LC-MS/MS法同時測定十一味益腎降糖片中馬錢苷和莫諾苷的含量

楊娜，劉豐林

(開封市中醫(yī)院，河南　開封　475001)

我國的糖尿病發(fā)病率高達9.7%，全國糖尿病人接近一億，并且有繼續(xù)增長的勢頭[1]。中醫(yī)藥在糖尿病的治療方面歷史悠久、療效顯著，其整體調(diào)節(jié)的作用有著化學藥無法比擬的優(yōu)勢[2-3]，在前人治療糖尿病的基礎上，依據(jù)辨證論治的原則，通過長期實驗篩選，開封市中醫(yī)院總結開發(fā)出十一味益腎降糖方，該方由黃芪、生地黃、白術、山茱萸、益母草、山藥等中藥組成，具有益氣健脾、補腎降糖、利水消腫之功能，方中黃芪、山藥補中益氣；生地黃、山茱萸止咳生津養(yǎng)陰。諸味藥合用，可發(fā)揮健脾益氣、清熱養(yǎng)陰之功能。在此方基礎上研制的十一味益腎降糖片，獲得河南省食品藥品監(jiān)督管理局院內(nèi)制劑批文(豫藥制字Z04020164)，在治療糖尿病、腎病方面具有較好療效[4]。

該方中山茱萸所含馬錢苷和莫諾苷是目前研究較多的藥效成分，具有廣泛的藥理活性。為了更加準確全面地控制十一味益腎降糖片的質(zhì)量，本文建立了一種簡單快速的LC-MS/MS法，用于同時測定十一味益腎降糖片中馬錢苷和莫諾苷的含量，為其質(zhì)量評價提供良好的依據(jù)。

1　儀器與試藥

1.1 儀器

Finnigan TSQ Quantum Discovery液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(美國Thermo公司)；BS110S Sartorius電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)；AS3120A 超聲清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；MICRO-17R高速低溫離心機(美國Thermo公司)；WH-2微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)。

1.2 試藥

十一味益腎降糖片開封市中醫(yī)院制劑室自制(批號分別為150630、160311、161218)；馬錢苷對照品、莫諾苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為111640-201606、111998-201501)；色譜純甲醇；乙腈(美國TEDIA天地試劑公司)；水為哇哈哈純凈水。

2　方法與結果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為Thermo Scientific Hypersil ODS色譜柱(50 mm ×2.1 mm，5 μm)；流動相為水-乙腈梯度洗脫，程序為0～0.50 min，5%～75%乙腈；0.50～2.00 min，75%～95%乙腈；2.00～2.01 min，95%～5%乙腈；2.01～3.50 min，5%乙腈；流速為0.35 mL·min-1；進樣體積為10 μL。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子化(ESI)電離源；掃描方式為選擇反應監(jiān)測(SRM)，正離子模式。噴霧電壓4500 V；加熱毛細管溫度(TEM)為270 ℃；鞘氣流速30 psi；輔助氣流速15 psi；碰撞氣(CID)壓力為1.0 mTorr；源內(nèi)碰撞解離電壓(Source CID)為10 V；馬錢苷與莫諾苷的檢測離子對分別選擇：m/z 413.1/219.1和m/z 428.9/267.0，碰撞電壓分別為：34、23 eV[5-7]。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱定馬錢苷和莫諾苷對照品適量，置容量瓶中，加入甲醇溶液溶解，并定容至刻度，分別配制成馬錢苷(1.0 mg·mL-1)和莫諾苷(1.0 mg·mL-1)的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取10片十一味益腎降糖片，研細，過三號篩，精密稱定藥片細粉1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 80%甲醇(v/v)，密塞，精密稱定，加熱回流1 h，放冷，再精密稱定重量，用80%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液用80%甲醇稀釋50倍，作為供試品溶液。

2.4 專屬性

取空白溶劑(80%甲醇)，混合對照品溶液和供試品溶液，按2.1項下色譜及質(zhì)譜條件進樣，得到典型色譜圖(見圖1)，馬錢苷出峰時間為1.74 min，莫諾苷出峰時間為1.65 min，雜質(zhì)在化合物出峰位置沒有干擾，證明方法的專屬性良好。

