基于HPLC指紋圖譜及多元功效成分定量分析的南五味子藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究△

馬新飛，郭盛，朱邵晴，朱振華，曹雅琦，王雪華，段金廒

(南京中醫(yī)藥大學(xué)　江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心/國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥資源循環(huán)利用重點(diǎn)研究室/中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇　南京　210023)

南五味子(Schisandrae Sphenantherae Fructus)為木蘭科多年生藤本植物華中五味子SchisandrasphenantheraRehd.et Wils.的干燥成熟果實(shí)，具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心之功效，主要用于久嗽虛喘、遺夢(mèng)滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、自汗、盜汗、津傷口渴、內(nèi)熱消渴及心悸失眠等癥的治療[1]。現(xiàn)代研究表明，南五味子中含有木脂素類、黃酮類、有機(jī)酸類、核苷類、氨基酸等多種類型化學(xué)成分[2-4]，其中木脂素類成分具有調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能、降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多重藥理作用，目前認(rèn)為是南五味子傳統(tǒng)功效發(fā)揮的主要效應(yīng)成分之一[5]。有關(guān)南五味子藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版僅以五味子酯甲作為質(zhì)量控制指標(biāo)[1]，這種傳統(tǒng)的單一指標(biāo)質(zhì)量控制模式，難以反映藥材的真實(shí)質(zhì)量。HPLC指紋圖譜因其蘊(yùn)含各色譜峰的出峰順序、保留時(shí)間、峰高、峰面積等綜合信息，已成為中藥整體性化學(xué)特征表征的有效方法，具有較好的專屬性和適用性[6-7]。本研究在參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，采用HPLC對(duì)不同產(chǎn)地12批次南五味子藥材進(jìn)行研究，初步建立了南五味子藥材的HPLC指紋圖譜，并在此基礎(chǔ)上建立同時(shí)測(cè)定五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子酚、安五脂素、五味子甲素含量的HPLC方法，以期為南五味子藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供參考。

1　儀器與試劑

1.1 儀器

Waters2695Alliance高效液相色譜系統(tǒng)、Waters2998PDA 檢測(cè)器、EmpowerTM 色譜工作站軟件(Waters公司)；BT125型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；Microfuge16 型臺(tái)式微量離心機(jī)(美國(guó)BeckmanCoulter公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑與樣品

乙腈(色譜純，美國(guó)Tedia公司)，甲酸(色譜純，德國(guó)Merck公司)，去離子水為經(jīng)Millipore超純水制備系統(tǒng)自制；其他化學(xué)試劑均為分析純。對(duì)照品五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子酚、安五脂素(四川省維克奇生物科技有限公司)，經(jīng)HPLC分析，純度≥98%。12批南五味子藥材收集于陜西、湖北、河南、山西，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)段金廒教授鑒定為華中五味子SchisandrasphenantheraRehd.et Wils.的干燥成熟果實(shí)，樣品信息見(jiàn)表1。

表1　南五味子藥材樣品信息

2　方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為AlltimaTMC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；流動(dòng)相：乙腈-0.1%甲酸水，按表2所示梯度程序洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。對(duì)照品色譜圖見(jiàn)圖1。

表2　南五味子中7個(gè)木脂素類成分含量測(cè)定的流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取各對(duì)照品適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成分別含五味子甲素0.101 1 mg·mL-1、五味子酯甲0.109 3 mg·mL-1、五味子酯乙0.106 4 mg·mL-1、五味子醇甲0.101 9 mg·mL-1、五味子醇乙0.104 5 mg·mL-1、安五脂素0.108 1 mg·mL-1、五味子酚0.104 2 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

注：1.五味子醇甲；2.五味子醇乙；3.五味子酯甲；4.五味子酯乙；5.五味子酚；6.安五脂素；7.五味子甲素。圖1　木脂素類混合對(duì)照品溶液HPLC圖

2.2.2 供試品溶液的制備取南五味子藥材適量，粉碎，過(guò)三號(hào)篩，取粉末約1.0 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，稱定重量，超聲處理20 min(250 W，40 kHz)，放冷，稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，0.45 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 HPLC指紋圖譜研究

