì)胞接種于96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)過(guò)夜。PBS洗3次，4%多聚甲醛室溫固定10 mim。1%BSA室溫封閉1 h后加入一抗37 ℃孵育1 h。PBS洗3次，加入二抗室溫孵育1 h。加入TMB顯色液顯色20 min后加入終止液終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)OD值統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.7干擾EPCR表達(dá)或添加抗PAR-1抗體對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞Erk1/2和AKT 蛋白磷酸化水平的影響將無(wú)關(guān)序列和EPCR siRNA轉(zhuǎn)染，或用抗PAR-1抗體處理MDA-MB-231細(xì)胞，作用48 h后收集蛋白，然后采用Western blotting法分別檢測(cè)細(xì)胞中Erk1/2、p-AKT(S473)和p-AKT(T308)蛋白磷酸化情況。

2　結(jié)果

2.1干擾MDA-MB-231細(xì)胞中EPCR表達(dá)對(duì)PAR-1蛋白表達(dá)及活性的影響EPCR siRNA干擾MDA-MB-231細(xì)胞EPCR基因表達(dá)后，EPCR蛋白表達(dá)明顯降低，而細(xì)胞表面PAR-1的表達(dá)無(wú)明顯改變(圖1)。干擾EPCR表達(dá)后PAR-1的裂解活化受到抑制，空白對(duì)照組、對(duì)照組、抗體處理組細(xì)胞表面未裂解型PAR-1抗體結(jié)合率分別為0.98±0.069、0.54±0.066、1.79±0.175，抗體處理組細(xì)胞表面未裂解型PAR-1抗體結(jié)合率高于其他組(P均<0.05)。

圖1　　　　干擾EPCR表達(dá)后MDA-MB-231細(xì)胞中PAR-1蛋白表達(dá)

2.2干擾MDA-MB-231細(xì)胞EPCR表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖及遷移的影響 隨時(shí)間延長(zhǎng)，OD值逐漸增高；在48、72 h EPCR轉(zhuǎn)染組細(xì)胞OD450值(0.86±0.133、1.05±0.041)低于無(wú)關(guān)序列組(1.35±0.131、1.70±0.073)及空白對(duì)照組(1.37±0.045、1.69±0.054)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；而在相同時(shí)點(diǎn)內(nèi)無(wú)關(guān)序列轉(zhuǎn)染組與空白對(duì)照組相比，OD450值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)圖2。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EPCR轉(zhuǎn)染組穿過(guò)PET膜上8 μm小孔的細(xì)胞數(shù)量(71.4±10.986)較無(wú)關(guān)序列轉(zhuǎn)染組(202.50±11.316)與對(duì)照組(204.80±10.982)相比均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而無(wú)關(guān)序列轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3抗體阻斷PAR-1后對(duì) MDA-MB-231細(xì)胞增殖及遷移的影響在48、72 h PAR-1抗體處理組的細(xì)胞OD450值(0.39±0.021、0.81±0.101)低于對(duì)照組(0.49±0.015、1.08±0.081)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)圖3。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組(200.80±12.035)相比，抗PAR-1抗體處理組穿過(guò)PET膜上8 μm小孔的細(xì)胞數(shù)目(85.10±11.080)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2　　　　干擾MDA-MB-231細(xì)胞EPCR表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響

圖3　　　　抗體阻斷PAR-1后對(duì) MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響

2.4干擾EPCR表達(dá)或添加抗PAR-1抗體對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞Erk1/2和AKT 蛋白磷酸化水平的影響干擾EPCR表達(dá)后或PAR-1抗體處理后，MDA-MB-231細(xì)胞中p-AKT(s473)蛋白磷酸化水平分別為0.30±0.052、0.31±0.012，p-AKT(T308)蛋白磷酸化水平分別為0.39±0.064、0.43±0.052，均低于對(duì)照組(0.75±0.029、0.71±0.023；0.90±0.03、0.86±0.08)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而Erk1/2蛋白磷酸化水平分別為0.91±0.058、0.91±0.032；0.93±0.039、0.93±0.041，與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3　討論

惡性腫瘤的高致死率與腫瘤細(xì)胞的無(wú)限制生長(zhǎng)，凋亡抗性和重要臟器的轉(zhuǎn)移有關(guān)。因而研究如何抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和促進(jìn)凋亡將是治療腫瘤的一種新方法。以阻斷腫瘤細(xì)胞的增長(zhǎng)和遷移并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡為治療靶點(diǎn)，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。腫瘤的發(fā)生發(fā)展受多種因子的調(diào)控，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，深入研究腫瘤的發(fā)生機(jī)制可為臨床預(yù)防和治療腫瘤提供幫助。

EPCR是天然抗凝途徑的一個(gè)新成員蛋白，有諸多病理生理作用[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系，EPCR在多種惡性腫瘤細(xì)胞中呈不同水平表達(dá)，且與腫瘤預(yù)后有關(guān)。研究報(bào)道腫瘤細(xì)胞中EPCR介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)可促進(jìn)癌細(xì)胞遷移、侵襲和血管生成并抑制癌細(xì)胞凋亡[9,10]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沉默EPCR基因表達(dá)或阻斷EPCR-APC結(jié)合可減少肺癌細(xì)胞在靶器官的浸潤(rùn)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，干擾人乳腺癌細(xì)胞EPCR基因表達(dá)之后，細(xì)胞的增殖及遷移能力均降低。提示EPCR在乳腺癌中的表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移可能有關(guān)，與報(bào)道一致。然而，亦有相反的結(jié)論。如EPCR被發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌介導(dǎo)敗血癥的預(yù)防中發(fā)揮重要作用[11]。

蛋白酶活化受體1(PAR-1)是目前PAR家族中研究最多亦是最為重要的成員。研究報(bào)道，PAR-1促進(jìn)轉(zhuǎn)化和腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，與肺癌、胰腺癌的預(yù)后差有關(guān)[12,13]。另有研究報(bào)道PAR-1促進(jìn)胃癌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變并與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲相關(guān)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)干擾EPCR基因表達(dá)，可降低細(xì)胞表面PAR-1裂解活化水平，提示PAR-1的活性可受到EPCR表達(dá)改變的影響，且添加抗PAR-1抗體阻斷PAR-1作用可抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖及遷移，說(shuō)明PAR-1可促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖及遷移。

MAPK/ERK和PI3K/AKT通路是細(xì)胞內(nèi)重要的促增殖通路。Althawadi等[15]研究證實(shí)了在卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-3中，游離的APC與膜型EPCR結(jié)合可通過(guò)MEK-ERK和Rho-GTP酶途徑誘導(dǎo)細(xì)胞遷移。Nguyen等[16]曾報(bào)道，APC在EPCR介導(dǎo)下通過(guò)P13K的磷酸化激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶，從而啟動(dòng)有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的磷酸化，引起相應(yīng)的炎性因子及黏附分子表達(dá)上調(diào)。本研究干擾EPCR基因表達(dá)或添加抗PAR-1抗體阻斷PAR-1作用后，MDA-MB-231細(xì)胞中pAKT(s473)和pAKT(T308)磷酸化水平明顯降低，但Erk1/2磷酸化水平無(wú)明顯改變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示MDA-MB-231細(xì)胞中的EPCR和PAR-1可能通過(guò)活化人乳腺癌細(xì)胞的Erk1/2通路促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞的增殖及遷移。

綜上所述，EPCR可促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，其機(jī)制可能是通過(guò)激活PAR-1，從而激活A(yù)kt信號(hào)途徑。

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