青蒿琥酯對熱化療誘導(dǎo)人結(jié)腸上皮細胞損傷的保護機制研究

蔣師，張興強

(1.恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院 消化內(nèi)科，湖北　恩施　445000；2.恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院 放射科，湖北　恩施　445000)

胃腸道腫瘤術(shù)后常常會因為腹腔內(nèi)殘留游離的腫瘤細胞或殘留的微小癌灶導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)，而研究報道溫熱化療可以有效殺滅游離的腫瘤細胞或殘留的微小癌灶，可以有效預(yù)防復(fù)發(fā)和提高患者的生存率。然而溫熱化療在殺滅腫瘤細胞時，對周圍增生活躍正常的結(jié)腸上皮細胞也會帶來損害，臨床上主要表現(xiàn)為惡心、嘔吐和腹瀉等不良反應(yīng)[1]。研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生這些不良反應(yīng)的機制主要是溫熱化療可以激活p53向細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移，而引起結(jié)腸上皮細胞的凋亡[2-3]。前期研究報道p53抑制劑能夠有效抑制不同刺激因素對p53的激活作用，從而抑制正常細胞的損傷[4-5]。青蒿琥酯(Artesunate)是青蒿素的一種半合成衍生物，與青蒿素一樣對瘧疾的治療效果較顯著，而且還具有抗炎和抗細胞凋亡的作用[6]。因此，本實驗主要探討青蒿琥酯對熱化療誘導(dǎo)人結(jié)腸上皮細胞損傷的保護作用，并初步研究了青蒿琥酯對ERK/P53信號通路活化的影響。

1　材料及儀器

1.1 材料

青蒿琥酯(百靈威科技有限公司，批號：88495630，≥98%)；順鉑、二甲基亞砜和碘化丙啶(Sigma公司)；HIEC培養(yǎng)基(美國ScienCell公司)、抗細菌/真菌溶液(美國ScienCell公司)、IV型膠原酶溶液(美國Sigma公司)、I型膠原酶溶液(美國Sigma公司)、胰蛋白酶(美國Sigma公司)；CCK-8試劑盒(北京智杰方遠科技有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海谷歌生物有限公司，批號:P0012S-07)；Annexin V-FITC/PI試劑盒(北京嘉美紐諾生物科技有限公司)；Western Blot發(fā)光試劑盒、β-actin、ERK、p-ERK、p53和p-p53一抗(美國Cell Signaling Technology)，Bax、MDM2一抗(Abcam公司)。

1.2 儀器

單人超凈臺(北京六一儀器廠)；CB15C02細胞培養(yǎng)箱(北京六一儀器廠)；Victor3 1420 Multilable Counter酶標儀(美國BD，F(xiàn)ACS AriaIII)；HD-3000凝膠成像儀(上海上天精密儀器有限公司)；Millipore流式細胞儀(北京維欣儀奧科技發(fā)展有限公司)。

2　方法

2.1 原代人結(jié)腸上皮細胞分離培養(yǎng)

取結(jié)腸組織置于無菌培養(yǎng)皿中，加入抗細菌/真菌溶液清洗干凈，將組織剪成1mm3組織塊。將組織塊放入離心管中，用PBS反復(fù)吹打、洗滌5次。靜置30 min，棄去PBS，加入0.1% IV型膠原酶溶液+0.1% I型膠原酶溶液(1∶1)混合消化液，消化30 min。消化完畢，用吸管反復(fù)吹打5 min，靜置1 min，將上清液移至另一離心管中。重復(fù)上述步驟2～3次，收集上清液，1000 r·min-1離心5 min，棄上清液，加入培養(yǎng)基吹打，再1000 r·min-1離心5 min，重復(fù)上一步驟5～6次后加入培養(yǎng)液將細胞密度調(diào)節(jié)至4～5×104·mL-1，直接在培養(yǎng)瓶或板上種植。于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d換1次培養(yǎng)液，并在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)[7]。