2.3.1 精密度試驗(yàn)精密吸取同一供試品(S01)溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色圖譜，以20號(hào)峰(五味子酚)為參照峰，計(jì)算6次進(jìn)樣的各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD<0.5%，相對(duì)峰面積的RSD<2.5%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)取同一供試品(CD1)藥材粉末6份，精密稱定，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，以20號(hào)峰(五味子酚)為參照峰，計(jì)算6份樣品各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD<0.6%，相對(duì)峰面積的RSD<2.5%，表明該實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品(S01)溶液，室溫儲(chǔ)藏，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，以20號(hào)峰(五味子酚)為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD<1.0%，相對(duì)峰面積的RSD<2.5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定。

2.3.4 指紋圖譜共有模式的建立取不同來(lái)源的南五味子藥材粉末1.0 g，精密稱定，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄75 min色譜圖，采用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A)”進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，剪切5 min前的溶劑峰以及66 min后的雜質(zhì)峰，以S1為參照?qǐng)D譜，設(shè)定時(shí)間漂移值0.2，采用中位數(shù)法譜峰自動(dòng)匹配，生成南五味子藥材指紋圖譜共有模式(即對(duì)照?qǐng)D譜，見(jiàn)圖2)。將該對(duì)照?qǐng)D譜(R)的相似度值定為1，計(jì)算12批次不同產(chǎn)地南五味子藥材樣品指紋圖譜的相似度，結(jié)果顯示其相似度均大于0.93(見(jiàn)表3)，說(shuō)明相似度良好，見(jiàn)圖3。

注：10.五味子醇甲；11.五味子醇乙；17.五味子酯甲；18.五味子酯乙；20.五味子酚；22.安五脂素；24.五味子甲素。圖2　南五味子藥材指紋圖譜共有模式

圖3　不同產(chǎn)地南五味子藥材指紋圖譜

表3　12批不同產(chǎn)地南五味子藥材指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果

注：*圖譜序號(hào)同表1樣品編號(hào)。

2.3.5 共有指紋峰的標(biāo)定以12批南五味子藥材指紋圖譜與生成的對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行色譜峰匹配，以匹配數(shù)目達(dá)12者作為共有峰，結(jié)合對(duì)照品圖譜進(jìn)行指紋峰的標(biāo)定(見(jiàn)圖1)；以20號(hào)峰(五味子酚)為參照峰，計(jì)算共有峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示：12批南五味子藥材共有峰數(shù)目為28，經(jīng)計(jì)算，所有共有峰面積之和占總峰面積的80%以上；12批樣品色譜共有指紋峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均小于1.2%，相對(duì)峰面積的RSD值差異較大，表明樣品之間各共有峰組成差異顯著。

經(jīng)與對(duì)照品紫外光譜及保留時(shí)間比對(duì)，鑒定出峰10、11、17、18、20、22、24分別為五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子酚、安五脂素、五味子甲素。

2.4　7個(gè)木脂素類成分的測(cè)定

2.4.1 線性關(guān)系考察取對(duì)照品加甲醇配制并稀釋成系列不同濃度混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣10 μL，記錄各化合物峰面積。以各對(duì)照品質(zhì)量濃度(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程，見(jiàn)表4。

表4　南五味子中7個(gè)木脂素類成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.4.2 精密度試驗(yàn)取同一混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各化合物峰面積，考察儀器精密度，結(jié)果見(jiàn)表5。各化合物峰面積RSD值均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批次(S01)藥材粉末6份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄各化合物峰面積，計(jì)算6份樣品中7個(gè)成分含量的RSD值。結(jié)果見(jiàn)表5。各待測(cè)成分含量的RSD值均小于2.7%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)取2.4.3項(xiàng)下制備的供試品溶液1份，室溫儲(chǔ)藏，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別于0、1、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算峰面積的RSD值，考察供試品溶液的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表5，化合物峰面積的RSD值均小于3.0%，表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收試驗(yàn)取2.4.3項(xiàng)下已知含量的樣品(S01)粉末9份，每份0.5 g，精密稱定，分別精密加入對(duì)照品適量(加入量分別為基礎(chǔ)值的80%、100%、120%)，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各待測(cè)成分含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5　木脂素類成分的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果　%