2.5 線性關系

將馬錢苷和莫諾苷對照品溶液按照1∶1的體積比例進行混合，得到馬錢苷和莫諾苷質(zhì)量濃度均為500 μg·mL-1的混合對照品溶液，再依次稀釋，得到馬錢苷和莫諾苷質(zhì)量濃度均為10、50、200、500、1000、2000 ng·mL-1的混合標準系列溶液。分別精密吸取混合標準系列溶液10 μL，按照2.1色譜及質(zhì)譜條件進樣測定，以被測化合物的峰面積為縱坐標(Y)，相應濃度為橫坐標(X)進行線性回歸，繪制標準曲線，并得到相應的線性相關系數(shù)。馬錢苷的線性回歸方程：Y=9.65×10-3X+3.72×10-1(r=0.998 2)，定量下限為10 ng·mL-1；莫諾苷的線性回歸方程：Y=3.18×10-3X+2.58×10-1(r=0.999 1)，定量下限為10 ng·mL-1。結果表明，馬錢苷和莫諾苷分別在10～2000 ng·mL-1濃度范圍和10～2000 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關系良好。

2.6 精密度試驗

取低、中、高3個濃度(10、500、2000 ng·mL-1)的混合對照品分別重復進樣5次，進樣量10 μL，按2.1項下色譜及質(zhì)譜條件進行測定，記錄峰面積。結果馬錢苷的RSD分別為2.93%、2.54%、2.72%；莫諾苷的RSD分別為3.05%、2.91%、2.47%，表明該方法精密度較好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一批號樣品，分別于0、3、6、12、24 h按2.1項下色譜及質(zhì)譜條件進行測定。結果馬錢苷和莫諾苷峰面積的RSD分別為2.33%、2.84%，結果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

注：A.莫諾苷；B.馬錢苷；Ⅰ.80%甲醇；Ⅱ.混合對照品；Ⅲ.供試品。圖1　典型色譜圖

2.8 重復性試驗

分別取同一批號樣品6份，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，測定供試品中馬錢苷和莫諾苷的含量。結果馬錢苷和莫諾苷峰面積的RSD分別為2.76%和3.12%，表明該方法重復性較好。

2.9 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的同一批樣品約0.5 g，分別精密加入馬錢苷對照品溶液(1.0 mg·mL-1)425 μL和莫諾苷對照品溶液(1.0 mg·mL-1)460 μL，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜及質(zhì)譜條件測定，計算回收率。結果見表1。

2.10 樣品測定

取3批十一味益腎降糖片，按2.3項下方法制備供試品溶液，分別進樣10 μL，并按2.1項下色譜及質(zhì)譜條件測定，計算各批十一味益腎降糖片中馬錢苷、莫諾苷的含量，結果見表2。

表1　十一味益腎降糖片中馬錢苷和莫諾苷的加樣回收率(n=6)

表2　十一味益腎降糖片中馬錢苷和莫諾苷的含量測定結果

3　討論

糖尿病是臨床常見的內(nèi)分泌代謝疾病，發(fā)病率僅次于腫瘤和心血管疾病。中醫(yī)藥是抗糖尿病藥物開發(fā)的重要來源。已經(jīng)有大量實驗研究了中藥或植物藥以及其有效成分對糖尿病及相關并發(fā)癥的治療作用[8]。隨著越來越多的抗糖尿病中藥的開發(fā)，對于其質(zhì)量控制的要求也越來越高，從而更好地確保中藥安全性、有效性和質(zhì)量穩(wěn)定性。薄層色譜法、HPLC法等已經(jīng)成為中藥質(zhì)量控制應用較為廣泛的方法，近年來，采用LC-MS/MS法作為中藥質(zhì)量控制的手段逐漸普及，該法更加快速、靈敏，具有更好的特異性。

通過優(yōu)化液相和質(zhì)譜參數(shù)，發(fā)現(xiàn)采用Thermo Scientific Hypersil ODS色譜柱(50 mm × 2.1 mm，5 μm)和以水-乙腈為流動相進行梯度洗脫，可以獲得合理的出峰時間、良好的峰形和分離度。質(zhì)譜檢測采用馬錢苷和莫諾苷的[M+Na]+峰，獲得了較為穩(wěn)定的質(zhì)譜響應。

本文采用了LC-MS/MS方法測定十一味益腎降糖片中的馬錢苷和莫諾苷含量，方法專屬性好，分析速度快，操作簡單，靈敏度高，為科學控制十一味益腎降糖片的質(zhì)量提供了重要的參考，為其臨床應用提供了有力的保障，并且為將來更加深入研究該方劑的體內(nèi)過程奠定了基礎。

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