2.2 分組及處理

取對數(shù)生長期的人結(jié)腸上皮細胞，加入胰酶消化、計數(shù)、重懸后，取適量細胞數(shù)的重懸液加入96孔板或6孔板中，分別用于后續(xù)的CCK8實驗和細胞凋亡檢測、Western Blot分析，待細胞貼壁生長至80%～90%左右時，將人結(jié)腸上皮細胞分為3組：即正常對照組(CON)、熱化療組(HTC，將順鉑溶解稀釋終質(zhì)量濃度為10 mg·L-1處理細胞，在43 ℃恒溫水浴箱中孵育30 min后，再用無菌的PBS溶液清洗細胞3次，加入培養(yǎng)基后將細胞繼續(xù)培養(yǎng)2 h)、熱化療+不同濃度青蒿琥酯組[HTC+Ar，青蒿琥酯用DMSO進行溶解，在熱化療作用前4 h用完全培養(yǎng)基將藥物濃度稀釋為0.1、0.2、0.4 mmol·L-1(此時DMSO濃度均低于1‰)加入細胞中，然后的處理過程同熱化療組，在熱化療處理結(jié)束后，用無菌的PBS溶液清洗細胞3次，加入含不同濃度青蒿琥酯的培養(yǎng)基后將細胞繼續(xù)培養(yǎng)2 h]。

2.3 CCK-8實驗

按2.2分組處理細胞后，棄舊培養(yǎng)基，每孔加入含10 μL CCK-8試劑的新鮮培養(yǎng)基100 μL，每組設(shè)置6個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)1 h后置于酶標儀中450 nm處測定吸光度(A)值，并按公式(1)計算細胞的相對存活率。

細胞存活率(%)=(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)

(1)

2.4 細胞凋亡檢測

按2.2分組處理細胞后，收集各組人結(jié)腸上皮細胞，與4 ℃、2000 r·min-1離心5 min后，用預(yù)冷的PBS重懸、離心，棄上清液后再次重懸離心，加Annexin V-FITC 溶液5 μL和PI溶液2.5 μL到100 μL細胞懸浮液中，混勻后避光反應(yīng)10 min，加150 μL樣品稀釋液到樣品中，混勻后上機檢測，然后利用美國B-DFACSort Cell Quest軟件做DNA分析，計算細胞凋亡率。

2.5 免疫印跡檢測

按2.2分組處理細胞后，收集各組人結(jié)腸上皮細胞，加入RIPA裂解液充分裂解細胞，BCA試劑檢測各組蛋白濃度，再加入蛋白上樣緩沖液，于100 ℃加熱煮沸10 min。每孔加入50 μg蛋白上樣，在12%的SDS-PAGE凝膠中電泳分離，濃縮膠電泳分離時電壓設(shè)置為70 V；分離膠電泳時電壓設(shè)置為120 V；分離完成后在275 mA電流轉(zhuǎn)膜70 min；再將NC膜用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；一抗孵育過夜后，再二抗常溫下孵育1 h，洗膜3次，顯色成像，然后采用Quantity One 4.6.2 analysis software軟件進行半定量分析。

2.6 統(tǒng)計分析

3　結(jié)果

3.1 青蒿琥酯對人結(jié)腸上皮細胞增殖的影響

青蒿琥酯對熱化療誘導(dǎo)人結(jié)腸上皮細胞增殖情況如圖1所示，熱化療組細胞增殖率顯著低于空白對照組(P<0.05)；而經(jīng)過低、中、高劑量青蒿琥酯處理后，細胞相對存活率顯著高于熱化療組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。隨著青蒿琥酯濃度上升，細胞增殖率顯著上升，說明青蒿琥酯呈濃度依賴性改善熱化療誘導(dǎo)人結(jié)腸上皮細胞的損傷。

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與熱化療組比較，#P<0.05；1.空白對照組；2.熱化療組；3.熱化療+0.1 mmol·L-1青蒿琥酯組；4.熱化療+0.2 mmol·L-1青蒿琥酯組；5.熱化療+0.4 mmol·L-1青蒿琥酯組；下同。圖1　青蒿琥酯對人結(jié)腸上皮細胞增殖的影響(n=6)

3.2 青蒿琥酯對熱化療誘導(dǎo)人結(jié)腸上皮細胞凋亡的影響

人結(jié)腸上皮細胞自然凋亡率為(2.47±0.51)%，熱化療損傷后細胞凋亡率達到(25.26±2.47)%，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。青蒿琥酯呈濃度依賴性抑制熱化療引起的人結(jié)腸上皮細胞凋亡，凋亡率由(19.65±2.04)%逐漸下降至(7.28±0.73)%，與熱化療組相比凋亡率之間的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，結(jié)果見表1、圖2。