2.4.6 樣品測(cè)定取不同產(chǎn)地南五味子藥材樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算樣品中各待測(cè)成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表6。南五味子藥材樣品中，以五味子甲素含量最高，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)7.889 mg·g-1，安五脂素、五味子酯甲含量其次，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5.128、4.944 mg·g-1，五味子醇甲、五味子醇乙含量相對(duì)較低；7個(gè)木脂素類成分平均總質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)22.09 mg·g-1；不同產(chǎn)地樣品間木脂素類成分差異較大，其中五味子醇甲含量差異最大，RSD值達(dá)86.41%；不同產(chǎn)地南五味子藥材中，河南洛陽(yáng)所產(chǎn)南五味子藥材含木脂素類成分總量最高，陜西商洛平均總量顯著低較低，山西運(yùn)城所產(chǎn)者最低。

3　討論

本研究在建立南五味子藥材指紋圖譜過(guò)程中，分別考察了樣品提取溶劑、流動(dòng)相等對(duì)色譜峰行為的影響，結(jié)果顯示以甲醇作為提取溶劑，目標(biāo)組分提取較為充分。因20號(hào)峰(五味子酚)峰面積較大，分離度較好、含量較高、對(duì)照品容易獲得，且色譜峰位于色譜圖中間位置，故以其作為參照峰。

表6　不同產(chǎn)地南五味子藥材中木脂素類成分的含量測(cè)定結(jié)果　mg·g-1

注：—表示未檢測(cè)到。

含量測(cè)定項(xiàng)分別選擇目前報(bào)道的與南五味子發(fā)揮傳統(tǒng)功效密切相關(guān)的7個(gè)木脂素類成分作為指標(biāo)性成分，可較為全面地反映南五味子藥材的內(nèi)在質(zhì)量[5]。含量測(cè)定結(jié)果顯示不同產(chǎn)地南五味子藥材中7個(gè)木脂素類成分含量的RSD值均大于20%，含量差異較大，提示在生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)作為重點(diǎn)指標(biāo)加以控制。

本研究所建立的南五味子藥材指紋圖譜相似度大于0.93，所建立的同時(shí)測(cè)定7個(gè)指標(biāo)的含量測(cè)定方法靈敏度高、專屬性強(qiáng)，二者結(jié)合可有效杜絕為達(dá)到某一質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)而人為添加某一成分的現(xiàn)象，為南五味子藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供了支撐。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：244.

[2]楊文潮，楊潔，段金廒，等.南五味子中氨基酸類成分分析評(píng)價(jià)[J].中藥材，2016，39(2)：342-347.

[3]楊潔，段金廒，李國(guó)龍，等.南五味子中核苷類成分分析評(píng)價(jià)[J].藥物分析雜志，2015，35(6)：966-973.

[4]楊潔，段金廒，李國(guó)龍，等.不同產(chǎn)地南五味子中木脂素分析研究[J].中國(guó)中藥雜志，2014，39(23)：4647-4652.

[5]胡竟一，白筱璐，雷玲，等.南五味子總木脂素的催眠作用及對(duì)腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響[J].中藥藥理與臨床，2016，32(2)：110-113.

[6]李強(qiáng)，杜思邈，張忠亮，等.中藥指紋圖譜技術(shù)進(jìn)展及未來(lái)發(fā)展方向展望[J].中草藥，2013，44(22)：3095-3104.

[7]王領(lǐng)弟，臧亞茹，潘偉東，等.基于指紋圖譜結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析評(píng)價(jià)山楂葉質(zhì)量差異性[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2017，19(12)：1692-1696.