表1　各組人結(jié)腸上皮細胞的凋亡率

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與熱化療組比較，#P<0.05。

注：A.空白對照組；B.熱化療組；C.熱化療+0.1 mmol·L-1青蒿琥酯組；D.熱化療+0.2 mmol·L-1青蒿琥酯組；E.熱化療+0.4 mmol·L-1青蒿琥酯組。圖2　各組代表性細胞凋亡檢測的流式細胞圖

3.3 青蒿琥酯對ERK/P53信號通路的影響

青蒿琥酯對人結(jié)腸上皮細胞中ERK/P53信號通路活化情況的影響如圖3所示。結(jié)果表明，熱化療組中p-ERK和p-P53表達水平顯著高于空白對照組(P<0.05)，說明熱化療可誘導(dǎo)ERK/P53信號通路活化。經(jīng)過低、中、高劑量青蒿琥酯作用后，p-ERK和p-P53表達水平顯著低于熱化療組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。隨著青蒿琥酯濃度上升，p-ERK和p-P53表達水平顯著降低，說明青蒿琥酯呈濃度依賴性影響熱化療誘導(dǎo)人結(jié)腸上皮細胞中ERK/P53信號通路活化。

注：A.蛋白表達條帶；B.ERK磷酸化水平；C.P53磷酸化水平。圖3　青蒿琥酯對人結(jié)腸上皮細胞ERK/P53信號通路活化的影響(n=3)

3.4 青蒿琥酯對促凋亡蛋白Bax和MDM2表達的影響

青蒿琥酯對人結(jié)腸上皮細胞中促凋亡蛋白Bax和MDM2表達情況的影響如圖4所示。結(jié)果表明，熱化療組中Bax和MDM2表達水平顯著高于空白對照組(P<0.05)。經(jīng)過低、中、高劑量青蒿琥酯作用后，Bax和MDM2表達水平顯著低于熱化療組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。隨著青蒿琥酯濃度上升，Bax和MDM2表達水平顯著降低，說明青蒿琥酯呈濃度依賴性抑制熱化療誘導(dǎo)人結(jié)腸上皮細胞中促凋亡蛋白的表達。

注：A.蛋白表達條帶；B.Bax表達水平；C.MDM2表達水平。圖4　青蒿琥酯對人結(jié)腸上皮細胞中Bax和MDM2蛋白表達的影響(n=3)

4　討論

前期研究報道ERK/P53信號通路的缺失或突變在較多腫瘤中均有出現(xiàn)，其中P53基因的缺失能夠引起基因的不穩(wěn)定性、腫瘤惡化加劇及機體對抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥等。一般報道P53的缺失也許是不利的，于是在惡性癌癥治療中更多的是恢復(fù)P53的功能。然而，P53的功能不僅僅體現(xiàn)在對腫瘤細胞的殺傷作用，同時P53在許多正常組織中也存在較高的表達，在抗腫瘤的治療過程中會對周圍的正常組織或器官帶來一定的損傷。因此，在前期較多研究中發(fā)現(xiàn)，腫瘤的化療、放療及腹腔溫熱灌注化療常常引起顯著的不良反應(yīng)，從而降低了抗腫瘤的作用效果，并且這種不良反應(yīng)的產(chǎn)生主要是P53介導(dǎo)的細胞凋亡所導(dǎo)致的[4-5]。

腹腔內(nèi)溫熱灌注化療是腹腔腫瘤擴散的有效治療方案，然而對增生活躍的正常組織也會同時造成傷害。順鉑是一種常見的抗腫瘤藥物，其作用機制是與DNA雙鏈結(jié)合形成交鏈，抑制DNA合成而引起細胞周期停滯和細胞凋亡的出現(xiàn)，而溫熱可促進細胞對順鉑的攝取，提升順鉑的抗腫瘤作用[8-10]。本研究利用原代人結(jié)腸上皮細胞為體外研究模型，采用順鉑聯(lián)合溫熱法處理細胞誘導(dǎo)、細胞凋亡的發(fā)生，P53蛋白活化程度明顯升高，其中促凋亡蛋白Bax和MDM2表達明顯上升。用青蒿琥酯預(yù)處理細胞后可降低ERK/P53信號通路的活化，進一步抑制促凋亡蛋白Bax和MDM2的表達，而使MDM2與P53結(jié)合減少，并抑制Bax啟動子上P53反應(yīng)元件，從而達到對人結(jié)腸上皮細胞的保護作用，改善細胞的相對存活率。

值得注意的是，一些研究報道青蒿琥酯能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡，其促凋亡作用機制研究也較為明確，主要包括降低線粒體跨膜電位、促進細胞內(nèi)凋亡物質(zhì)的釋放及誘導(dǎo)Caspase的激活、抑制NF-κB信號通路及抑制Cox-2的表達等方式來達到促凋亡的作用[11]。而本文中青蒿琥酯可以抑制熱化療誘導(dǎo)的人結(jié)腸上皮細胞凋亡，起著抗凋亡的作用，其作用機制可能與抑制ERK/P53信號通路活化和抑制促凋亡基因Bax及MDM2的表達有關(guān)，由此說明青蒿琥酯在不同細胞類型中可以通過不同的信號通路來達到不同的藥理作用效果。綜上所述，青蒿琥酯在細胞凋亡方面起著雙向調(diào)節(jié)作用，當青蒿琥酯作用促凋亡和抗凋亡信號通路時，若對促凋亡信號通路的作用強于抗凋亡通路，便會表現(xiàn)出促凋亡的作用效果，反之亦然。于是，青蒿琥酯可以打破促/抗凋亡通路的平衡，并且最終表現(xiàn)的作用效果與相關(guān)作用機理的強弱相關(guān)。

最后，本實驗在體外初步研究了不同濃度青蒿琥酯對熱化療引起的人結(jié)腸上皮細胞損傷的保護作用，實驗結(jié)果也證實了該藥物具有一定的保護效果，在后期會進一步進行動物實驗，探討該藥物對熱化療動物的保護作用，以期為減輕抗腫瘤不良反應(yīng)的臨床運用奠定基礎(chǔ)。

[1]張安平，劉寶華，張連陽，等.p53抑制劑對熱化療損傷結(jié)腸上皮細胞p53、Bax和MDM2表達的影響[J].消化外科，2006，5(5)：340-344.

[2]Van der Vange N，Van Goethem A R，Zoetmulder F A，et al.Extensive cytoreductive surgery combined with intra-operative intraperitoneal perfusion with cisplatin under hyperthermic conditions(OVH IPEC)in patients with recurrent ovarian cancer：a feasibility pilot[J].Eur J Surg Oncol，2015，26(7)：663-668.

[3]Shen P，Levine E A，Hall J，et al.Factors predicting survival after intraperitoneal hyperthermic chemotherapy with mitomycin C after cytoreductive surgery for patients with peritoneal carcinomatosis [J].Arch Surg，2013，138(1)：26-33.

[4]Komarov P G，Komarova E A，Ko ndratov R V，et al.A chemical inhibitor of p53 that protects mice from the side effects of cancer therapy[J].Science，2009，285(5434)：1733-1737.

[5]Komarova E A，Gudkov A V.Chemo protection from p53-dependent apoptosis：potential clinical applications of the p53 inhibitors[J].Biochem Pharmacol，2016，62(6)：657-667.

[6]胡玉貞，李淼，張桐桐，等.青蒿琥酯脂質(zhì)體粉霧劑的制備及其治療大鼠急性肺損傷的作用[J].藥學學報，2016，51(12)：1906-1912.

[7]張偉平，聶占國，代忠明，等.人結(jié)腸上皮細胞的原代培養(yǎng)[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2012，20(8)：1546-1548.

[8]Ryu K S，Kim J H，Ko H S，et al.Effects of intra peritonealhy per the rmic chemotherapy in ovarian cancer[J].Gynecol Oncol，2014，94(2)：325-332.

[9]Piso P，Dahlke M H，Loss M，et al.Cytoreductive surgery and hy perthermicintraperitoneal chemotherapy in peritoneal carcinomatosis from ovarian cancer[J].World J Surg Onco，2004，2(1)：21.

[10] Hall J J，Loggie B W，Shen P，et al.Cytoreductive surgery with intraperitoneal hyperthermic chemotherapy for advanced gastric cancer [J].J Gastrointest Surg，2004，8(4)：454-463.

[11] 李異興，李曦雯，農(nóng)曉琳.青蒿琥酯抗腫瘤作用機制與臨床應(yīng)用的研究進展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2016，28(12)：986-989.